專利名稱：：一種溫敏雄性育性基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種溫敏雄性育性基因及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。技術(shù)背景植物通過不同品種間的雜交產(chǎn)生雜種。雜種在生長勢(shì)、適應(yīng)性、產(chǎn)量等方面具有優(yōu)勢(shì)，稱為雜種優(yōu)勢(shì)。利用雜種優(yōu)勢(shì)可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性。水稻育種利用雜種優(yōu)勢(shì)的途徑主要是通過雜交水稻育種，而雜交水稻育種的方式主要有兩系法和三系法。三系法育種需要不育系、保持系和恢復(fù)系，而兩系法只需要不育系和恢復(fù)系。兩系法中的不育系具有育性轉(zhuǎn)換的特點(diǎn)，其雄性的不育或可育受控于外界的光周期和溫度條件，不育系在不同光溫條件下可以作為保持系。與三系法相比，兩系法具有三大優(yōu)越性:一是不育系一系兩用，不需要保持系，簡化了種子生產(chǎn)程序，減少了生產(chǎn)環(huán)節(jié)和不育系繁殖面積，降低了種子成本；二是配組自由，絕大多數(shù)常規(guī)品種都可成為恢復(fù)系，擴(kuò)大了雜種優(yōu)勢(shì)利用的種質(zhì)范圍，大大提高了選到優(yōu)良組合的概率；三是不育系的不育性遺傳行為簡單，較容易轉(zhuǎn)育到其他性狀優(yōu)良的水稻品種(系)中，有利于改良品質(zhì)、抗性等性狀，同時(shí)其不育性受細(xì)胞核控制，從而避免了細(xì)胞質(zhì)不育對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的負(fù)效應(yīng)，以及因細(xì)胞質(zhì)單一化而導(dǎo)致某種毀滅性病蟲害爆發(fā)的潛在威脅(袁隆平，1987)。目前，在水稻兩系法中應(yīng)用的不育系主要有光敏不育系和溫敏不育系。光敏不育系的花粉育性主要受日照長度的控制，在長日照的條件下，水稻花粉表現(xiàn)為不育，而在短日照條件下，花粉可育；溫敏不育系的花粉育性主要受環(huán)境溫度控制。當(dāng)環(huán)境溫度高于某一溫度時(shí)，水稻花粉表現(xiàn)為不育，而當(dāng)環(huán)境溫度低于某一溫度時(shí)，表現(xiàn)為可育。已發(fā)現(xiàn)并定位的光敏不育基因有3個(gè)，分別是pmsl(Zhang等1994，ProcNatlAcadSciUSA.91:8675-9)、pms2(Zhang等1994，ProcNatlAcadSciUSA.91:8675-9;Liu等2001，MolGenetGenomics266:271-5)和pms3(Mei等1999，SciChina(SerC)42:316—322;Li等2001，Euphytica119:343—348;Li等2002，ActaAgronSin28:310~314;Lu等2005，MolGenetGenomics273:507-11)。已發(fā)現(xiàn)并定位的溫敏不育基因共有8個(gè)，分別是tmsl(Wang等1995，TheorApplGenet91:1111—1114)，tms2(Yamaguchi等1997，BreedSci47:371—373)，tms3(Subudhi等1997，Genome40:188-194)，tms4(Dong等2000，TheorApplGenet100:727—734)，tms5(Wang等2003，TheorApplGenet107:917—921;Jiang等2006，ChineseScienceBulletin51:417-420;Yang等2007，Planta225:321-30)，tms6(Lee等2005，TheorApplGenet111:1271-1277),rtmsl(Jia等2001，TheorApplGenet103:607~612)和Ms-h(Koh等1999，Euphytica106:57-62)。溫敏不育系安農(nóng)S-1是從安農(nóng)中發(fā)現(xiàn)的自然突變體，其溫敏不育性是受一對(duì)隱性核基因所控制，其育性轉(zhuǎn)換主要受溫度控制，轉(zhuǎn)換溫度的起始點(diǎn)為25°C，即環(huán)境溫度高于25°C時(shí)，其花粉表現(xiàn)為不育，而環(huán)境溫度低于25。C時(shí)，表現(xiàn)為可育(鄧華鳳等，1999)。安農(nóng)S-l是目前在兩系法育種中廣泛應(yīng)用的兩個(gè)溫敏不育基因之一，以安農(nóng)S-l為溫敏不育基因的供體，己培養(yǎng)多個(gè)溫敏不育系，廣泛應(yīng)用于水稻育種中。安農(nóng)S-l所攜帶的溫敏不育基因座為tms5，已定位于第二染色體(Wang等2003，TheorApplGenet107:917"921;Jiang等2006，ChineseScienceBulletin51:417-420;Jiang等2006，ChineseScienceBulletin51:417-420;Yang等2007，Planta225:321-30)。目前尚未有水稻溫敏不育基因tms5被分離克隆的報(bào)道，安農(nóng)S-l溫敏不育的分子基礎(chǔ)還不清楚，已有技術(shù)還不能明確和分離克隆溫敏不育基因tms5，不能更好地選育水稻。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過圖位克隆(map-basedcloning)技術(shù)安農(nóng)S-l溫敏不育基因座加s5獲得了溫敏育性基因TSSNR，通過轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了此基因的功能，并提出了RNAi(RNAinterference,RNAi)或反義RNA(anti-senseRNA)或過表達(dá)負(fù)顯性(dominantnegative,DN)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可使正常水稻品種中的TSSRZ基因功能喪失，培育溫敏雄性不育系。本發(fā)明為克服已有技術(shù)的不足，目的在于提供一種溫敏雄性育性基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述溫敏雄性育性基因的遺傳標(biāo)記。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述溫敏雄性育性基因所編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述溫敏雄性育性基因的載體。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供含有溫敏雄性育性基因的重組微生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述溫敏雄性育性基因在培育溫敏雄性不育系中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述遺傳標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的。一種溫敏雄性育性基因，其核苷酸序列如如SEQIDNo.l或SEQIDNo.4。上述溫敏雄性育性基因的遺傳標(biāo)記，確定第71位的堿基C突變?yōu)锳。含有上述溫敏雄性育性基因所編碼的蛋白質(zhì)，序列為SEQIDNo.2或SEQIDNo.5，或替換、減少或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。含有上述溫敏雄性育性基因的載體。所述的載體包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體。含有溫敏雄性育性基因的重組微生物。所述的重組微生物是含有所述載體的細(xì)菌細(xì)胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。上述溫敏雄性育性基因在培育植物溫敏不育系中的應(yīng)用。所述溫敏不育系可以是溫敏雄性不育系。上述遺傳標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。本發(fā)明首先采用分子標(biāo)記的方法完成安農(nóng)S-l溫敏不育基因的精細(xì)定位，將安農(nóng)S-l溫敏不育基因定位于8.4kb的區(qū)域，根據(jù)已測定的水稻基因組的序列，該區(qū)域只有3個(gè)編碼蛋白的基因。根據(jù)水稻基因組測序的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物采用PCR的方法擴(kuò)增正常品種安農(nóng)和溫敏不育系安農(nóng)S-l的這3個(gè)基因的基因組全序列(包括啟動(dòng)子和編碼區(qū)的序列)，將擴(kuò)增的序列進(jìn)行測序。比較安農(nóng)N和安農(nóng)S-1的這3個(gè)基因的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)只有一個(gè)編碼核酸酶Z(nuclearribonucleaseZ，簡稱為RNaseZ或RZ)的基因在安農(nóng)N和安農(nóng)S-l間有差異，即安農(nóng)S-1中編碼區(qū)的第71位核苷酸由C突變?yōu)锳，導(dǎo)致第24位的密碼子由TCG突變?yōu)榻K止密碼子TAG。用PCR方法，從正常品種安農(nóng)中擴(kuò)增RZ基因的基因組全序列克隆到植物轉(zhuǎn)化載體，將該載體用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化安農(nóng)S-1轉(zhuǎn)育的溫敏不育系，To代時(shí)，被轉(zhuǎn)化的溫敏不育系即使在高溫條件其花粉育性恢復(fù)正常，在Ti代中不同單株的花粉育性在高溫條件下出現(xiàn)分離，即含有轉(zhuǎn)基因的單株花粉育性正常，而不含轉(zhuǎn)基因的單株花粉不育。同時(shí)，采用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)的方法降低正常品種中RZ基因的表達(dá)，在T。代中RZ基因的表達(dá)量下降，導(dǎo)致正常品種的花粉育性轉(zhuǎn)變?yōu)楦邷?28-35。C)不育和適溫(19-24°C)可育。在Ti代中不同單株在高溫下出現(xiàn)花粉育性分離，含有轉(zhuǎn)基因的單株，表現(xiàn)為溫敏雄性不育，而不含轉(zhuǎn)基因的單株表現(xiàn)雄性育性正常。為了檢驗(yàn)這種機(jī)制的普遍性，同樣采用RNA干擾的方法降低擬南芥中RZ同源基因NUZ(核苷酸水平同源性為67%)的表達(dá)，導(dǎo)致擬南芥的花粉育性在高溫條件下不育，而在適溫條件下花粉可育，同樣表現(xiàn)為溫敏雄性不育。這些結(jié)果說明突變的RZ基因是溫敏不育基因，將該基因命名為temperature-sensitivesterileRZ，其野生型和突變型分別簡稱為TSSRZ(SEQIDNO:l)和tssrz(S￡QIDNO:3)。TSSRZ及其在其它植物的同源基因如雙子葉模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的同源基因序列NUZ(SEQIDNO:4)的表達(dá)抑制或其功能缺失突變型表達(dá)異常的蛋白，能導(dǎo)致植物溫敏雄性不育。與己有技術(shù)相比，本發(fā)明的具有以下有益效果(1)闡明了安農(nóng)S-l的溫敏不育的分子機(jī)理，獲得了安農(nóng)S-l溫敏不育基因tms5;(2)本發(fā)明提供的溫敏育性基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值，是根據(jù)所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記或其緊密連鎖標(biāo)記，包括但不限于SNP(單核苷酸多態(tài))、InDel(插入缺失多態(tài))、RFLP(限制性內(nèi)切酶長度多態(tài))、CAP(切割擴(kuò)增片段多態(tài))，用這些標(biāo)記可鑒定水稻或野生稻或雜交后代植株的基因型，用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率；同時(shí)利用己闡明的溫敏不育的分子機(jī)理培育植物溫敏雄性不育系，即利用RNAi或反義RNA(anti-senseRNA)或過表達(dá)負(fù)顯性(dominantnegative,DN)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)使正常水稻品種中的75SiZ基因和其它植物的7^S/Z同源基因的功能喪失，實(shí)現(xiàn)培育溫敏雄性不育系的方法。圖1是實(shí)施例1水稻溫敏不育基因座tms5的染色體連鎖定位圖。圖2是實(shí)施例2正常水稻品種安農(nóng)N的TSSRZ(RA-ANcDNA)和溫敏不育系安農(nóng)S-1的tssrz(RA-AScDNA)編碼區(qū)的差異示意圖。圖3和圖4是實(shí)施例2用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測溫敏不育基因TSSRZ在幼穗的表達(dá)，其中圖3為TSSRZRT-PCR擴(kuò)增的結(jié)果圖；圖4為actinRT-PCR擴(kuò)增的結(jié)果圖。兩圖中，l為花粉母細(xì)胞時(shí)期穗，2為減數(shù)分裂時(shí)期穗，3為小孢子早期穗，4為小孢子晚期穗。圖5和圖6是實(shí)施例3將正常水稻品種(中化ll)中的TSSRZ基因?qū)氚厕r(nóng)S-l，獲得的TO轉(zhuǎn)化體在高溫(28-35。C)下的花粉恢復(fù)可育的照片。其中圖5為未導(dǎo)入TSSRZ基因的安農(nóng)S-l在高溫(28-35。C)下花粉的育性照片；圖6為導(dǎo)入TSSRZ基因的安農(nóng)S-1在高溫(28-35。C)下花粉的育性照片。圖7為實(shí)施例4利用RNAi技術(shù)抑制水稻品種中化11的TSSRZ表達(dá)后，在高溫(28-35。C)條件下產(chǎn)生不育的照片。圖8為實(shí)施例4利用RNAi技術(shù)抑制水稻品種中化11的TSSRZ表達(dá)在適溫(19-24。C)下表現(xiàn)花粉可育的照片。圖9和圖10所示為實(shí)施例4利用RNAi技術(shù)抑制水稻品種中化11的TSSRZ表達(dá)。圖9為用TSSRZ作為探針Northern雜交的結(jié)果圖，顯示RNAi轉(zhuǎn)化系中TSSRZ表達(dá)水平明顯下降，圖10為總RNA電泳結(jié)果圖。圖中CK為未轉(zhuǎn)化的中花ll，l和2分別為RNAi轉(zhuǎn)化株系，圖11和圖12所示是實(shí)施例5利用RNAi技術(shù)抑制擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)的同源基因NUZ的表達(dá)。其中，圖11為用擬南芥TSSRZ作為探針Northern雜交的結(jié)果圖，圖12為總RNA電泳結(jié)果圖。圖中CK為未轉(zhuǎn)化的擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)，l為RNAi轉(zhuǎn)化株系。圖13和圖14為實(shí)施例5利用RNAi技術(shù)抑制擬南芥的同源基因NUZ的表達(dá)后，不同溫度條件下花粉萌發(fā)的結(jié)果。其中，圖ll為適溫(25°C)下花粉可以萌發(fā)的照片；圖12為高溫(30。C)條件下的花粉不能萌發(fā)的照片。圖15所示為實(shí)施例6用SNP標(biāo)記RA1鑒定正常水稻品種安農(nóng)N(AN)和溫敏不育系安農(nóng)S-l(AS)的溫敏育性基因的基因型，圖中RANR和RASR分別為TSSRZ和tssrz的特異引物。具體實(shí)施方式實(shí)施例1tms5的精細(xì)定位(多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選和tms5基因的連鎖定位)根據(jù)公開的水稻基因組序列數(shù)據(jù)庫的資料(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，在該區(qū)域發(fā)展了多個(gè)分子標(biāo)記，如表1所示表1與tms5緊密連鎖或共分離的多態(tài)性分子標(biāo)記分子標(biāo)記引物名稱引物序列AN1AN1FAN1RPL1PL1FPL1RNAC1NAC1FNAC1RRA1RA1FRA1RRASRRANR5'-CGAGGCCTTGGCAAGGTAG-3'5'-TACTGAATCAATCTCCGTCTG-3'5'-GTTCATGCATTGAAGGAAGG-3'5'-GAGTTCTTGGTACATGAGTG-3'5'-AGCGCACATAGGACAGATAG-3，5'-GGTCTTCGTTGGTAACCTCCG-3'5'-CAACCTCTTACAGGCTAGATG畫3'5'-AAGATGACGCAGGTCTCCTG-3'5'-TGAGGGGCGGCGCCTTCT-3'5'-TGAGGGGCGGCGCCTTCG-3'表1中的AN1、PL1和NAC1為插入/缺失(InDel)標(biāo)記；RA1為單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記。SNP標(biāo)記的檢測方法為第1次PCR用引物"RA1F"與"RA1R"擴(kuò)增33個(gè)循環(huán)，然后取0.5MlPCR產(chǎn)物為第2次PCR的模板，每個(gè)樣品配制2個(gè)反應(yīng)，即用引物"RA1F"與"RASR"為溫敏不育基因型的特異反應(yīng)，用引物"RA1F'與"RANR"為野生基因型的特異反應(yīng)，擴(kuò)增8—10個(gè)循環(huán)，用6%聚丙烯酰胺凝膠檢測PCR產(chǎn)物，見13和圖14。分子標(biāo)記與目標(biāo)恢復(fù)基因的重組事件越多，表示兩者的遺傳距離越遠(yuǎn)，反之其遺傳距離越近。利用這種遺傳作圖的方法和安農(nóng)S-l與粳秈89雜交的6000多株F2植株構(gòu)建了一個(gè)tms5基因的遺傳連鎖圖，見圖1。圖中2個(gè)標(biāo)記ANIDL76和DLNAC1與tms5之間分別只有1個(gè)重組事件和3個(gè)重組事件，而標(biāo)記IDLPL與tms5基因是零重組即共分離。ANIDL76和DLNAC1之間的物理距離約為8.4kb。所述的定位區(qū)域位于已公開的水稻細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)OJ1006_D05(http:〃www.ncbi.nlm-nih.gov)的約36-45kb處。實(shí)施例2tms5的克隆與序列分析根據(jù)GenBank公開的水稻(粳稻)基因組DNA序列和RiceGAAS軟件(http:〃ricegaas.dn&affrc.go.jp)分析，在定位的8.4kb區(qū)域內(nèi)只存在2個(gè)預(yù)測的基因，這2個(gè)基因分別是果膠裂解酶(Pectatelyase,簡稱為PL)和核酸酶Z(RNaseZ，簡稱為RZ)。其中果膠裂解酶基因編碼1個(gè)446氨基酸的蛋白質(zhì)，而核酸酶Z基因編碼1個(gè)302氨基酸的蛋白質(zhì)。使用弓l物PLf(5，-CTCCTCTCGATGCACTCATG-3，)與PLr(5，-GATAGCATGACATGGCATTG-3，)和RZf(5，-CACGTCGTCAACAACGACTAC-3，)與RZr(5'-CCTGTTAACCGGTTGAGGTG-3')從正常品種安農(nóng)N和溫敏不育系安農(nóng)S-1用PCR技術(shù)擴(kuò)增出PL和RZ基因組全序列(包括啟動(dòng)子與編碼區(qū))，克隆到質(zhì)粒載體pUC18。經(jīng)測序分析，發(fā)現(xiàn)PL的DNA序列在安農(nóng)N和安農(nóng)S-1之間沒有差異，而RZ的DNA序列在安農(nóng)N和安農(nóng)S-1之間只有1個(gè)核苷酸的差異。并通過測定安農(nóng)S-l和正常品種間RZ基因的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)此核苷酸的變異發(fā)生在安農(nóng)S-1的編碼區(qū)的第71位，即由C突變?yōu)锳，結(jié)果導(dǎo)致密碼子由TCG(Ser)突變?yōu)榻K止密碼TAG，產(chǎn)生一個(gè)只編碼23個(gè)氨基酸的截?cái)喽屉?，見圖2。用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測到RZ基因在花粉母細(xì)胞時(shí)期的幼穗表達(dá)，其它時(shí)期的幼穗不表達(dá)，見圖3和圖4。因此，此突變的RZ基因可能是產(chǎn)生溫敏不育的基因。實(shí)施例3遺傳轉(zhuǎn)化鑒定目標(biāo)基因的功能用弓|物RZf(5'-GTTCGGTGTGTGAAGGGGTG-3，)與RZr(5'-CCTGTTAACCGGTTGAGGTG-3')將從安農(nóng)N擴(kuò)增的4kb的RZ基因片段(包含啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)、及其下游區(qū)序列)克隆到雙元轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300。用電激法將該表達(dá)載體導(dǎo)入常用的土壤根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Hiei等，PlantJ.6:271-282)轉(zhuǎn)化由安農(nóng)S-l轉(zhuǎn)育的溫敏不育系，獲得T。代轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)分子檢測，獲得含有外源基因的轉(zhuǎn)化體，這些轉(zhuǎn)化體在高溫條件下(28-35。C)花粉育性正常，見圖5和圖6。收獲T。代種子，種植Ti代，在高溫條件下(28-35。C)T1代花粉育性出現(xiàn)分離，即含有轉(zhuǎn)基因的植株花粉可育，而不含轉(zhuǎn)基因的植株花粉敗育。這些結(jié)果證明了突變的RZ是溫敏不育基因。本薦明將此基因的野生型和突變型分別命名為TSSRZ禾卩tssrz(temperature-sensitivesterileRZ)。實(shí)施例4用RNAi技術(shù)抑制TSSRZ基因的表達(dá)產(chǎn)生溫敏不育轉(zhuǎn)化體植物轉(zhuǎn)化RNAi載體的構(gòu)建按公開的載體和方法(胡旭霞和劉耀光，植物分子育種，4:1-6)進(jìn)行，此RNAi載體由組成型的玉米泛素基因啟動(dòng)子控制目的雙鏈RNA的產(chǎn)生。用引物RAZif(5，-aaaaAAGCTTcatggaccagtccgagctc-3，)禾卩RAZir(5，-aaaaGAATTCgteacactgatteagtatctc-3')對(duì)花粉母細(xì)胞時(shí)期的幼穗cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的TSSRZ的cDNA片段用BamHI和Hindin進(jìn)行雙酶切，連接到pRNAi-ubi載體(胡旭霞和劉耀光，植物分子育種，4:1-6)的第一克隆位點(diǎn)。用電激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF'，再用pRNAi-ubi載體通用引物RNAi-Mlu(5，-CACCCTGACGCGTGGTGTTACTTCTGAAGAGG-3，)和RNAi-Pst(5，-ACTAGAACTGCAGCCTCAGATCTACCATGGTTCG-3，)對(duì)克隆的目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得末端含有MluI和PstI酶切位點(diǎn)的目的片段。將目的片段用MluI和PstI酶切，克隆到第一輪陽性載體(也用同樣的酶切好)的第二克隆位點(diǎn)，然后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHIOB。將構(gòu)建好的RNAi載體電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法(Hiei等，PlantJ.6:271-282)轉(zhuǎn)化正?？捎酒贩N中花11，經(jīng)篩選獲得了含有轉(zhuǎn)基因的24株To代體。將每個(gè)To轉(zhuǎn)化體的分蘗分開種植，在生殖發(fā)育對(duì)溫度敏感的花粉母細(xì)胞時(shí)期進(jìn)行高溫處理(28-35。C)和適溫(19-24°C)處理7天。結(jié)果高溫處理的產(chǎn)生敗育花粉且花粉量很少，而經(jīng)適溫處理的可育花粉量達(dá)50%以上，結(jié)果見圖7和圖8。適溫處理的T。轉(zhuǎn)化體能結(jié)實(shí)獲得1\植株。再次對(duì)T\植株進(jìn)行花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期的高溫處理(28-35。C)7天。結(jié)果Ti植株的花粉育性出現(xiàn)分離，即含有RNAi轉(zhuǎn)基因的單株花粉敗育，而不含RNAi轉(zhuǎn)基因的單株花粉可育。RT-PCR檢測結(jié)果表明，攜帶RNAi轉(zhuǎn)基因的Tt轉(zhuǎn)化體的TSSRZ表達(dá)受到抑制，見圖9和圖10。這些結(jié)果說明抑制TSSRZ基因的表達(dá)產(chǎn)生溫敏不育。實(shí)施例5擬南芥TMS5同源基因RNAi載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化后代分析用TSSRZ基因序列對(duì)生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性搜索(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)，獲得雙子葉豐莫式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)的同源基因序列NUZ(SEQIDNO:3)。利用NUZ特異引物NUZif(5，-aaaaAAGCTTcacatggatcatatcggtgg-3，)和NUZir(5'aaaaGGATCCtcctteactgtataccgagc3，)PCR擴(kuò)增擬南芥花的cDNA。將擴(kuò)增得到的目的片段用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切。按實(shí)施例4相同的方法步驟構(gòu)建RNAi載體。將構(gòu)建好的RNAi載體電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105，用花器官浸泡法(CloughandBen11998，PlantJ.16,735-743)轉(zhuǎn)化擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)，收獲的To代擬南芥種子均勻播種在含有潮霉素的培養(yǎng)基上，在篩選培養(yǎng)基上萌發(fā)并存活的植株即為1代陽性植株。在1植株生長到到抽苔后的花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期，部分植株進(jìn)行高溫(28-35。C)處理7天，部分植株進(jìn)行適溫(19-24。C)處理。結(jié)果高溫處理的植株產(chǎn)生花粉敗育，適溫處理的植株花粉可育，見圖11和圖12。經(jīng)適溫處理的l植株獲得丁2代種子。再次在T2植株抽苔后的花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期進(jìn)行高溫條件處理，結(jié)果T2植株得花粉育性出現(xiàn)分離，含有RNAi轉(zhuǎn)基因的植株花粉敗育，而不含轉(zhuǎn)基因的植株花粉可育。RT-PCR檢測結(jié)果表明，攜帶RNAi轉(zhuǎn)基因的T2轉(zhuǎn)化體的NUZ表達(dá)受到抑制，見圖13和圖14。這些結(jié)果說明，采用基因工程方法抑制TSSRZ或其同源基因得表達(dá)，或篩選這些基因的自然突變或人工誘變突變體，可以在單子葉植物和雙子葉植物培育溫敏雄性不育系，用于雜交種子生產(chǎn)。實(shí)施例6溫敏不育基因序列在分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用利用本發(fā)明提供的序列信息可以產(chǎn)生水稻溫敏不育基因tssrz及其緊密連鎖的分子標(biāo)記，用于鑒定水稻tms5位點(diǎn)的基因型，可在分子標(biāo)記輔助選擇育種中應(yīng)用。例如，表1所示的標(biāo)記RA1可用于鑒定水稻正常可育株和溫敏不育株的基因型，結(jié)果見圖15,即某個(gè)品種用"RA1F"與"RASR"引物組合可以擴(kuò)增出特異的條帶，而用"RA1F'與"RANR"引物組合不能擴(kuò)增出特異的條帶，該品種為溫敏不育系；相反即某個(gè)品種用"RA1F"與"RASR"引物組合不能擴(kuò)增出特異的條帶，而用"RA1F"與"RANR"引物組合可以擴(kuò)增出特異的條帶，該品種不是溫敏不育系。序列表<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種溫敏雄性育性基因及其應(yīng)用〈130〉〈160〉5〈170〉PatentIn!version3.1〈210>1〈211>4070〈212〉■〈213〉正常水稻品種安農(nóng)N(OryzaSativa)〈220〉〈221〉CDS〈222>(2006)..(2485)〈223〉〈220〉〈221〉CDS〈222>(2591).(2686)〈223〉〈220〉〈221〉CDS〈222〉(2797)..(2910)〈223>〈220><221〉CDS〈222〉(3288)..(3356)<223〉〈220>〈221〉CDS<222〉(3455)..(3529)〈223〉<220〉<221>CDS<222>(3826)..(3900)〈223〉<400〉1cctgttaaccggttgaggtg鄉(xiāng)ccttggcaaggtaggcacggagattgattcagtaatc3tgtg3tt幼tt3CgC3g3taacagacagaggagtaacatccccttccttttcctgagcttgatcaggatgagc鄉(xiāng)cctgcgatcaagtttttggggagca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