專利名稱：多菌發(fā)酵劑和用于抗動脈粥樣硬化的多菌發(fā)酵乳品及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于多菌發(fā)酵及其乳品和應用的技術(shù)領域，是一種多菌發(fā)酵劑和用于抗動脈粥樣硬化的多菌發(fā)酵乳品及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)作為人類生命的第一殺手的心腦血管病， 當前嚴重威脅著人類的生命和健康。我國每年新發(fā)生腦卒中病例約300萬，心肌梗死60萬人，心腦血管病死亡人數(shù)約260萬，平均每小時死亡300人。更令人擔憂的是，心腦血管病發(fā)病和死亡人群日益呈現(xiàn)年輕化趨勢，30歲左右發(fā)生心肌梗死和腦卒中的已屢見不鮮，15 歲以上人群高血壓患病率約為14%，比30年前增加了一倍。上述疾病間關(guān)系密切，錯綜復雜。而動脈粥樣硬化是諸多心腦血管病的主要病理基礎，因此，防治動脈粥樣硬化是防治心腦血管病的根本性戰(zhàn)略措施。臨床上應用的經(jīng)典的抗動脈粥樣硬化藥物主要有調(diào)血脂藥、抗氧化藥、多烯脂肪酸類、抗血小板藥及保護動脈內(nèi)皮藥等。常用的調(diào)血脂藥主要有他汀類、貝特類、膽酸結(jié)合樹脂類、煙酸等，可以通過不同程度的降低血中膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白水平，提高高密度脂蛋白水平起到治療作用。但是臨床流行病學研究發(fā)現(xiàn)，長期應用貝特類藥物可增加非冠脈疾病的死亡率，膽酸結(jié)合樹脂類雖然降低冠脈疾病的死亡率，但總死亡率并未降低。20世紀80年代以來他汀類藥物的廣泛使用，使動脈粥樣硬化治療取得了重大進展。然而，通過單獨降低LDL膽固醇水平帶來的益處存在一定的限度，從他汀類藥物自身來講，發(fā)生橫紋肌溶解癥是其致命的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種多菌發(fā)酵劑和用于抗動脈粥樣硬化的多菌發(fā)酵乳品及其生產(chǎn)方法，因其獨特的制作工藝，使其具有抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗氧化等作用。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實現(xiàn)的一種多菌發(fā)酵劑，其按下述原料重量份發(fā)酵得到，發(fā)酵菌與牛奶或脫脂牛奶的重量比為1 20至30，發(fā)酵菌為短乳 If |ii (Lactobaci 1 Ius brevis)> ^lJ ？LIf lif (Lactobacillus plantarum) > Jfnf dr If lif (Lactobacillus. helveticus)> 馬季L ？L If 胃(Lactobacillus kef ianofaciens)、zP 酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、香腸乳桿菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)、單孢酉良酒酵母(Saccharomyces unisporus)、東方伊薩酵母 (Issatchenkia orientalis)，各菌種之間的重量比為 0. 8 至 1. 0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 1.0 至 1.2: 0.2 至 0.4: 0. 2 至 0. 4。上述技術(shù)方案之一可進一步進行優(yōu)化或/和選擇如下
上述多菌發(fā)酵劑按下述步驟得到首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌后，其次冷卻到42°C至45°C加入所需要量的發(fā)酵菌，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵8小時至12小時得到多菌發(fā)酵劑。在上述恒溫下發(fā)酵5小時至12小時時至少攪拌兩次。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實現(xiàn)的一種上述多菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)方法，其按下述步驟進行首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌后，其次冷卻到 42°C至45°C加入所需要量的發(fā)酵菌，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵8小時至12小時得到多菌發(fā)酵劑。上述技術(shù)方案之二可進一步進行優(yōu)化或/和選擇如下 在上述恒溫下發(fā)酵5小時至12小時時至少攪拌兩次。上述牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌的操作參數(shù)為加熱90°C至95°C，保溫10分鐘至15分鐘殺菌。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是通過以下措施來實現(xiàn)的一種利用上述多菌發(fā)酵劑的用于抗動脈粥樣硬化的多菌發(fā)酵乳品，其按下述原料發(fā)酵得到，按牛奶或脫脂牛奶總重量的 3%至5%的比例添加上述制得的多菌發(fā)酵劑。上述技術(shù)方案之三可進一步進行優(yōu)化或/和選擇如下
上述多菌發(fā)酵乳品按下述步驟得到第一步，首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶加熱到50°C至60°C進行均質(zhì)后經(jīng)過巴氏殺菌，其次冷卻到40°C至45°C加入所需要量的多菌發(fā)酵劑，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵6小時至8小時；第二步，發(fā)酵結(jié)束后，在18°C至23°C 恒溫下成熟72小時至120小時；第三步，勻速攪拌1. 5小時至2小時，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮1小時至2小時；第四步，分離乳清在18°C至23°C下，經(jīng)滅菌濾布過濾， 分別得到乳酪和乳清，該乳清為多菌發(fā)酵乳品。本發(fā)明的技術(shù)方案之四通過以下措施來實現(xiàn)的一種上述多菌發(fā)酵乳品的生產(chǎn)方法，其按下述步驟進行第一步，首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶加熱到50°C至60°C進行均質(zhì)后經(jīng)過巴氏殺菌，其次冷卻到40°C至45°C加入所需要量的多菌發(fā)酵劑，然后在40°C 至45°C恒溫下發(fā)酵6小時至8小時；第二步，發(fā)酵結(jié)束后，在18°C至23°C恒溫下成熟72小時至120小時；第三步，勻速攪拌1. 5小時至2小時，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮 1小時至2小時；第四步，分離乳清在18°C至23°C下，經(jīng)滅菌濾布過濾，分別得到乳酪和乳清，該乳清為多菌發(fā)酵乳品。上述技術(shù)方案之四可進一步進行優(yōu)化或/和選擇如下
上述牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌的操作參數(shù)為加熱90°C至95°C，保溫10分鐘至 15分鐘殺菌。本發(fā)明易操作、生產(chǎn)方法簡單，所得多菌發(fā)酵乳品營養(yǎng)豐富，含有益生菌、ACE抑制肽、抗氧化肽等成份，具有抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗氧化等作用，能增強人的體質(zhì)和整體活力，延緩人的衰老。


附圖1為正常組冠脈在顯微鏡下10倍的放大圖。附圖2為正常組冠脈在顯微鏡下40倍的放大圖。附圖3為模型組在顯微鏡下10倍的放大圖。附圖4為模型組在顯微鏡下40倍的放大圖。
附圖5為辛伐他汀組在顯微鏡下10倍的放大圖。附圖6為辛伐他汀組在顯微鏡下40倍的放大圖。附圖7為TFCW小劑量組在顯微鏡下10倍的放大圖。附圖8為TFCW小劑量組在顯微鏡下40倍的放大圖。附圖9為TFCW中劑量組在顯微鏡下10倍的放大圖。附圖10為TFCW中劑量組在顯微鏡下40倍的放大圖。附圖11為正常組冠脈ICAM-I在顯微鏡下倍的放大圖。附圖12為正常組冠脈ICAM-I在顯微鏡下40倍的放大圖。附圖13為模型組冠脈ICAM-I在顯微鏡下倍的放大圖。附圖14為模型組冠脈ICAM-I在顯微鏡下40倍的放大圖。附圖15為辛伐他汀組冠脈ICA M-I在顯微鏡下10倍的放大圖。附圖16為辛伐他汀組冠脈ICA M-I在顯微鏡下40倍的放大圖。附圖17為TFCW小劑量組ICAM-I在顯微鏡下10倍的放大圖。附圖18為TFCW小劑量組ICAM-I在顯微鏡下40倍的放大圖。附圖19為TFCW中劑量組ICAM-I在顯微鏡下10倍的放大圖。附圖20為TFCW中劑量組ICAM-I在顯微鏡下40倍的放大圖。
具體實施例方式本發(fā)明不受下述實施例的限制，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術(shù)方案和實際情況來確定具體的實施方式。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步描述
實施例1，該多菌發(fā)酵劑按下述原料重量份發(fā)酵得到，發(fā)酵菌與牛奶或脫脂牛奶的重量比為1 20至30，發(fā)酵菌為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、植物乳桿菌 (Lactobacillus ρIantarum) > Jfnf dr If lif (Lactobacillus, helveticus)、馬季L ？L 桿菌(Lactobacillus kefianofaciens)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、香腸乳桿菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)、單孢釀酒酵母 (Saccharomyces unisporus)> ^Tj(Issatchenkia oriental is)，"^胃禾中 tl、S]白勺
重量比為 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 1.0 至 1. 2: 0. 2 至 0. 4: 0. 2 至 0. 4。實施例2，該多菌發(fā)酵劑按下述原料重量份發(fā)酵得到，發(fā)酵菌與牛奶或脫脂牛奶的重量比為1 20至30，發(fā)酵菌為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、植物乳桿菌 (Lactobacillus ρIantarum) > Jfnf dr If lif (Lactobacillus, helveticus)、馬季L ？L 桿菌(Lactobacillus kefianofaciens)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、香腸乳桿菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)、單孢釀酒酵母 (Saccharomyces unisporus)> ^Tj(Issatchenkia oriental is)，lifft^fB] ^ 重量比為 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 0.8 或 1.0: 1.0 或 1.2: 0.2 或 0.4: 0.2 或 0.4。實施例3，與實施例1和實施例2的不同之處在于實施例3的多菌發(fā)酵劑按下述步驟得到首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌后，其次冷卻到42V至45°C加入所需要量的發(fā)酵菌，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵8小時至12小時得到多菌發(fā)酵劑。實施例4，與實施例1和實施例2的不同之處在于實施例4的多菌發(fā)酵劑按下述步驟得到首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌后，其次冷卻到42°C至45°C加入所需要量的發(fā)酵菌，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵8小時至12小時得到多菌發(fā)酵劑。實施例5，與實施例1至實施例4的不同之處在于實施例4在恒溫下發(fā)酵5小時至12小時時至少攪拌兩次。實施例6，該用于抗動脈粥樣硬化的多菌發(fā)酵乳品按下述原料發(fā)酵得到，按牛奶或脫脂牛奶總重量的3%至5%的比例添加上述實施例1至實施例5制得的多菌發(fā)酵劑。實施例7，該用于抗動脈粥樣硬化的多菌發(fā)酵乳品按下述原料發(fā)酵得到，按牛奶或脫脂牛奶總重量的3%或5%的比例添加上述實施例1至實施例5制得的多菌發(fā)酵劑。實施例8，與實施例6和實施例7的不同之處在于實施例8的多菌發(fā)酵乳品按下述步驟得到第一步，首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶加熱到50°C至60°C進行均質(zhì)后經(jīng)過巴氏殺菌，其次冷卻到40°C至45°C加入所需要量的多菌發(fā)酵劑，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵6小時至8小時；第二步，發(fā)酵結(jié)束后，在18°C至23°C恒溫下成熟72小時至120小時；第三步，勻速攪拌1. 5小時至2小時，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮1小時至2 小時；第四步，分離乳清在18°C至23°C下，經(jīng)滅菌濾布過濾，分別得到乳酪和乳清，該乳清為多菌發(fā)酵乳品。實施例9，與實施例1至實施例8的不同之處在于實施例9的牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌的操作參數(shù)為加熱90°C至95°C，保溫10分鐘至15分鐘殺菌。實施例10，與實施例1至實施例8的不同之處在于實施例10的牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌的操作參數(shù)為加熱90°C或95°C，保溫10分鐘或15分鐘殺菌。在本發(fā)明中％百分比都為重量百分比。上述實施例所得本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品的保健功能成分的試驗和藥效學試驗如下
下述試驗數(shù)據(jù)為上述實施例所得本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品試驗的平均數(shù)據(jù)。本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品的保健功能成分的分析 1. 1營養(yǎng)成分
1.1.1檢測方法和依據(jù)
蛋白質(zhì)用凱氏定氮儀測定，檢測依據(jù)GB/T5413. 1. 3-1997 ； 灰分按 GB/ T5009. 4-2003 測定； 水分按 GB/T5009. 3-2003 測定； 乳糖按 GB/T5413. 5-1997 測定； 按GB/T5413. 22-1997測定磷的含量
礦物質(zhì)用Avanta-PM型原子吸收分光光度計，按GB/ T5009. 14-2003測定鋅的含量； 按GB/T5009. 90-2003測定鐵和鎂的含量；按GB/T5009. 91，93-2003測定鈣和硒的含量；按 GB/ T5009. 91- 2003測定鉀和鈉的含量
氨基酸類用氨基酸自動分析儀按GB/T5009-2003測定； 脂肪酸用Sigma 115型氣相色譜儀按GB/T17377-1998測定。維生素類用1525泵系列高效液相色譜儀，按GB/T6195-1986測定維生素C的含量；按GB/T5009. 82-2003測定維生素AE的含量。1.1.2 結(jié)果
1. 1. 2. 1總蛋白及17種氨基酸含量測定
測定結(jié)果表明本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中總蛋白含量為1. 72%，總氨基酸含量為0. 734%， 其中含有9種人體必需的氨基酸(含嬰幼兒必需的組氨酸)，含量為0. 296%，占總氨基酸的比例40. 33%，與人乳(43. 0%)相近(見表1-1-2-1)。各氨基酸中，以絲氨酸的含量為最高， 為0.47%，其次為谷氨酸，含量為0. 14%。此外，脯氨酸(0.091%)、賴氨酸(0.056%)、亮氨酸 (0. 047%)、天門冬氨酸(0. 046%)含量也較高。2. 1. 2. 2本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中脂肪酸組成及含量
本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中脂肪構(gòu)成飽和脂酸(棕櫚酸、硬脂酸)含量為38. 7%，不飽和脂肪酸含量為61.3%，其中，單不飽和脂肪酸(芥酸未檢出)高達46. 0%，多不飽和脂肪酸為 15. 3%，結(jié)果見表 2-1-2-2。2. 1. 2. 3本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中碳水化合物含量
本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中主要碳水化合物_乳糖含量為5. 58%，高于牛奶，與羊乳相近。2. 1. 2. 4本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中礦物質(zhì)組成及含量
本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中礦物質(zhì)含量豐富，其中對人體有益的鉀元素含量最高，為246. 3 mg/100g，其次為鈣，含量為200. 2mg/100g，鎂18. 7 mg/100g，顯著高于其他乳類，鋅為0. 09 mg/100g，并且在本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中還有硒檢出為1.5Pg。結(jié)果見表2-1-2-4。2. 1. 2. 5本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中維生素組成及含量
本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中主要維生素含量中，維生素C和維生素B2含量較高，但低于其它乳類，結(jié)果見表2-1-2-5。2. 1. 3. 1 結(jié)果顯示
測定結(jié)果顯示本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中富含多種營養(yǎng)成分，總蛋白和氨基酸含量豐富， 如總蛋白含量為1. 72%，18種氨基酸中，9種人體必需的氨基酸(含嬰幼兒必需的組氨酸)含量為0. 30%,占總氨基酸的比例40. 33% ；各氨基酸中以絲氨酸的含量最高，為0. 47g/100g, 其次為谷氨酸為0. 14 g/100g。2. 1. 3. 2在脂肪酸分析中，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中單不飽和脂肪酸高達46. 0%
近期的許多研究證實，順式單不飽和脂肪在降低膽固醇方面的能力與多不飽和脂肪酸 (PUFA)相同，具有調(diào)節(jié)血脂作用、降膽固醇作用、降低氧化應激等多種生物學作用。本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中單不飽和脂肪酸含量很高，且絲氨酸含量也較高、對防治老年癡呆、高血脂等心腦血管疾病可能不失為一種好的選擇。2. 1. 3. 3本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中乳糖含量
本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中乳糖含量為5. 58%，高于牛奶，與羊乳相近。乳糖對于促進鈣的吸收，調(diào)節(jié)腸道環(huán)境具有良好功效。2.2益生菌檢測方法
對本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中發(fā)酵菌進行分離純化，然后結(jié)合形態(tài)學、生理生化特性和 16SrDNA、16SrRNA、26SrDNADl/D2區(qū)基因序列分析方法進行鑒定。結(jié)果從本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中分離到兩種有價值的微生物一類為乳酸菌，另一類為酵母菌；分別歸屬為短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、植物乳桿菌 (Lactobacillus ρIantarum)、Jfnf dr If lif (Lactobaci 1 lus. helveticus)馬？L ？LIf 菌(Lactobacillus kefianofaciens)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)禾口香腸乳桿菌(Lactobacillus farciminis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)；單孢釀酒酵母 (Saccharomyces unisporus)禾口東力·!^!^·(Issatchenkia orientalis)02.3 ACE抑制肽、抗氧化肽
方法通過對本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、2，2-二苯基-1-苦胼基自由基(DPPH ·)、羥自由基(· OH)和超氧陰離子自由基(02_ ·)的體外清除能力進行測定。結(jié)果研究證實本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品通過發(fā)酵菌的胞外蛋白酶，肽酶的水解作用， 乳蛋白中具有生理活性的肽片段釋放出來，例如ACE抑制肽、抗氧化肽等，詳見表2-3。結(jié)論ACE抑制肽是一類具有降血壓活性的多肽物質(zhì)，屬競爭性抑制劑，它們對 ACE活性區(qū)域的親和力大于血管緊張素I和緩激肽對ACE的親和力，并且它們一旦和ACE 活性區(qū)域結(jié)合，就難于釋放出來，從而阻礙血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II以及緩激肽分解為失活片段，達到降血壓功能。高血壓是引起動脈粥樣硬化的危險因素之一，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品能夠抗動脈粥樣硬化。本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品總抗氧化功能是由本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中各抗氧化組分的協(xié)同作用的結(jié)果，使較長期服用本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品的人能增強體質(zhì)和整體活力，延緩衰老。3.本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品藥效學試驗
3. 1本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品調(diào)節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化作用
3. 1. 1材料與方法
3. 1. 1. 1實驗動物與試劑
健康雄性新西蘭兔50只，體重(2士0. 05) kg，3個月齡，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心(合格證號SYXK新2003 - 0001)。膽固醇(分析純)、膽酸鈉均購于北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司，丙基硫氧嘧啶購于上海化學試劑公司，辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司)。ICAM-I試劑盒為ADL (No. QRCT_3103223EIA\UTL)產(chǎn)品，VCAM-I定量酶聯(lián)檢測試劑盒購于上海森雄科技實業(yè)有限公司，用本發(fā)明實施例1至實施例10所得的多菌發(fā)酵乳品來做試驗。3. 1. 1. 2新西蘭兔動脈粥樣硬化模型的建立
健康新西蘭兔50只，雌雄各半，體重2kg左右，隨機分為正常組(喂飼普通顆粒飼料)，動粥模型組、陽性對照組、本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小劑量組和本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中劑量組。除正常組外，其余各組采用高脂顆粒飼料。高脂顆粒飼料喂養(yǎng)8w后，正常組及動粥組給純凈水作對照，實驗組給予本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品，即本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品的用量按照人和動物體表面積折算的等效劑量的比值表計算，中劑量組給予本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品50mg · kgl，小劑量組給予本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品25mg · kgl，陽性對照組給予辛伐他汀 20mg*kgl，共28d。全程實驗第87d，最后一次灌胃后6h，戊巴比妥麻醉新西蘭兔，腹主動脈插管取血，測定各種指標。3. 1. 1.3各種指標的測定
3. 1. 1. 3. 1血脂與肝組織勻漿脂質(zhì)全程實驗第87天，戊巴比妥麻醉新西蘭兔，腹主動脈插管取血，取肝右葉lg，4 °C以0. 9%生理鹽水制成10 %的勻漿，離心15min，留取上清液，用貝克曼自動生化儀測定血清及肝組織勻漿總膽固醇(Tc)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量，血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)由換算得。3.1.1.3.2體重與肝系數(shù)及C-反應蛋白在喂予高脂飼料前、12w后及麻醉前各稱重一次，計算兔體重增長情況，處死兔后，稱取肝臟重量，肝系數(shù)為肝臟重量與兔體重之比。散射測濁法(速率法)速率散射法應用Beckman Coulter Image測定血清高敏C-反應蛋白含量。3. 1. 1. 3. 3 ICAM和VCAM含量的測定全程實驗第87天，戊巴比妥麻醉新西蘭兔， 腹主動脈插管取血，離心15min，留取血清，VCAM-I的測定采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。 用抗人sVCAM-1與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人sVCAM-1抗體，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物標記的Sti^ptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物0PD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測OD值，sVCAM-Ι濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中sVCAM-Ι濃度。定量根據(jù)酶聯(lián)檢試劑盒要求測定其含量
3. 1. 1. 3. 4免疫組織化學動脈組織石蠟切片-20°C丙酮固定5 min，然后按照免疫組織化學ABC法進行組織染色，一抗采用抗兔VCAM- 1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司提供，1 200稀釋)。用DAB顯色，蘇木精襯染，封片后在顯微鏡下觀察。另設 PBS陰性對照組。胞膜或胞漿處有棕黃色或棕褐色顆粒狀物質(zhì)，呈網(wǎng)格狀或環(huán)狀沉淀者為陽性細胞。在高倍顯微鏡下(10X40)任選5個視野進行陽性細胞百分數(shù)計數(shù)，求平均值。3. 1.2統(tǒng)計學處理
數(shù)據(jù)以表示，各組間均
數(shù)比較首先進行方差齊性檢驗，如結(jié)果滿足方差齊性，則采用單因素方差分析或t檢驗方法，如不滿足方差齊性，則采用秩轉(zhuǎn)換檢驗方法。全部過程均通過SPSS11. 5統(tǒng)計分析軟件進行，以P < 0. 05作為差異具有統(tǒng)計學意義的界限。3.1.3.實驗結(jié)果
3. 1. 3. 1.本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品對實驗性動脈粥樣硬化兔血脂的影響動粥模型組與正常組相比，血清膽固醇值、甘油三酯值及低密度脂蛋白水平升高。本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中、小劑量組及辛伐他汀組(20 mg-kgl)的膽固醇(Tc)水平降低，LDL-C 水平降低；TG水平降低。動粥模型組、辛伐他汀組、本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小劑量組、本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中劑量組及與正常組比較均可升高HDL—C，差異有統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表 3-1-3-1。3. 1. 3. 2本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品對實驗性動脈粥樣硬化兔體重、肝指數(shù)和C反應蛋白的影響。與正常組相比，動粥模型組C反應蛋白含量升高，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品25 mg.kgU50 mg*kgl組和辛伐他汀組顯著降低。肝指數(shù)、體重無統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表 3-1-3-2。3. 1. 3. 3對實驗性動脈粥樣硬化兔動脈病理的影響
肉眼觀察，見正常家兔主動脈內(nèi)膜光滑，未見粥樣斑塊形成。顯微鏡下正常組(圖1、圖 2)血管壁三層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜光滑完整，平滑肌細胞排列整齊。動粥模型組(圖3、圖4)家兔血管壁彌漫性隆起，突向管腔，內(nèi)膜不完整，并有粥樣斑塊形成。主動脈內(nèi)膜增厚尤為明顯，內(nèi)膜和中膜均可見大量泡沫細胞和少量的纖維母細胞，平滑肌細胞排列紊亂。大部分冠狀動脈形成典型動脈粥樣硬化病變，心肌組織脂質(zhì)沉積較嚴重。辛伐他汀組(圖5、圖6)內(nèi)膜和中膜均可見泡沫細胞，但未見粥樣斑塊形成，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品兩個劑量組(圖7至圖10)內(nèi)膜完整，內(nèi)膜和中膜可見少量泡沫細胞，但未見粥樣斑塊形成。3. 1.3.4免疫組織化學檢測
正常組(圖11、圖12)兔冠狀動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細胞胞漿未見黃染，動粥模型組(圖 13、圖14)內(nèi)膜內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞胞漿有明顯棕黃色顆粒，陽性細胞面積的百分比為(30. 12士9. 95)%，陽性對照組動脈內(nèi)皮有少量ICAM-I表達，陽性細胞面積的百分比為 (2. 77士0. 53)%，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小、中劑量組(圖17-20)可見內(nèi)皮細胞膜染色，內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒很少，主要在內(nèi)皮細胞外表達，陽性細胞面積的百分比為分別是 (6. 46士 1. 55)%,(2. 49士0. 53)%，動粥模型組與給藥各組相比差異均有顯著性(P < 0. 01)。 ICAM-I和VCAM-I定量則根據(jù)酶聯(lián)檢試劑盒要求測定，結(jié)果見表3_1_3_4及圖11至圖20。在本實驗通過給予兔12w高脂飲食，血清TC、TG、LDL_C含量和CRP水平顯著升高， 成功建立動脈粥樣硬化新西蘭兔模型。實驗數(shù)據(jù)與文獻報道相附。本實驗結(jié)果顯示本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品能明顯降低血清TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C水平，明顯降低血清CRP水平。本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品能明顯降低血清ICAM-I和VCAM-I含量，免疫組化結(jié)果可見動粥模型組ICAM-I在兔冠狀動脈斑塊病灶內(nèi)的細胞、內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞均有的表達。 在粥樣斑塊脫落時，ICAM-I在腔面內(nèi)皮表達呈最低水平或消失，主要以平滑肌細胞表達為主，給藥各組VCAM-I表達最多在內(nèi)皮細胞表面，細胞漿中較少。病理組織學結(jié)果也可見，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品兩劑量組，內(nèi)皮細胞尚完整，可見少量泡沫細胞，粥樣硬化斑塊明顯減小，血管壁纖維化程度輕，炎性細胞少。TFCE中、小劑量組具有調(diào)節(jié)血脂及減少粘附分子表達，提示本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品抗實驗性動脈粥樣硬化作用與其內(nèi)皮保護作用及抗炎作用有關(guān)。3. 2細胞內(nèi)皮保護作用 3. 2. 1材料與方法
3. 2. 1. 1實驗動物與試劑
健康雄性SD大鼠50只，體重(200士 10) g，3個月齡，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心 (合格證號:SYXK 新 2003 — 0001)。用本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品直接給藥。3. 2. 1. 2大鼠動脈粥樣硬化模型的建立
SD大白鼠動脈粥樣硬化模型的建立健康SD大白鼠50只，雌雄各半，體重200g左右，3個月齡，隨機分為正常組(喂飼普通顆粒飼料)，動粥模型組、陽性對照組、本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小劑量組、本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中劑量組及本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品大劑量組。除正常組外，其余各組采用高脂乳劑灌胃.同時在高脂乳劑灌胃開始一周后，一次性腹腔注射維生素D3 60萬IU*kgl。喂食高脂乳劑4周后，正常組及動粥組給純凈水作對照，實驗組給予本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品，即本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品的用量按照人和動物體表面積折算的等效劑量的比值表計算，大劑量組給予本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品IOOmg · kgl，中劑量組給予本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品50mg · kgl，小劑量組給予本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品25mg · kglg，陽性對照組給予辛伐他汀20mg · kglg，每天下午共灌胃給藥共28d。全程實驗第57d，最后一次灌胃后6h，戊巴比妥麻醉大鼠，頸動脈插管取血，測定各種指標。3. 2. 1.3各種指標的測定
TC、TG、HDL-C, LDL-C ；放射免疫法測定內(nèi)皮素(ET)、血栓烷B2 (TXB2)、腫瘤壞死因子 (TNF-α )、白細胞介素一 8 (IL-8) 3. 2. 2實驗結(jié)果
3. 2. 2. 1本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品對實驗性動脈粥樣硬化大鼠血脂的影響動粥模型組與正常組相比，血清膽固醇值、三酰甘油值及低密度脂蛋白水平升高。本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品大、中、小劑量組及辛伐他汀組(20mg/kg)的膽固醇(TCH)水平降低， LDL-C水平降低；TG水平降低，動粥模型組與正常組及各給藥組均對高密度脂蛋白水平無影響，差異沒有統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表3-2-2-1。
3. 2. 2. 2本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品對實驗性動脈粥樣硬化大鼠內(nèi)皮功能的影響。 動粥模型組中內(nèi)皮素(ET)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)及白細胞介素-8 ( IL-8)等炎性因子均高于正常組，辛伐他汀組可顯著降低ET、TNF_a、IL_8的水平，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小劑量組可顯著降低ET、IL-8的水平，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品大劑量組可顯著降低IL-8及 TNF-α的水平，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中劑量組可顯著降低ET、IL-8的水平。本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小劑量組在降低ET方面效果優(yōu)于辛伐他汀組的。本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品各劑量組對 TXB2沒有統(tǒng)計學意義。結(jié)果見表3-2-2-2。實驗證明喂食膽固醇可引起高脂血癥，損傷血管內(nèi)皮，內(nèi)皮損傷或血清膽固醇水平過高導致典型粥樣硬化病變。本實驗通過高脂飲食及注射大劑量維生素D3，造成內(nèi)皮損傷，成功建立動脈粥樣硬化大鼠模型。實驗數(shù)據(jù)與文獻報道相附。本實驗結(jié)果顯示本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品能明顯降低血清Tch、TG、LDL-C含量，升高HDL-C水平，有利于將膽固醇送到肝臟代謝分解，抑制細胞攝入LDL-C，緩解AS。本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品組與陽性對照藥辛伐他汀比較，在降低血清膽固醇、降低C反應蛋白含量方面有優(yōu)勢。3. 3抗炎、抗氧化作用 3. 3. 1材料與方法
動物健康雄性SD大鼠100只，體重(200 士 10) g，3個月齡，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心(合格證號SYXK新2003-0001)。藥物阿司匹林(新疆西域藥業(yè)股份有限公司)，布洛芬(湖北百科亨迪藥業(yè)有限公司)，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品(來自本發(fā)明的實施例1至實施例10所得的本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品即 TFCW)。角叉菜膠致小鼠足腫脹模型的制備50只小鼠，隨機分為4組，鹽水對照組，阿司匹林陽性對照組(15mg · kg-1)，TFCW小、中劑量組(25，50 mg · kg_l)。各組動物每天灌胃給藥，共7d。于末次給藥后Ih在每只小鼠右后肢皮下注射1%角叉菜膠混懸液0. 11 m L 致炎，并分別在致炎后lh、2h、3h和4h用游標卡尺測右足腫脹程度(足腫脹度=致炎后足周徑_致炎前足周徑)，計算抑制率。大鼠棉球肉芽腫形成模型的制備40只大鼠，隨機分為4組，每組10只。各組動物戊巴比妥鈉麻醉，無菌操作下在大鼠腋下植入棉球(每個棉球重20 mg，高壓滅菌后，60 °〇烤箱烘干)，分組及給藥同上，然后各組動物分別灌胃給藥，連續(xù)10d，dll，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取出棉球，剝離肉芽組織，置60 ！烤箱烤至恒重。肉芽腫干重=植入棉球肉芽腫重量-植入棉球重量。按照下式計算肉芽腫形成抑制率。抑制率？%=鹽水組棉球肉芽腫重量 (mg)-給藥組棉球肉芽腫重量(mg)/鹽水組棉球肉芽腫重量(mg) X 100%。角叉菜膠致大鼠氣囊滑膜炎模型的制備40只大鼠分4組生理鹽水對照組、布洛芬組、TFCW小劑量組、TFCW中劑量組。于實驗dl在各組大鼠背部皮下注射經(jīng)過濾器過濾的空氣20ml，使大鼠背部形成氣囊，待d3在原氣囊處再注射經(jīng)過濾器過濾的空氣20ml，同時于當天各組大鼠開始分別灌胃給藥，即給予生理鹽水lml/100g，布洛芬組15mg -kg-1,TFCff 小、中劑量組25，50mg · kg-1，連續(xù)給藥7d。實驗d8在各組大鼠背部皮下注射經(jīng)過濾器過濾的空氣IOml后，再在氣囊內(nèi)注射2%角叉菜膠2ml致炎。在致炎24h后，采靜脈血，并將大鼠處死，用Hank’ s液Iml灌洗氣囊，收集灌洗液，離心，分別收集上清液，供各項指標測定。滲出液中WBC測定行常規(guī)涂片法白細胞計數(shù)連續(xù)觀察3 5個10X40視野，取平均值；采用散射測濁法(速率法)，速率散射法應用Beckman Coulter Immage測定血清hs_CRP 含量?？寡趸饔玫臏y定利用上述角叉菜膠致大鼠氣囊滑膜炎慢性炎癥模型，在致炎 24h后，采靜脈血，并將大鼠處死，根據(jù)總抗氧化能力測定試劑盒說明，采用比色法測定總總抗氧化能力，丙二醛(MDA)的測定采用TBA法。3. 3. 2 結(jié)果
3. 3. 2. 1本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品對角叉菜膠致小鼠足腫脹的影響與生理鹽水組比較，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小、中劑量組和阿司匹林組(除外阿司匹林組致炎后2 h)，在致炎后lh、2h、3h、4h各時間段，腫脹度均明顯減輕，特別是本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小劑量組的足腫脹度顯著減輕，結(jié)果見表3-3-2-1。
3.3.2.2對大鼠棉球肉芽腫形成的影響
與生理鹽水組比較，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小、中劑量組及布洛芬組的棉球肉芽腫干重均顯著降低，且給藥各組與布洛芬組比較無顯著差異。布洛芬組對肉芽腫形成的抑制率為24. 17%，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小、中劑量組對肉芽腫形成的抑制率分別為17. 11%和 17. 18%。與生理鹽水組比較，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小、中劑量組及布洛芬組對大鼠體重的影響，無統(tǒng)計學意義，結(jié)果見表3-3-2-2。3. 3. 2. 3本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品對角叉菜膠致大鼠氣囊滑膜炎模型滲出液體量的影響，見表3-3-2-3。與鹽水組比較，布洛芬組及本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品劑量組小、中、大劑量組對角叉菜膠致大鼠氣囊滑膜炎的滲出液體量有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義。
3. 5 本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品對角叉菜膠致大鼠氣囊滑膜炎血清中hs-CRP、總氧化能力和MDA的影響。與鹽水組比較，布洛芬組、本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品小劑量和中劑量組對氣囊滑膜炎大鼠血清中CRP有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義。與模型組比較，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品50mg. kg—1組顯著提高角叉菜膠致氣囊滑膜炎大鼠的血清中總抗氧化能力，差異有統(tǒng)計學意義0°值為0. 047)，陽性組布洛芬組對血清中總抗氧化能力無明顯影響Gd值為0. 231)。 與模型組比較，本發(fā)明多菌發(fā)酵乳品中、小劑量組對角叉菜膠致氣囊滑膜炎的大鼠血清中MDA的含量有顯著抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義Gd值分別為0. 019,0. 048)，但各組之間差異無統(tǒng)計學意義0°>0. 05)。而陽性對照布洛芬組則對MDA的含量無明顯影響Od 值分別為0. 197)。結(jié)果見表3-5。
權(quán)利要求
1.一種多菌發(fā)酵劑，其特征在于按下述原料重量份發(fā)酵得到，發(fā)酵菌與牛奶或脫脂牛奶的重量比為1 20至30，發(fā)酵菌為短乳桿菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌、 干酪乳桿菌、香腸乳桿菌、乳酸乳球菌、單孢釀酒酵母、東方伊薩酵母，各菌種之間的重量比為 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 0.8 至 1.0: 1.0 至 1.2: 0. 2 至 0. 4: 0. 2 至 0. 4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌發(fā)酵劑，其特征在于按下述步驟得到首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌后，其次冷卻到42°C至45°C加入所需要量的發(fā)酵菌，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵8小時至12小時得到多菌發(fā)酵劑。
3.種根據(jù)權(quán)利要求2所述的多菌發(fā)酵劑，其特征在于恒溫下發(fā)酵5小時至12小時時至少攪拌兩次。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)方法，其特征在于按下述步驟進行 首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌后，其次冷卻到42°C至45°C加入所需要量的發(fā)酵菌，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵8小時至12小時得到多菌發(fā)酵劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)方法，其特征在于恒溫下發(fā)酵5小時至12 小時時至少攪拌兩次。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的多菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)方法，其特征在于牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌的操作參數(shù)為加熱90°C至95°C，保溫10分鐘至15分鐘殺菌。
7.一種利用權(quán)利要求1或2或3所述的多菌發(fā)酵劑的用于抗動脈粥樣硬化的多菌發(fā)酵乳品，其特征在于按下述原料發(fā)酵得到，按牛奶或脫脂牛奶總重量的3%至5%的比例添加上述制得的多菌發(fā)酵劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多菌發(fā)酵乳品，其特征在于按下述步驟得到第一步，首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶加熱到50°C至60°C進行均質(zhì)后經(jīng)過巴氏殺菌，其次冷卻到 40°C至45°C加入所需要量的多菌發(fā)酵劑，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵6小時至8小時； 第二步，發(fā)酵結(jié)束后，在18°C至23°C恒溫下成熟72小時至120小時；第三步，勻速攪拌1. 5 小時至2小時，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮1小時至2小時；第四步，分離乳清在 18°C至23°C下，經(jīng)滅菌濾布過濾，分別得到乳酪和乳清，該乳清為多菌發(fā)酵乳品。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求7所述的多菌發(fā)酵乳品的生產(chǎn)方法，其特征在于按下述步驟進行第一步，首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶加熱到50°C至60°C進行均質(zhì)后經(jīng)過巴氏殺菌，其次冷卻到40°C至45°C加入所需要量的多菌發(fā)酵劑，然后在40°C至45°C恒溫下發(fā)酵6 小時至8小時；第二步，發(fā)酵結(jié)束后，在18°C至23°C恒溫下成熟72小時至120小時；第三步，勻速攪拌1. 5小時至2小時，抽提脂肪，剩余部分在50°C至60°C煮1小時至2小時；第四步，分離乳清在18°C至23°C下，經(jīng)滅菌濾布過濾，分別得到乳酪和乳清，該乳清為多菌發(fā)酵乳品。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多菌發(fā)酵乳品的生產(chǎn)方法，其特征在于牛奶或脫脂牛奶經(jīng)過巴氏殺菌的操作參數(shù)為加熱90°C至95°C，保溫10分鐘至15分鐘殺菌。
全文摘要
一種多菌發(fā)酵劑和用于抗動脈粥樣硬化的多菌發(fā)酵乳品及其生產(chǎn)方法，該多菌發(fā)酵乳品按下述步驟得到第一步，首先將所需要量的牛奶或脫脂牛奶加熱到50℃至60℃進行均質(zhì)后經(jīng)過巴氏殺菌，其次冷卻到40℃至45℃加入所需要量的多菌發(fā)酵劑，然后在40℃至45℃恒溫下發(fā)酵6小時至8小時；第二步，發(fā)酵結(jié)束后，在18℃至23℃恒溫下成熟72小時至120小時；第三步，勻速攪拌1.5小時至2小時，抽提脂肪，剩余部分在50℃至60℃煮1小時至2小時；第四步，分離乳清在18℃至23℃下，經(jīng)滅菌濾布過濾，分別得到乳酪和乳清，該乳清為多菌發(fā)酵乳品。本發(fā)明易操作、生產(chǎn)方法簡單，所得多菌發(fā)酵乳品營養(yǎng)豐富，含有益生菌、ACE抑制肽、抗氧化肽等成份，具有抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗氧化等作用，能調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，延緩人的衰老。
文檔編號C12R1/25GK102286397SQ20111014929
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者劉紅梅, 古麗孜婭·卡克巴依, 拉提帕·艾爾肯, 新華·那比, 沙依拉·哈馬力拜, 王曉杰, 馬春燕 申請人:新疆醫(yī)科大學