專利名稱：適用于作物ssr分子標(biāo)記分析的基因組dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種適用于作物SSR分子標(biāo)記分析的基因組DNA提取方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的常規(guī)育種方法工作量大、育種周期長、效率低，消耗大量人力物力，難以滿足對選育優(yōu)良品種的要求。目前，利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行輔助育種已成為一種趨勢。許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，可以鑒別出純合基因型和雜合基因型，可提供較為完整的遺傳信息。 分子標(biāo)記技術(shù)直接以遺傳物質(zhì)DNA形式表現(xiàn)，不受物種的組織類別、發(fā)育階段等影響，不受季節(jié)、環(huán)境等限制。分子標(biāo)記輔助育種促使育種工作更便利，效率更高，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。植物基因組DNA提取是分子標(biāo)記技術(shù)操作的關(guān)鍵步驟之一。目前，常用的植物基因組DNA提取方法主要有CTAB法、SDS法和高鹽法及其改良方法；這些方法一般步驟為使用液氮或機(jī)械研磨材料，加入DNA提取緩沖液于65°C裂解細(xì)胞、釋放DNA，后經(jīng)酚、氯仿和異戊醇等抽提多糖類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)來純化DNA，之后使用無水乙醇或異丙醇沉淀DNA，最后晾干DNA和溶解DNA。操作過程較為繁瑣，耗時(shí)多，生產(chǎn)效率低，成本高。因此，尋找一種簡便、快速、能夠滿足SSR分子標(biāo)記技術(shù)要求的作物基因組DNA提取方法成為亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快速、高通量、成本低的適用于作物SSR分子標(biāo)記分析的基因組DNA提取方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種適用于作物SSR分子標(biāo)記分析的基因組DNA 提取方法，包括步驟1)向葉片中加入DNA提取緩沖液，蛋白酶K和核糖核酸酶，振蕩混勻；2)將上述混合體系置于 37°C，30min ；68°C，20min ；37°C，30min ；然后于 4°C保存；3)將步驟2~)中得到的混合體系快速轉(zhuǎn)置于冰上冰浴5-lOmin ；4)將步驟3)中得到的混合體系離心，得上清。前述的基因組DNA提取方法，步驟1)具體為向0.02 0. (Mcm2的葉片中加入 50 100 μ LDNA提取緩沖液，0. 2 0. 4 μ L的100mg/mL蛋白酶K禾口 1 2yL的10mg/mL 核糖核酸酶，振蕩混勻10 20sec ；其中，DNA提取緩沖液的成份為 10mmol/L Tris-HCl, lmmol/LEDTA, 0. 1% SDS, pH 值 8.0。優(yōu)選地，步驟1)為向0.02 0. (Mcm2的葉片中加入50μ L DNA提取緩沖液， 0. 2 μ L的100mg/mL蛋白酶K禾Π 1 μ L的10mg/mL核糖核酸酶，振蕩混勻IOsec。前述的基因組DNA提取方法，步驟2)為混合體系置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行反應(yīng)。前述的基因組DNA提取方法，步驟4)為4°C下3000 5000rpm離心10 15min，優(yōu)選地，4°C下3000rpm離心lOmin。前述的基因組DNA提取方法，所述作物為甘蔗、水稻、玉米、大豆或花生等。本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果(一 )本發(fā)明所述的基因組DNA提取方法不需要研磨樣品，無需抽提蛋白質(zhì)、沉淀 DNA、洗滌DNA和溶解DNA，所用的試劑少，提取成本低。( 二)本發(fā)明所述的DNA提取方法可使用96孔PCR板裝載反應(yīng)物，具備高通量特性，可在短時(shí)間內(nèi)完成大批量樣品DNA的提取。(三)本發(fā)明所述的DNA提取方法僅有4個(gè)操作步驟，簡單易行。(四)本發(fā)明所述的DNA提取方法為“單管制備DNA模板”，提取過程中不需要轉(zhuǎn)換存放基因組DNA的器皿，避免交叉污染，做到DNA模板質(zhì)量無污染。(五)本發(fā)明所述的DNA提取方法適用范圍較廣，提取甘蔗、水稻、玉米、大豆和花生等作物的基因組DNA的質(zhì)量較好，可以滿足SSR分子標(biāo)記分析。


圖1為采用本發(fā)明方法提取甘蔗、水稻、玉米、大豆和花生基因組DNA的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，1 2為甘蔗品種湛江25號、R0C20，3 4為水稻品種博優(yōu)168、 金優(yōu)桂99，5 6為玉米品種正大619、桂糯518，7 8為大豆品種桂春豆1號、桂早2號， 9 10為花生品種桂花沈、桂花30。圖2A-圖2E為對10份樣品材料的基因組DNA進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增后經(jīng)7. 5 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖譜，圖2A的1為DNAMarker DL2000，2 5依次為用引物 SMC119CG和mSSCIR47分別對甘蔗R0C20、湛江25號基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果；圖2B的1 4依次為用引物RM585和RM171分別對水稻金優(yōu)桂99、博優(yōu)168基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果， 5 為 DNA Marker DL2000 ；圖 2C 的 1 為 DNA Marker DL2000，2 5 依次為用引物 bnlgl25 和bnlgl792分別對玉米桂糯518、正大619基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果；圖2D的1 4依次為用引物satt491、sattl78對大豆桂早2號和桂春豆1號基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果，5為DNA Marker DL2000 ；圖 2-5 的 1 為 DNA Marker DL2000, 2E 依次為用引物 PM!35、PM3 對花生桂花 30和桂花沈基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中使用的甘蔗品系湛江25和R0C20，兩個(gè)水稻品系博優(yōu)168和金優(yōu)桂 99，兩個(gè)玉米品系正大619和桂糯518，兩個(gè)大豆品系桂春豆1號和桂早2號，兩個(gè)花生品系桂花沈和桂花30均為市售商品。實(shí)施例用于SSR分子標(biāo)記分析的甘蔗、水稻、玉米和花生基因組DNA的提取1材料與方法1. 1 材料選用兩個(gè)甘蔗品系湛江25、R0C20 ；兩個(gè)水稻品系博優(yōu)168、金優(yōu)桂99 ；兩個(gè)玉米品系正大619、桂糯518 ；兩個(gè)大豆品系桂春豆1號、桂早2號；兩個(gè)花生品系桂花沈、 桂花30。采集植株上部較嫩的葉片，分裝入保鮮袋灑入少許水密封后置于4°C條件下保藏
每種作物各篩選2個(gè)SSR標(biāo)記，引物序列(表1)由上海捷瑞生物工程有限公司合成。表ISSR標(biāo)記的引物序列
權(quán)利要求
1.一種適用于作物SSR分子標(biāo)記分析的基因組DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟1)向葉片中加入DNA提取緩沖液，蛋白酶K和核糖核酸酶，振蕩混勻；2)將上述混合體系置于37°C,30min；68°C,20min ；37°C,30min ；然后于4°C保存；3)將步驟幻中得到的混合體系冰浴5-lOmin;4)將步驟3)中得到的混合體系離心，得上清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟1)具體為向 0. 02 0. 04cm2的葉片中加入50 100 μ L DNA提取緩沖液，0. 2 0. 4 μ L的100mg/mL蛋白酶K禾Pl 2yL的10mg/mL核糖核酸酶，振蕩混勻10 20sec ；其中，DNA 提取緩沖液的成份為 10mmol/L Tris-HCl, lmmol/LEDTA,0. 1% SDS, pH 值8. 0。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟1)具體為向 0. 02 0. 04cm2的葉片中加入50 μ L DNA提取緩沖液，0. 2 μ L的100mg/mL蛋白酶K禾口 1 μ L 的lOmg/mL核糖核酸酶，振蕩混勻lOsec。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟2)為混合體系置于 PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟4)為4°C下3000 5000rpm 離心 10 15min。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因組DNA提取方法，其特征在于，步驟4)為4°C下3000rpm 離心IOmin0
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的基因組DNA提取方法，其特征在于，所述作物為甘蔗、水稻、玉米、大豆或花生。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種適用于作物SSR分子標(biāo)記分析的基因組DNA提取方法，包括步驟1)向葉片中加入DNA提取緩沖液，蛋白酶K和核糖核酸酶，振蕩混勻；2)將上述混合體系置于37℃，30min；68℃，20min；37℃，30min；然后于4℃保存；3)將步驟2)中得到的混合體系冰浴5-10min；4)將步驟3)中得到的混合體系于4℃離心，得到的上清液即可用于SSR分子標(biāo)記分析。本發(fā)明提供的多種作物基因組DNA提取方法，可在短時(shí)間內(nèi)完成大量樣品的基因組DNA提取，提取的基因組DNA能滿足SSR分子標(biāo)記技術(shù)的要求，具有操作簡便、快速、高通量、成本低和無污染等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/10GK102220313SQ20111014454
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者吳凱朝, 廖潔, 李楊瑞, 梁俊, 牙禹, 王天順, 范業(yè)賡, 莫璋紅, 莫磊興, 鄧智年, 陳忠良, 魏源文 申請人:農(nóng)業(yè)部甘蔗品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(南寧), 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室