專利名稱：利用減毒傷寒沙門(mén)菌遞送的hbv-熱休克蛋白70融合基因疫苗及制法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用減毒傷寒沙門(mén)菌遞送的HBV突變型preC/C基因疫苗和一種HBV-熱休克蛋白70融合基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用，具體為利用減毒傷寒沙門(mén)菌遞送的一種HBV突變型preC/C基因疫苗、一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗和一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗及其制備方法和應(yīng)用，屬于乙肝疫苗的設(shè)計(jì)制造及免疫效果檢測(cè)的生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
慢性乙型肝炎嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，目前尚無(wú)特效治療手段。乙肝病毒(HBV)感染人體后發(fā)生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，不能清除體內(nèi)病毒。由于DNA疫苗在誘導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已作為針對(duì)慢性乙肝 具有潛力的免疫治療手段被廣泛研究。目前乙肝DNA疫苗研究的焦點(diǎn)在于(I)如何誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的特異性細(xì)胞免疫，以達(dá)到抑制或消滅病毒、治療乙肝的目的；(2)改良接種方式，易于為患者接受。使用分枝桿菌熱休克蛋白70羧基端(HSP70c)或T細(xì)胞刺激表位(HSP70t)基因構(gòu)建融合基因疫苗可以起到佐劑的作用，同時(shí)減少機(jī)體針對(duì)HSP70的免疫應(yīng)答。利用攜帶DNA質(zhì)粒的減毒傷寒沙門(mén)菌口服，可直接將DNA質(zhì)粒遞送至抗原呈提細(xì)胞，極大提高DNA疫苗的利用率，同時(shí)口服的免疫方式安全方便，易于為患者接受。本發(fā)明針對(duì)熱休克蛋白融合基因疫苗和利用減毒傷寒沙門(mén)菌遞送DNA疫苗的諸多特性和優(yōu)點(diǎn)，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和手段對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種以HBV突變型preC/C基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建的重組HBV DNA疫苗(VC)、一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建的重組HBV DNA疫苗(VCC)和一種以HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因?yàn)槟康幕驑?gòu)建的重組HBV DNA疫苗(VCT)。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌(SVC)、一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌(SVCC)和一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌(SVCT)。首先將目的基因使用真核表達(dá)載體，構(gòu)建質(zhì)粒，然后采用電轉(zhuǎn)化的方法，轉(zhuǎn)化減毒傷寒沙門(mén)菌SL7207，得到攜帶目的基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌、一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌和一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌用于乙型肝炎的預(yù)防和治療。該重組減毒傷寒沙門(mén)菌能有效誘導(dǎo)特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，可用于乙型肝炎的預(yù)防和治療。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種HBV突變型preC/C基因疫苗(VC)，其包括HBV突變型preC/C基因(簡(jiǎn)稱preC/C)，該目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體為VR1012。所述的HBV突變型preC/C基因是HBVpreC/C基因經(jīng)人工引入4個(gè)點(diǎn)突變，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示。一種構(gòu)建HBV突變型preC/C基因疫苗(VC)的方法，其步驟如下首先以含有HBV突變型preC/C基因的質(zhì)粒VEC4為模板，用PCR擴(kuò)增出HBV突變型preC/C基因序列，無(wú)終止密碼子，連入T-Easy載體，再通過(guò)雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達(dá)載體VR1012，克隆篩選得到HBV突變型preC/C基因疫苗無(wú)終止密碼子質(zhì)粒，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示。
一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因疫苗，其包括HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因，該目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體為VR1012。所述的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因是HBV突變型preC/C_熱休克蛋白70羧基端融合基因(簡(jiǎn)稱preC/C-HSP70c)。即一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗(VCC)，其包括HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，該目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體為VR1012。真核細(xì)胞表達(dá)載體VR1012上插入核苷酸序列的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因。一種構(gòu)建HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗(VCC)的方法，其步驟如下首先以含有HBV突變型preC/C基因的質(zhì)粒VEC4為模板，用PCR擴(kuò)增出HBV突變型preC/C基因序列，無(wú)終止密碼子，連入T-Easy載體，再通過(guò)雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達(dá)載體VR1012，克隆篩選得到HBV突變型preC/C基因疫苗無(wú)終止密碼子質(zhì)粒，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示；再以含有分枝桿菌熱休克蛋白70基因的質(zhì)粒PT-HSP70為模板，PCR擴(kuò)增熱休克蛋白70羧基端基因，連入T-Easy載體，再通過(guò)雙酶切及再連接將目的基因連入HBV突變型preC/C基因疫苗無(wú)終止密碼子質(zhì)粒，克隆篩選得到HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗質(zhì)粒。所述的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因是HBV突變型preC/C_熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因(簡(jiǎn)稱preC/C-HSP70t)。即一種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗(VCT)，其包括HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，該目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體為VR1012。真核細(xì)胞表達(dá)載體VR1012上插入核苷酸序列的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因。一種構(gòu)建HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗(VCT)的方法，其步驟如下首先以含有HBV突變型preC/C基因的質(zhì)粒VEC4為模板，用PCR擴(kuò)增出HBV突變型preC/C基因序列，無(wú)終止密碼子，連入T-Easy載體，再通過(guò)雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達(dá)載體VR1012，克隆篩選得到HBV突變型preC/C基因疫苗無(wú)終止密碼子質(zhì)粒，其核苷酸序列如序列表中的序列I所示；再以含有分枝桿菌熱休克蛋白70基因的質(zhì)粒pT-HSP70為模板，PCR擴(kuò)增熱休克蛋白70T細(xì)胞表位基因，連入T-Easy載體，再通過(guò)雙酶切及再連接將目的基因連入HBV突變型preC/C基因疫苗無(wú)終止密碼子質(zhì)粒，克隆篩選得到HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗質(zhì)粒。一種攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌(SVC)，其穩(wěn)定攜帶如上所述的HBV突變型preC/C基因疫苗VC。一種攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVC的構(gòu)建方法，其步驟如下使用電轉(zhuǎn)化儀，將HBV突變型preC/C基因疫苗VC轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門(mén)菌SL7207，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶VC的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVC。一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌(SVCC)，其穩(wěn)定攜帶如上所述的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗 VCC。一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVCC的構(gòu)建方法，其步驟如下使用電轉(zhuǎn)化儀，將HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70 羧基端融合基因疫苗VCC轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門(mén)菌SL7207，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶VCC的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVCC。一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌(SVCT)，其穩(wěn)定攜帶如上所述的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗VCT。一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVCT的構(gòu)建方法，其步驟如下使用電轉(zhuǎn)化儀，將HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗VCT轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門(mén)菌SL7207，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶VCT的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVCT?；诖?，本發(fā)明人設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌、一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌和一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌，用于乙型肝炎的防治。DNA疫苗載體選用質(zhì)粒VR1012，為美國(guó)FDA已批準(zhǔn)用于人體基因治療的真核細(xì)胞表達(dá)載體，我國(guó)FDA近期也批準(zhǔn)其作為HIV DNA疫苗載體用于人體，其具有多克隆位點(diǎn)包括Pst I和BamH I等，含有CMV啟動(dòng)子，卡那霉素抗性基因等。DNA疫苗遞送載體選擇減毒傷寒沙門(mén)菌SL7207，傷寒沙門(mén)菌株SL7207是aroA基因突變株，aroA編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，該酶催化2，4- 二羥基苯甲酸鹽的分支酸途徑的中間反應(yīng)，產(chǎn)生芳香族氨基酸。而哺乳動(dòng)物不具備該合成途徑，故細(xì)菌從宿主體內(nèi)獲得這些化合物的可能性極小，使得aroA突變株在體外培養(yǎng)時(shí)依賴上述化合物生長(zhǎng)，但在宿主體內(nèi)只能有限生長(zhǎng)繁殖從而得到減毒。應(yīng)用該類(lèi)重組減毒傷寒沙門(mén)菌作為疫苗遞送載體，具有如下優(yōu)點(diǎn)①具有培養(yǎng)簡(jiǎn)便、繁殖迅速等優(yōu)越性；②可口服或鼻飼接種，方法簡(jiǎn)單無(wú)痛苦該疫苗株在體內(nèi)產(chǎn)生的靶抗原的傳送無(wú)需附加任何免疫佐劑；④將疫苗直接遞送于抗原呈提細(xì)胞，極大提高疫苗生物利用率；⑤該類(lèi)菌株可較長(zhǎng)時(shí)間定居于腸相關(guān)淋巴組織，持續(xù)表達(dá)外源抗原，增強(qiáng)免疫原性，并可產(chǎn)生強(qiáng)大的黏膜免疫反應(yīng)；⑥通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)便于構(gòu)建成多價(jià)疫苗，易被接種人群接受；⑦一次免疫后在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)有效免疫用疫苗無(wú)需在體外產(chǎn)生、分離、純化和鑒定對(duì)四環(huán)素敏感，如發(fā)生嚴(yán)重副作用可以用四環(huán)素控制。分別用VR1012 (對(duì)照組)、VC、VCC和VCT于0、7、14、21天肌注方式免疫BALB/C小鼠，同時(shí)分別用攜帶VR1012的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SV(對(duì)照組)、SVC、SVCC和SVCT于O、7、14、21天灌胃方式免疫Balb/c小鼠。每次免疫前I天割尾取血分離血清行抗體效價(jià)測(cè)定，免疫結(jié)束后(第28天)取小鼠脾細(xì)胞用ELISpot方法檢測(cè)特異性細(xì)胞免疫功能，證實(shí)6種疫苗(VC、VCC、VCT、SVCC^PSVCT)均能引發(fā)特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明改建了 HBV DNA-熱休克蛋白70融合基因疫苗，同時(shí)改良了 DNA疫苗接種方法，采用口服減毒傷寒沙門(mén)菌的方式遞送DNA疫苗。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，SVC、SVCC組和SVCT組使小鼠肽刺激脾淋巴細(xì)胞中Y干擾素產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)增多，與對(duì)應(yīng)的VC、VCC組和VCT組相當(dāng)。上述結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建的攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVC、攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVCC和攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVCT確實(shí)能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生不錯(cuò)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
下面通過(guò)附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但并不意味著對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。


圖I為突變型HBV preC/C基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為熱休克蛋白70羧基端基因和熱休克蛋白70T細(xì)胞表位基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為pGEM-T Easy/HBV preC/C PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。圖4 為 pGEM-T Easy/HSP70c PCR 產(chǎn)物重組質(zhì)粒和 pGEM-T Easy/HSP70tPCR 產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。圖5為重組質(zhì)粒VC酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。圖6為重組質(zhì)粒VCC、VCT酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析。圖7為各重組減毒傷寒沙門(mén)菌提取質(zhì)粒酶切結(jié)果。圖8為重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVC提取質(zhì)粒酶切結(jié)果。圖9為各組小鼠ELISpot檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞IFN-Y代表圖，其中圖9_1至圖9_10依次為VR1012、VC、VCC、VCT、SV、SVC、SVCC, SVCT組、陽(yáng)性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔的代表圖。
具體實(shí)施例方式菌株、細(xì)胞、試劑及實(shí)驗(yàn)器材限制性核酸內(nèi)切酶NEB公司LA Taq酶，T4 DNA連接酶寶生物公司pGEM-T Easy 載體Promega 公司X-gal、IPTG鼎國(guó)公司質(zhì)粒小量提取試劑盒博大泰克生物公司DNA膠回收、純化試劑盒Qiagen公司DNA Marker (Trans 2K plusDNA marker)全式金公司質(zhì)粒大量提取試劑盒Qiagen公司
卡那霉素鼎國(guó)生物公司感受態(tài)Trans Tl菌博大泰克生物公司其余常用生化試劑(國(guó)產(chǎn)分析純)上海華美生物公司等!fepG2細(xì)胞三〇二醫(yī)院病毒研究室保存DMEM、RPMI 1640北京鈕因華信公司胎牛血清GIBICO公司轉(zhuǎn)染試劑-LipofectinInvitrogin 公司6孔細(xì)胞培養(yǎng)板美國(guó)Becton Dickinson Labware公司 IOml細(xì)胞培養(yǎng)瓶北京小鼠淋巴細(xì)胞分離液達(dá)科為公司小鼠IFN- Y ELISpot檢測(cè)試劑盒MABTECH公司流式抗體BD公司HBeAg、HBeAb、HBcAb ELISA檢測(cè)試劑盒北京科衛(wèi)診斷試劑公司其余常用生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純上海華美公司等主要儀器MJMini PCR 擴(kuò)增儀美國(guó) Bio-Rad 公司LG15-W高速微量離心機(jī)北京低溫高速離心機(jī)日本HITACHI公司PH 儀Hanna 公司Gene-Ρ μ Iser 和 Gene-Ρ μ Ise-Controller美國(guó) Bio-Rad 公司DYY-III型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠THZ-C電熱恒溫?fù)u床江蘇太倉(cāng)儀器廠超凈工作臺(tái)北京哈東聯(lián)設(shè)備廠SmartSpec Plus分光光度計(jì)美國(guó)Bio-Rad公司⑶2恒溫孵箱德國(guó)Heraeus公司BHC-1360II A2型超凈工作臺(tái)北京哈東聯(lián)儀器公司LD5-2A離心機(jī)北京通用離心機(jī)廠C02恒溫孵箱德國(guó)Heraeus公司超凈工作臺(tái)北京哈東聯(lián)ELlSpot酶聯(lián)斑點(diǎn)分析儀北京賽智創(chuàng)業(yè)公司680 型 ELISA 讀板機(jī)BI0-RAD 公司ZMX-988B全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)北京天石醫(yī)療用品制作所實(shí)施例I. HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗和HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗的構(gòu)建I、PCR擴(kuò)增獲得所需基因(I)PCR擴(kuò)增獲得HBV突變型preC/C基因以質(zhì)粒VEC4作為模板，分別以上游引物 CF:5’ -CTGCAG IATGl CAACTTTTTCACCTC-3 (Pst I)，下游引物 CRl :5’ -TCTAGA jTCA丨ACATTGAGATTCCCGAGA-3’ (Xba I)或 CR2:5， - TCTAGAACATTGAGATTCCCGAGA-3， (Xba I )為引物，采用PCR方法擴(kuò)增模板I μ I、引物(25μ Μ)各2μ l、10mM dNTP 2μ 1U0XPCRBuffer 5 μ I, LA Taq 酶 0· 5 μ I、H2O 37. 5 μ L，反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min — 94°C變性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)一72°C延伸lOmin。如圖I所示，為突變型HBVpreC/C基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，獲得的PCR產(chǎn)物HBV突變型preC/C基因(含或者不含終止密碼子)片段，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小約640bp，符合預(yù)期長(zhǎng)度，圖I左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為HBV突變型preC/C基因片段。(2) PCR擴(kuò)增獲得熱休克蛋白70羧基端基因和熱休克蛋白70T細(xì)胞表位基因以質(zhì)粒 pT-mtHSP70 為模板，分別以引物 HSPF :5’ - TCTAGA (GGAGGAGGAGGAAGT) 3GAGGTGAAAGAC
GTT-3’ (Xba I)+HSPRl :5，-GGATCC jTCA! CTTGGCCTCCCGGC-3，(BamH I)和 HSPF+HSPR2 :5’_
GGATCCItcaIAATGCCGTTGGCGTCG-3，(BamH I)為引物，PCR 擴(kuò)增模板 2. 5 μ I、引物(25 μ Μ)各 2μ IUOmM dNTP 2 μ 1U0XPCR Buffer 5 μ I、LA Taq 酶 O. 5 μ I、H2O 36 μ 1，反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性 5min — 94°C 變性 lmin，57°C 退火 lmin，72°C 延伸 2min，共 10 個(gè)循環(huán)一94°C變性lmin，62°C退火lmin，72°C延伸2min，共25個(gè)循環(huán)一72°C延伸lOmin。如圖2所示，為熱休克蛋白70羧基端基因和熱休克蛋白70T細(xì)胞表位基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，獲 得的PCR產(chǎn)物熱休克蛋白70羧基端基因和熱休克蛋白70T細(xì)胞表位基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小分別850bp和350bp，符合預(yù)期長(zhǎng)度，圖2左側(cè)為DNAMarker，中間為熱休克蛋白70羧基端基因，右側(cè)為熱休克蛋白70T細(xì)胞表位基因片段。2、重組質(zhì)粒的構(gòu)建(I)構(gòu)建 pGEM-T Easy/PCR 產(chǎn)物重組質(zhì)粒=PCR 產(chǎn)物 3 μ 1，pGEM-T Easy 載體1μ 1，2XBuffer 5 μ 1，T4DNA連接酶I μ 1，混勻后室溫(20°C _25°C，下述室溫均為此溫度)放置lh，4°C過(guò)夜。(2) pGEM-T Easy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α菌_60°C保存，取出后置冰浴中備用。上述連接產(chǎn)物共10μ I加入ΙΟΟμ I感受態(tài)細(xì)菌中(同時(shí)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照)輕輕混勻，冰浴 30min，42°C熱激 30sec，冰浴 2min,加 LB 400μ 1,37°C 250rpm 搖床 lh，取100 μ I轉(zhuǎn)化菌涂于含氨芐青霉素(25 μ g/ml)、X-gal和IPTG的固體LB培養(yǎng)板，待表面液體晾干后，將培養(yǎng)板倒置于37°C孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜(12-18h)。(3)pGEM-T Easy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)?？寺『Y選及擴(kuò)增提取挑取培養(yǎng)板中陽(yáng)性菌落，置于3ml含氨芐青霉素(25 μ g/ml)的LB中，37°C 250rpm搖床過(guò)夜(12_18h)。取I. 5ml菌液提取質(zhì)粒，使用博大泰克B型小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?，按說(shuō)明書(shū)操作，步驟如下①用干凈的I. 5ml離心管收集約I. 5ml菌液,室溫12，OOOrpm離心3min ;棄盡上清；②加入100 μ I溶液I (含RNase Α)，震蕩充分懸浮細(xì)菌；③加入150 μ I溶液2，上下顛倒混勻，靜置Imin ；④加入150 μ I溶液3,上下顛倒混勻，靜置5min,室溫12，OOOrpm離心5min ；⑤吸附柱置于2ml離心管中，吸附柱中加入420 μ I結(jié)合緩沖液，將步驟④取得的上清小心移入，混勻后室溫靜置lmin,室溫12，OOOrpm離心lmin,棄去液體；⑥加入700 μ I漂洗液(已用乙醇稀釋)，室溫12，OOOrpm離心30sec，棄去液體；⑦重復(fù)步驟⑥；⑧空管室溫12，OOOrpm離心2min ；⑨取出吸附柱置于干凈的1.5ml離心管中，加入50μ1 EB溶液，室溫靜置l_2min ；⑩室溫12，OOOrpm離心lmin收取液體。(4)pGEM-T Easy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切，回收目的片斷用M13、M13R引物測(cè)序pGEM-T Easy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒，確認(rèn)連接片斷為所需目的基因后，分別使用Pst I+Xba I和Xba I+BamH I雙酶切，37°C水浴2h。如圖3、圖4所示，分別為pGEM_T Easy/HBV preC/CPCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖，及pGEM-T Easy/HSP70c PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒和pGEM-T Easy/HSP70tPCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。pGEM_T Easy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析，左側(cè)為DNA Marker,右側(cè)為pGEM_TEasy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切，上方條帶為載體pGEM_T Easy，下方條帶為各目的基因片斷。圖3中，pGEM-T Easy/HBV preC/C PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒，經(jīng)Pst I、Xba I酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析，左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為pEASY-T ISimple/HBV preC/C PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切，上方條帶為載體pGEM-T Easy, 3015bp,下方條帶為HBV preC/C片斷,640bp。圖4中，pGEM-T Easy/HSP70c PCR 產(chǎn)物重組質(zhì)粒和 pGEM-T Easy/HSP70tPCR 產(chǎn)物重組質(zhì)粒，經(jīng) BamH
I、Xba I酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析，左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為重組質(zhì)粒酶切，上方條帶為載體 pEASY-TlSimple，3015bp，下方條帶為 HSP70c 或 HSP70t 片斷，800bp、350bp。使用DNA純化試劑盒純化回收，步驟如下①酶切產(chǎn)物100 μ I加入瓊脂糖凝膠加樣孔中。②電壓80V，電泳 15min。③紫外線燈下切膠，取酶切片斷，稱重。④加等量(mg/ml)MembraneBinding Solution,6CTC水浴 lOmin。⑤加樣至吸附柱，室溫12000rpm離心2min,棄離心液。⑥加700 μ I Membrane Wash Solution, 12000rpm 離心 lmin,棄離心液。⑦加500 μ I Membrane Wash Solution, 14000rpm 離心 3min,棄離心液。⑧加無(wú)菌去離子水50 μ l，12000rpm離心lmin，洗脫目的片段DNA。(5)構(gòu)建重組質(zhì)粒VC、VCn (VCn不含終止密碼子)Pst I.BamH I雙酶切載體VR1012，按照步驟(4)回收約5000bp的載體片段。連接回收的酶切約640bp目的片段和酶切載體片段T4DNA連接酶I μ 1，IOXBufferl μ 1，酶切片斷+酶切載體共8μ I (根據(jù)電泳結(jié)果評(píng)估載體與酶切片斷濃度，按片斷載體 3 I比例加樣)。連接產(chǎn)物10 μ 1，按前述方法轉(zhuǎn)染感受態(tài)菌，涂于含卡那霉素的半固體LB培養(yǎng)板上，37°C孵育12-18h后挑取陽(yáng)性菌落，加入3ml含卡那霉素的液體LB37°C培養(yǎng)12_18h。按前述方法提取質(zhì)粒，如圖5所示，為重組質(zhì)粒VC酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖，載體VR1012插入基因片段為突變型HBV preC/C，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Pst I.BamH I雙切后，瓊脂糖凝膠電泳分析確認(rèn)酶切片斷大小為4913bp和640bp，證實(shí)連接片斷為所需目的基因，左側(cè)為DNA Marker ;右側(cè)為重組質(zhì)粒VC和VCn酶切，上方條帶為載體VR1012，下方條帶為突變型HBV preC/C片斷。電泳分析確認(rèn)酶切大小正確后測(cè)序，其核酸及氨基酸序列結(jié)果與模板序列完全一致。HBV突變型preC/C的核苷酸序列如序列表中的序列I所示。(6)構(gòu)建重組質(zhì)粒VCC、VCT Xba I、BamH I雙酶切VCn，按照步驟(4)回收約5000bp的片段。按照步驟(5)分別連接回收的酶切約850bp、約350bp目的片段和酶切載體片段T4DNA連接酶I μ 1，IOXBuffer I μ 1，酶切片斷+酶切載體共8 μ I (根據(jù)電泳結(jié)果評(píng)估載體與酶切片斷濃度，按片斷載體 3 I比例加樣)。連接產(chǎn)物10 μ 1，按前述方法轉(zhuǎn)染感受態(tài)菌，涂于含卡那霉素的半固體LB培養(yǎng)板上，37°C孵育12-18h后挑取陽(yáng)性菌落，加入3ml含卡那霉素的液體LB37°C培養(yǎng)12-18h。按前述方法提取質(zhì)粒，如圖6所示，為重組質(zhì)粒VCC、VCT酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖，載體VR1012插入基因片段為突變型HBV preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因和突變型HBV preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Pst I.BamH I雙切后，瓊脂糖凝膠電泳分析確認(rèn)酶切片斷大小分別為4913bp和1500bp、IOOObp,證實(shí)連接片斷為所需目的基因，中間為DNAMarker ;左側(cè)為重組質(zhì)粒VCC酶切，上方條帶為載體VR1012，下方條帶為突變型HBV preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因片斷；右側(cè)為重組質(zhì)粒VCT酶切，上方條帶為載體VR1012，下方條帶為突變型HBVpreC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因片斷。電泳分析確認(rèn)酶切大小正確后測(cè)序，其核酸及氨基酸序列結(jié)果與模板序列完全一致。HBV突變型preC/C-HSP70c的核苷酸序列如序列表中序列2所示，HBV突變型preC/C-HSP70t的核苷酸序列如序列表中序列3所示。3、重組質(zhì)粒VC、VCC、VCT的大量提取 使用QIAGEN公司大量提取質(zhì)粒試劑盒(mega kit)提取重組質(zhì)粒,步驟如下(I)將測(cè)序正確的質(zhì)粒所對(duì)應(yīng)的菌液Iml轉(zhuǎn)入含卡那霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)液 500ml 中，37°C搖床 300rpm 搖振 12_16h ；(2) 6000 Xg 4°C離心 15min 收獲細(xì)菌；(3)加Buffer Pl 50ml充分重懸細(xì)菌，加入Buffer P2 50ml，顛倒4-6下混勻，室溫放置5min,再加Buffer P3 50ml,顛倒4_6下混勻，冰浴30min ;(4) 20000 Xg以上4°C離心30min，上清移入干凈離心管，再20000 X g以上4°C離心15min,將上清依靠重力過(guò)柱(吸附柱Buffer QBT 35ml預(yù)處理)；(5) Buffer Qff 200ml 過(guò)柱，漂洗；(6) Buffer QF 35ml 過(guò)柱，洗脫 DNA ；(7)加入24. 5ml異丙醇，混勻，立刻以上4°C離心30min ；(8)加入7ml 70%乙醇，混懸后15000 Xg室溫離心lOmin，小心棄去上清；(9)加500 μ I去離子水溶解DNA，精密分光光度儀測(cè)濃度及260/280nm比值。實(shí)驗(yàn)例I. VR1012、VC、VCC和VCT的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染I、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞復(fù)蘇，2次傳代后以IO5細(xì)胞/孔的濃度加入I塊六孔培養(yǎng)板，用質(zhì)粒VCC, VCT各轉(zhuǎn)染2孔，另2孔作空白對(duì)照，嚴(yán)格按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)操作(I)無(wú)菌條件下2 μ g質(zhì)粒溶于100 μ I無(wú)血清及抗生素的DMEM中；2 μ I轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin溶于100 μ I無(wú)血清及抗生素的DMEM中，室溫靜置30_45min。將質(zhì)粒復(fù)合物滴加到轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物中，邊滴加邊混勻，室溫放置15-20min。(2)棄去6孔板里的培養(yǎng)基，并使用2ml無(wú)血清及抗生素的DMEM洗I次，棄去培養(yǎng)基。(3)向質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物中加入O. 8ml無(wú)血清及抗生素的DMEM，混勻后滴加到六孔板對(duì)應(yīng)的孔中。⑷37°C CO2孵箱中培養(yǎng)4h后，使用2ml含抗生素和血清的DMEM置換原有的培養(yǎng)基，繼續(xù)37 °C CO2孵箱中培養(yǎng)至滿48h。(5)細(xì)胞至于冰上，加少量PBS后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，1000 Xg離心3min后棄上清，加PBS200 μ I混懸細(xì)胞，凍融3次后取上清(細(xì)胞裂解液)。2、ELISA 檢測(cè) HBeAg :使用乙肝HBeAg檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫法):檢驗(yàn)方法(I)加樣及酶每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照I L，陰、陽(yáng)性對(duì)照各2孔。在各孔依次加入待檢標(biāo)本及陰、陽(yáng)性對(duì)照50 μ I，每一標(biāo)本加2孔，然后每孔加酶結(jié)合物50 μ I (空白對(duì)照孔不加)，混勻，貼上不干膠標(biāo)簽，置37 °C避光溫育30min。(2)洗板棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，將20倍洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后注滿各孔，靜 置10-20S，甩掉洗滌液，重復(fù)洗板共5次，最后拍干。(3)顯色依次在每孔加顯色劑A液、B液各50μ 1，混勻，置37°C避光溫育lOmin。(4)終止依次在每孔加終止液50 μ I，混勻。(5)測(cè)定用酶標(biāo)儀對(duì)空白孔調(diào)零，單波長(zhǎng)450iim讀取各孔的OD值。取2孔均值為該標(biāo)本檢測(cè)值。參考值(I)陰性對(duì)照OD平均值< O. I且陽(yáng)性對(duì)照OD平均值彡O. 8時(shí)實(shí)驗(yàn)正常，否則為實(shí)
驗(yàn)無(wú)效。(2)臨界值(cutoff值)計(jì)算臨界值(cutoff值)=陰性對(duì)照OD平均值X 2. I注陰性對(duì)照OD平均值低于O. 05時(shí)，按O. 05計(jì)算，高于O. 05時(shí)按實(shí)際計(jì)算。檢測(cè)結(jié)果的解釋待檢標(biāo)本OD值彡臨界值(cutoff值)者，為陽(yáng)性。待檢標(biāo)本OD值<臨界值(cutoff值)者，為陰性。表I ELISA法檢測(cè)細(xì)胞凍融上清液中的HBeAg OD均值
VR1012 VCVCCVCT陽(yáng)性對(duì)陰性對(duì)
眧眧
OD 值 0·061±0·005 0.198±0.01 0.145±0.00 0.144±0.00 3.496 0.061
3I3本實(shí)施例將構(gòu)建好的VC、VCC、VCT質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，體外培養(yǎng)48h后采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞裂解液，結(jié)果二者均成功表達(dá)各自的目的蛋白。通過(guò)本實(shí)施例，我們驗(yàn)證了 VCC、VCT在真核細(xì)胞能夠成功表達(dá)預(yù)期蛋白，為進(jìn)一步免疫動(dòng)物，了解該疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫的能力打下了基礎(chǔ)。實(shí)施例2.分別攜帶VR1012、VC、VCC、VCT的重組減毒傷寒沙門(mén)菌的構(gòu)建使用電轉(zhuǎn)化儀，將VR1012、HBV突變型preC/C基因疫苗、HBV突變型preC/C_熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門(mén)菌，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶VR1012、HBV突變型preC/C基因疫苗、HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗的重組減毒傷寒沙門(mén)菌。I、電感受態(tài)減毒傷寒沙門(mén)菌的制備(I)使用2. 5ml培養(yǎng)物(靜止期)接種250ml無(wú)抗生素的液體LB，37°C培養(yǎng)至菌液 0D600 = O. 6。(2)冰浴30min，2500Xg、4°C離心15min，使用冰預(yù)冷的水重懸沉淀。(3)再次離心后，小心棄去上清，使用O. 4倍體積的冰預(yù)冷的水重懸沉淀。(4)再次離心，使用O. 02倍體積的冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。(5)最后一次離心，然后用O. 002倍體積的冰預(yù)冷10%甘油重懸。
(6)按每管40ul分裝，并使用液氮凍結(jié)，_80°C保存。2、電感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(I)感受態(tài)細(xì)胞在冰上溶解，加入Iug重組質(zhì)粒，輕輕混合后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中。(2)使用 Gene-Pulser 和 Gene-Puls-Controller 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。設(shè)置為25uF,2. 5KV,200 Ω。(3)電擊后，立即加入400ul預(yù)熱至室溫的LB培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)lh。(4)取IOOul菌液涂布于含硫酸卡那霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)16_18h。3、重組減毒傷寒沙門(mén)菌的鑒定挑取單克隆菌落轉(zhuǎn)接于3ml含硫酸卡那霉素的液體LB，37°C搖床培養(yǎng)8-10h后，提取質(zhì)粒行酶切鑒定并送測(cè)序。SVC、VCC, SVCT測(cè)序結(jié)果與預(yù)期完全一致。圖7為各重組減毒傷寒沙門(mén)菌提取質(zhì)粒酶切結(jié)果，左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為重組減毒傷寒沙門(mén)菌SV、SVCC, SVCT提取質(zhì)粒后經(jīng)Pst I、BamH I雙酶切后結(jié)果，上方條帶為載體 VR1012，約 4911bp，下方條帶為無(wú)條帶，1500bp 的 HBVpreC/C+HSP70c，IOOObp 的 HBVpreC/C+HSP70to圖8為重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVC提取質(zhì)粒酶切結(jié)果，左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為重組減毒傷寒沙門(mén)菌SVC提取質(zhì)粒后經(jīng)Pst I、BamH I雙酶切后結(jié)果，上方條帶為載體VR1012，約 4911bp，下方條帶為 640bp 的 HBV preC/C。結(jié)果如圖7、圖8所示，SV、SVCC、SVCT、SVC提取質(zhì)粒經(jīng)Pst I+BamH I雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳，SV、SVCC, SVCT和SVC提取質(zhì)粒酶切后，上方可見(jiàn)約4911bp的VR1012載體條帶，下方依次為無(wú)條帶、約1500bp、IOOObp和640bp的條帶。通過(guò)本實(shí)施例，我們成功構(gòu)建了能夠分別攜帶各質(zhì)粒的重組減毒傷寒沙門(mén)菌SV、SVC、SVCC、SVCT。實(shí)驗(yàn)例2. SVC、SVCC和SVCT的免疫效果研究I、免疫動(dòng)物48只雌性6 8周齡Balb/c小鼠，18 25克，SPF級(jí)。隨機(jī)分為8組，每組6只。參見(jiàn)表2，第I組和第5組為對(duì)照組，其余是實(shí)驗(yàn)組。免疫方式為肌肉注射組取DNA質(zhì)粒ΙΟΟμ I(IOOyg)雙側(cè)脛骨前肌注射(每側(cè)50μ 1)，口服減毒沙門(mén)菌組為菌液ΙΟΟμ I(IXlO9CFU)灌胃。免疫流程為每周免疫I次，口服減毒沙門(mén)菌組免疫當(dāng)天至免疫后Ih禁食，各組每次免疫前I天割尾取血100 μ I分離血清。末次免疫后I周摘眼球取血后斷頸處死小鼠，分離血清及取脾進(jìn)行檢測(cè)。
表2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組和免疫程序
權(quán)利要求
1.一種HBV突變型preC/C基因疫苗，其包括HBV突變型preC/C基因，該目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體為VR1012。
2.—種構(gòu)建HBV突變型preC/C基因疫苗的方法，其步驟如下首先以含有HBV突變型preC/C基因的質(zhì)粒VEC4為模板，用PCR擴(kuò)增出HBV突變型preC/C基因序列，無(wú)終止密碼子，連入T-Easy載體，再通過(guò)雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達(dá)載體VR1012，克隆篩選得到HBV突變型preC/C基因疫苗無(wú)終止密碼子質(zhì)粒。
3.—種HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因疫苗，其特征在于其包括HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因，該目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體為VR1012。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因疫苗，其特征在于所述的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因是HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因或HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因。
5.權(quán)利要求4所述的HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因疫苗的構(gòu)建方法，其步驟如下首先以含有HBV突變型preC/C基因的質(zhì)粒VEC4為模板，用PCR擴(kuò)增出HBV突變型preC/C基因序列，無(wú)終止密碼子，連入T-Easy載體，再通過(guò)雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達(dá)載體VR1012，克隆篩選得到HBV突變型preC/C基因疫苗無(wú)終止密碼子質(zhì)粒；再以含有分枝桿菌熱休克蛋白70基因的質(zhì)粒pT-HSP70為模板，PCR擴(kuò)增熱休克蛋白70羧基端基因或熱休克蛋白70T細(xì)胞表位基因，連入T-Easy載體，再通過(guò)雙酶切及再連接將目的基因連入HBV突變型preC/C基因疫苗無(wú)終止密碼子質(zhì)粒，克隆篩選得到HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗質(zhì)粒或HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗質(zhì)粒。
6.一種攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌，其特征在于其穩(wěn)定攜帶HBV突變型preC/C基因疫苗。
7.權(quán)利要求6所述的攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌的構(gòu)建方法，其步驟如下使用電轉(zhuǎn)化儀，將HBV突變型preC/C基因疫苗轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門(mén)菌，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶HBV突變型preC/C基因疫苗的重組減毒傷寒沙門(mén)菌。
8.一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌，其特征在于其穩(wěn)定攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗。
9.權(quán)利要求8所述的攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌的構(gòu)建方法，其步驟如下使用電轉(zhuǎn)化儀，將HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門(mén)菌，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因疫苗或HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因疫苗的重組減毒傷寒沙門(mén)菌。
10.一種攜帶HBV突變型preC/C基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌、一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌和一種攜帶HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌在制備治療和預(yù)防乙型肝炎的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用減毒傷寒沙門(mén)菌遞送的HBV突變型preC/C基因疫苗和HBV-熱休克蛋白70融合基因疫苗及制備方法和應(yīng)用。其分別包括突變型HBVpreC/C基因與HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70羧基端融合基因或HBV突變型preC/C-熱休克蛋白70T細(xì)胞表位融合基因，目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體均為VR1012。首先將目的基因使用真核表達(dá)載體，構(gòu)建質(zhì)粒，然后采用電轉(zhuǎn)化的方法，轉(zhuǎn)化減毒傷寒沙門(mén)菌SL7207，得到攜帶目的基因的重組減毒傷寒沙門(mén)菌。該重組減毒傷寒沙門(mén)菌能有效誘導(dǎo)特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，可用于乙型肝炎的預(yù)防和治療。
文檔編號(hào)C12N15/51GK102805872SQ20111014919
公開(kāi)日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者貌盼勇, 劉澤, 辛紹杰, 胡燕, 白冰珂, 沈宏輝, 高蓉, 侯俊, 王志杰, 羅聲棟, 柴艷濤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院, 北京綠竹生物制藥有限公司