專利名稱：一種貝類凝集素基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種貝類凝集素基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
馬氏珠母貝(Pinctada martensii)又稱合浦珠母貝，是中國及世界上海水珍珠培育的最主要貝類之一，廣泛分布于熱帶、亞熱帶的太平洋和印度洋沿岸。其中在中國主要分布在廣東、廣西、海南和臺(tái)灣沿海。在中國，自從1965年馬氏珠母貝人工育苗成功地推廣以來，海水珍珠養(yǎng)殖的面積不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量逐年增加，海水珍珠已成為我國重要的出口產(chǎn)品。以其培育的珍珠被稱為“南珠”，聞名于國內(nèi)外。但是由于長(zhǎng)期的人工養(yǎng)殖和繁育，育珠貝變小，死亡率增加，馬氏珠母貝種質(zhì)已呈現(xiàn)明顯退化現(xiàn)象、珍珠的產(chǎn)量和質(zhì)量都明顯下降。研究其先天性免疫機(jī)制將有助于其疾病防治和增加珍珠產(chǎn)量。貝類屬于無脊椎動(dòng)物軟體動(dòng)物門，其種類多達(dá)115000，是動(dòng)物界的第二大門， 也是世界上最重要經(jīng)濟(jì)類群之一。在貝類中，免疫包括體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。這二者協(xié)同作用，共同抵御微生物對(duì)機(jī)體的入侵。血細(xì)胞通過受體介導(dǎo)的包吞作用和各種細(xì)胞毒性反應(yīng)(例如釋放溶酶體酶、抗菌肽、經(jīng)由呼吸爆發(fā)而產(chǎn)生的活性氧)殺傷入侵微生物。參與貝類細(xì)胞免疫的受體主要包括兩大類一類是細(xì)胞表面受體，例如血細(xì)胞膜上的凝集素； 另一類是具有調(diào)理作用的調(diào)理素，例如血清凝集素。目前在馬氏珠母貝中分離的凝集素還極為有限，因此有必要分離更多的相關(guān)因子，以更深入的了解其抗病機(jī)理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種貝類凝集素基因。本發(fā)明另一目的在于提供上述貝類凝集素基因在體外的重組表達(dá)方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述貝類凝集素基因在介導(dǎo)細(xì)胞凝集中的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
本發(fā)明所述的HMG基因(貝類凝集素基因)是從馬氏珠母貝抑制性差減雜交文庫中篩選出來的。在隨機(jī)挑選并測(cè)序的2000個(gè)克隆中，共檢測(cè)到該基因的一個(gè)克隆。該基因cDNA 全長(zhǎng)819bp，其cDNA序列如SEQ ID NO: 1所示；自41bp至52!3bp區(qū)段為其開放閱讀框，編碼173個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示；5，非編碼區(qū)長(zhǎng)40bp，3，非編碼區(qū)長(zhǎng) 296bp,有多聚腺苷酸加尾信號(hào)(AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴。一種表達(dá)載體，含有上述的貝類凝集素基因。本發(fā)明所述貝類凝集素基因編碼的蛋白的表達(dá)過程中，使用的表達(dá)載體為 pMAL-c2X，使用的細(xì)胞系為BL21 (DE3)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明使用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了馬氏珠母貝/M mRNA在血細(xì)胞、消化腺、腮、外套膜、心臟、閉殼肌、性腺組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明—在血細(xì)胞、消化腺、腮中有高水平的表達(dá)，在性腺和外套膜中有中度表達(dá)，在心臟和閉殼肌中幾乎無表達(dá)。當(dāng)病原體入侵機(jī)體
3后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，與免疫相關(guān)的基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生明顯的變化。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量 PCR技術(shù)檢測(cè)了馬氏珠母貝在受弧菌刺激后，其血細(xì)胞中的的表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，在受弧菌刺激后48小時(shí)，血細(xì)胞中的· mRNA達(dá)到最高水平(P<0. 05)，之后表達(dá)水平逐漸下降，在刺激后7 恢復(fù)到正常水平。使用原核表達(dá)方法制備該基因的重組蛋白，用于研究該基因在介導(dǎo)血細(xì)胞凝集和細(xì)菌凝集方面的作用。


圖1為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)· mRNA在不同組織中的分布；血細(xì)胞haemocytes ； ffl it 1/1 :hepatopancreas ； :heart ； Ig :gill ；夕卜· H :mantle ； f生 gonad ； 1 Ul adductor muscle。結(jié)果表明·在血細(xì)胞、消化腺、腮中有高水平的表達(dá)，在性腺和外套膜中有中度表達(dá)，在心臟和閉殼肌中幾乎無表達(dá)；
圖2為弧菌刺激后，血細(xì)胞中·的表達(dá)模式；星號(hào)(*)指示與Oh對(duì)照組之間有顯著性差異；
圖3為純化的HMG重組蛋白；Lanel 蛋白標(biāo)記；Lane 2 重組表達(dá)的MBP-HMG ；Lane3: 純化的MBP標(biāo)簽；箭頭指示重組表達(dá)的目的蛋白MBP-HMG。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。
實(shí)施例1. RNA 提取
總RNA的提取使用SV Total RNA Isolation System (Promega)提取，具體步驟如下 A、取少量組織(不超過30 mg)于液氮預(yù)冷的研缽中，將組織磨成粉末之后，轉(zhuǎn)移到裝有 175 μ L RNA Lysis Buffer的離心管中并混勻。B、向裂解產(chǎn)物中加入350 μ L RNA Dilution Buffer (RDA)0顛倒3-4次混合溶液。在70°C干浴鍋上處理3 min。C、在13，OOOXg離心10 min。轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新的離心管。向上清中加入200 μ L乙醇，通過顛倒3-4次混勻。將混合物轉(zhuǎn)移到離心柱，在13，OOOXg離心1 min。D、丟棄收集管中的液體。將離心柱重新放回到收集管。加入600 μ L RLA，在 13，000 Xg 離心 1 min。Ε、倒掉收集管中的液體。F、制備DNase 反應(yīng)混合物40 μ L Yellow Core Buffer, 5 μ L 0. 09 M MnCl2 和 5 μ L DNase I溶液(冰上解凍)。通過輕輕的吹打混勻溶液。向每一個(gè)離心柱加入50 μ L 新鮮制備的DNase I孵育混合物。G、在室溫孵育 15 min 之后，加入 250 μ L DNase Stop Solution (DSA)，在 13，OOOXg 離心 1 min。H、加入 600 μ L RNA Wash Solution (RWA)，在 13，000Xg 離心 1 min。
4
I、倒空收集管，加入 250 μ L RNA Wash Solution (RWA)，高速離心 2 min。J、丟掉收集管，將離心柱裝入1.5 ml的離心管，加100 PL無核酸酶水，然后，在13，OOOXg離心1 min，棄離心柱，使用分光光度計(jì)測(cè)量RNA的濃度，分裝后，貯存于_80°C。2.差減雜交文庫構(gòu)建
差減雜交文庫使用 PCRIelect cDNA Subtraction Kit (Clontech, USA)試劑盒進(jìn)行構(gòu)建。馬氏珠母貝受弧菌刺激他后，收集血細(xì)胞，按照上述的方法提取血細(xì)胞總RNA，并使用同樣的方法提取對(duì)照組(未受弧菌處理)血細(xì)胞總RNA。以刺激后馬氏珠母貝作為tester， 對(duì)照組作為driver，進(jìn)行扣除雜交。將差減雜交后的cDNAs亞克隆到pGEM-T-easy載體 (Promega, USA)并轉(zhuǎn)化到 Esctwrichis coli JM109 (Promega, USA)感受態(tài)細(xì)胞。隨機(jī)挑選2000個(gè)克隆并進(jìn)行測(cè)序。3.反轉(zhuǎn)錄
cDNA 的制備使用 STOR PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)試劑盒。反應(yīng)總體積為20mL。在200mL薄壁管中依次加入以下成份5 XI^rimeScript buffer 4mL, PrimeScript RT Enzyme mix :lmL,隨機(jī)六堿基核苷酸2mL，總 RNA :300ng，RNA 酶抑制劑(TaKaRa) :20U。將上述成份混勻，在37°C處理30分鐘，85°C處理10秒，一 20°C保存。4.實(shí)時(shí)定量PCR
進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)所使用的試劑盒為STOR PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa)，所使用的儀器為 LightCycler 480 System (Roche), 所使用的模板為上述所獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所使用的內(nèi)參為A-adi ，所使用的引物有 qRT-HMG For (SEQ ID NO:3), qRT-HMG Rev (SEQ ID NO:4) ；qRT-β -actin For (SEQ ID NO: 5), qRT-β -actin Rev (SEQ ID N0:6)。qRT-PCR 的反應(yīng)體系如下2XMix :10mL, qRT-HMG For :0. 2mM ；qRT- HMG Rev :0. 2mM ；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA) :50ng。熱循環(huán)條件如下95°C 處理10 min ；接下來運(yùn)行40個(gè)循環(huán)95°C變性5秒，60°C退火延伸20秒。qRT-PCR運(yùn)行完成后，進(jìn)行溶解曲線分析以確定PCR擴(kuò)增是否特異。使用2 —DDCT方法對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行相對(duì)定量。對(duì)于每一份樣品，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均設(shè)置3個(gè)平行反應(yīng)。5.重組蛋白的原核表達(dá)和純化
以編碼HMG蛋白的核苷酸序列和pMAl_c2X載體制備表達(dá)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)。 挑選單克隆并培養(yǎng)至OD=O. 6，然后加入IPTG至終濃度為0. ImM,在22°C，220rmp的條件下誘導(dǎo)表達(dá)。4h后收集菌液，4°C，12，000Xg離心10分鐘。加入Column Buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.4，200 mM NaCl, 1 mM EDTA)，超聲破碎，離心，取上清，使用 Amylose resin column (NEW ENGLAND BioLabs)進(jìn)行親和純化。使用SDS-PAGE膠檢測(cè)純化產(chǎn)物的大小和純度。
權(quán)利要求
1.一種貝類凝集素基因，其特征在于其CDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的貝類凝集素基因，其特征在于基因的cDNA全長(zhǎng)819bp，自 41bp至52!3bp區(qū)段為開放閱讀框，編碼173個(gè)氨基酸，5’非編碼區(qū)長(zhǎng)40bp，3’非編碼區(qū)長(zhǎng) 296bp,有多聚腺苷酸加尾信號(hào)和多聚腺苷酸尾巴。
3.權(quán)利要求1所述的貝類凝集素基因編碼的蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID N0:2所示。
4.一種表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的貝類凝集素基因。
5.權(quán)利要求3所述貝類凝集素基因編碼的蛋白的表達(dá)方法，其特征在于使用的表達(dá)載體為 pMAL-c2X，使用的 fecAericAia coli 細(xì)胞系為 BL21 (DE3)。
6.權(quán)利要求3所述貝類凝集素基因編碼的蛋白在介導(dǎo)細(xì)菌凝集中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述貝類凝集素基因編碼的蛋白在介導(dǎo)紅細(xì)胞凝集中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種貝類凝集素基因及其應(yīng)用。本發(fā)明所述貝類凝集素基因的cDNA全長(zhǎng)819bp，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，自41bp至523bp區(qū)段為開放閱讀框，編碼173個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示；5’非編碼區(qū)長(zhǎng)40bp，3’非編碼區(qū)長(zhǎng)296bp，有多聚腺苷酸加尾信號(hào)和多聚腺苷酸尾巴。本發(fā)明所述貝類凝集素基因在貝類免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要的作用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102250909SQ20111014862
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者喻子牛, 張揚(yáng), 陳金輝 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院南海海洋研究所