專利名稱：一種同時高效表達(dá)雙基因的真核表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時高效表達(dá)兩個基因的真核表達(dá)載體，可以用于基因功能研究及基因治療用途。
背景技術(shù)：
真核表達(dá)是基因功能研究中最常用的研究手段之一。在利用真核表達(dá)載體表達(dá)欲研究的外源基因時，經(jīng)常會需要同時表達(dá)兩個基因。例如，在表達(dá)目的基因用于研究的同時，再表達(dá)一個熒光基因，用來作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染指示，以監(jiān)測該真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的效率。又或者，需要同時表達(dá)兩個欲研究的目的基因，以研究這兩個基因的協(xié)同作用效應(yīng)。雖然，可以通過構(gòu)建兩個單獨的真核表達(dá)載體，然后共轉(zhuǎn)染至同一瓶細(xì)胞中，以實現(xiàn)上述目的，但是，由于兩種質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合時的不均一性，以及不同質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞效率的差異，這種共轉(zhuǎn)染經(jīng)常會出現(xiàn)較大的實驗誤差，而要盡量消除這種誤差，則需要同時做多組平行樣，計算其平均值。這樣無疑大大增加了工作量和實驗成本。而如果能在同一個載體上實現(xiàn)兩個基因的同時表達(dá)，則不需要做共轉(zhuǎn)染，只需要轉(zhuǎn)染一個質(zhì)粒即可，因此能夠很好地解決上述問題。目前，在同一個載體上實現(xiàn)兩個基因的同時表達(dá)，有幾種方法，但是都有各自的缺點和不足。一種方法是，將兩個基因融合在一起表達(dá)，中間間以數(shù)個氨基酸作為Linker。這種方法，兩個基因的表達(dá)水平基本一致，但是缺點是，由于兩個蛋白彼此融合在一起，所以有可能會互相影響彼此的空間折疊，從而導(dǎo)致蛋白功能下降甚至失效。例如這種載體的代表pEGFP-Nl，在EGFP前面插入另一個外源基因后，綠色熒光則往往會變?nèi)?。另一種方法，是利用IRES元件，將兩個基因串聯(lián)起來。兩個基因在mRNA水平基本一致，而且會各自單獨翻譯，互不影響。但是這種方法的缺點是，IRES后面的基因表達(dá)量偏低，往往只有前面基因表達(dá)量的三分之一到二分之一。所以這種方法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)一個載體同時表達(dá)兩個基因的目的，但是其并不是高效的，其中一個基因的表達(dá)量是比較低的。因此，非常有必要開發(fā)一種新型的表達(dá)載體，能夠既同時高效表達(dá)兩個外源基因，且兩個基因表達(dá)相對獨立，不會互相影響。

發(fā)明內(nèi)容
為實現(xiàn)既同時高效表達(dá)兩個外源基因，且兩個基因表達(dá)相對獨立，不會互相影響的目的，本發(fā)明提供了一種雙表達(dá)框載體，可以簡單、方便地同時高效表達(dá)兩個外源基因。將如下結(jié)構(gòu)構(gòu)建至同一個真核表達(dá)載體上1)由CMV啟動子調(diào)控的外源基因表達(dá)框結(jié)構(gòu)，即CMV啟動子+MCSl (多克隆位點1)+BGH PolyA ；2)由hEFl α啟動子調(diào)控的外源基因表達(dá)框結(jié)構(gòu)，即hEFl α啟動子+MCS2 (多克隆位點2) +SV40 PolyA。上述載體中還包括Kan原核抗性篩選標(biāo)記，以及Neo真核抗性篩選標(biāo)記。根據(jù)上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一個真核表達(dá)載體，序列如SEQ NO I所示。
利用本發(fā)明提供的真核表達(dá)載體，可以簡單方便地將兩個不同的外源基因分別插入兩個MCS (多克隆位點)，置于CMV啟動子或hEFl α啟動子的調(diào)控下。由于CMV啟動子是目前已知的最強真核啟動子之一，而hEFl α啟動子也是一個很強的啟動子，所以本載體可以很好地實現(xiàn)兩個基因的同時、高效表達(dá)。


圖I是本發(fā)明所涉及的雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3的質(zhì)粒圖譜；
圖2是在pYr-adshuttle-3的兩個表達(dá)框中分別插入綠色熒光基因EGFP、紅色熒光基因DsRed-Monomer后，構(gòu)建得到的質(zhì)粒pYr-ads-3-EGFP-moRED轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后的熒光圖片。A為普通視野；B為綠色視野；C為紅色視野。圖3是pYr-ads-3-EGFP-MY01E轉(zhuǎn)染小鼠腎臟足細(xì)胞48h后的熒光圖片。A為普通
視野為綠色視野。圖4是不同組小鼠腎臟足細(xì)胞中MYOlE的Western-blot檢測結(jié)果。A為ffestern-blot檢測結(jié)果；B為讀取各條帶灰度值后,分析所得的柱狀圖。圖5是商業(yè)化載體pYr-adshuttle-1的質(zhì)粒圖譜。
具體實施例方式實施例I
雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3的構(gòu)建
方法以商業(yè)化載體pYr-adshuttle-Ι (長沙贏潤生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，如SEQ NO 2所示)為骨架，通過一系列改構(gòu)，構(gòu)建雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3。(I)從pEFl/myc-His A上PCR擴增hEFl α啟動子片段，兩端加上酶切位點(NheIhEF-Ια ---NotIKpnIXhoIBglIIMlul)。以 NheI、MluI 為亞克隆位點，將hEFl a啟動子片段亞克隆至pYr-adshuttle-1上。構(gòu)建好的載體命名為pYr-ads-1-hEFlαρ。(2)從pEFl/myc-His A上PCR擴增SV40 PolyA片段，兩端加上酶切位點(BglII--HindIII—SalI—SV40 PolyA—Mlul)。以 Bglll、MluI 為亞克隆位點，將SV40 PolyA片段亞克隆至pYr-ads-1-hEFl α ρ上。構(gòu)建好的載體命名為pYr-ads-1-hEFlap-SV40PA。 (3)從pYr-adshuttle-1上PCR擴增CMV啟動子片段，兩端加上酶切位點(NheICMVpBamHIEcoRD0以Nhel、EcoRI為亞克隆位點，將CMV啟動子片段亞克隆至 pYr-ads-l-hEFl a p-SV40PA 上。構(gòu)建好的載體即為 pYr-adshuttle-3。結(jié)果雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3構(gòu)建成功，圖一為pYr-adshuttle-3質(zhì)粒圖譜，序列表中為該載體完整序列。其中，CMV啟動子和hEFl α啟動子后各有一個MCS (多克隆位點)，用來插入外源基因。CMV啟動子后面為MCSl (多克隆位點1)，可以用于克隆構(gòu)建的酶切位點有SacIBamHIEcoRIPstIXhoIPmeI ；hEFl α 啟動子后面為 MCS2 (多克隆位點 2)，可以用于克隆構(gòu)建的酶切位點有=KpnIBglIISalIHindII I。結(jié)論按照此方法可成功構(gòu)建雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3。
實施例2
雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3的有效性驗證
方法為了驗證本發(fā)明所涉及的雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3是否可以正常工作，將綠色熒光基因和紅色熒光基因分別構(gòu)建至該載體中，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察熒光。(I)從pEGFP-Nl上擴增EGFP綠色熒光基因，兩端加上Bgl 11和Hindi 11酶切位點。以BglII和HindIII為亞克隆位點，將EGFP片段亞克隆至pYr-adshuttle-3，插入hEFl α啟動子后面的MCS2 (多克隆位點2)。構(gòu)建好的載體命名為pYr-ads-3-EGFP。(2)從 pDsRed-Monomer-Nl 上擴增 DsRed-Monomer 紅色突光基因，兩端加上 BamHI和EcoRI酶切位點。以BamHI和EcoRI為亞克隆位點，將DsRed-Monomer片段亞克隆至
pYr-ads-3-EGFP，插入CMV啟動子后面的MCSl (多克隆位點I)。構(gòu)建好的載體命名為pYr-ads-3-EGFP-moRED。(3)用Lip2000轉(zhuǎn)染試劑將pYr-ads-3-EGFPioRED質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，48h后于突光顯微鏡下觀察突光。結(jié)果PYr-ads-3-EGFP-moRED構(gòu)建好后，轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，48小時后于熒光顯微鏡下觀察，可觀察到明顯的綠色熒光和紅色熒光，既多且亮。圖2是pYr-ads-3-EGFP-moRED轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后的熒光圖片。結(jié)論利用本發(fā)明提供的雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3構(gòu)建的同時表達(dá)綠色熒光基因和紅色熒光基因的質(zhì)粒pYr-ads-3-EGFP-moRED，能夠在293細(xì)胞中正常工作，同時、高效地表達(dá)綠色熒光基因和紅色熒光基因，熒光顯微鏡下可見多且亮的綠色熒光和紅色熒光。說明利用本發(fā)明提供的雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3,可以構(gòu)建同時高效表達(dá)兩個目的基因的真核表達(dá)載體。無論是CMV表達(dá)框，還是hEFl α表達(dá)框，均能高效工作，都可有效調(diào)控目的基因的高表達(dá)。本發(fā)明提供的雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3是有效的。
實施例3
雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3的應(yīng)用
方法將pYr-adshuttle-3進(jìn)行最常規(guī)的應(yīng)用，即利用CMV表達(dá)框表達(dá)目的基因，同時利用hEFla表達(dá)框表達(dá)一個熒光基因，作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率指示。(I)從pEGFP-Nl上擴增EGFP綠色熒光基因，克隆至pYr-adshuttle-3，插入hEFla啟動子后面的MCS2 (多克隆位點2)。構(gòu)建好的載體命名為pYr-ads-3-EGFP。(2)將人MYOlE基因的CDS區(qū)片段構(gòu)建至pYr-ads-3_EGFP，插入CMV啟動子后面的MCSl (多克隆位點I)。構(gòu)建好的載體命名為pYr-ads-3-EGFP-MY01E。(3)用Lip2000轉(zhuǎn)染試劑將pYr-ads-3_EGFP-MY01E質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠腎臟足細(xì)胞，48h后于突光顯微鏡下觀察突光。(4)收集上述轉(zhuǎn)染 pYr-ads-3-EGFP-MY01E 質(zhì)粒 48h 之后的細(xì)胞,Western-blot 檢測MYOlE的表達(dá)情況。結(jié)果pYr-ads-3-EGFP-MY01E質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠腎臟足細(xì)胞48h后，可以在熒光顯微鏡下觀察到多且亮的綠色熒光，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，其轉(zhuǎn)染效率約在50%左右。圖3是pYr-ads-3-EGFP-MY01E轉(zhuǎn)染小鼠腎臟足細(xì)胞48h后的熒光圖片。
ffestern-blot檢測顯示,與空白小鼠腎臟足細(xì)胞、轉(zhuǎn)染了 pYr-ads-3_EGFP對照質(zhì)粒的小鼠腎臟足細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了 pYr-ads-3-EGFP-MYOlE質(zhì)粒小鼠腎臟足細(xì)胞中，MYOlE的表達(dá)量明顯上升。說明外源MYOlE表達(dá)正常，且表達(dá)量較高。圖4是不同組小鼠腎臟足細(xì)胞中MYOlE的Western-blot檢測結(jié)果。結(jié)論本發(fā)明提供的雙表達(dá)框載體pYr-adshuttle-3能夠進(jìn)行常規(guī)應(yīng)用，為基因
功能研究領(lǐng)域提供了一種新的同時聞效表達(dá)兩個基因的真核表達(dá)載體。
權(quán)利要求
1.一種同時高效表達(dá)兩個基因的真核表達(dá)載體，其特征在于，將如下結(jié)構(gòu)構(gòu)建至同一個真核表達(dá)載體上I)由CMV啟動子調(diào)控的外源基因表達(dá)框結(jié)構(gòu)，即CMV啟動子+MCSl (多克隆位點I)+BGH PolyA ；2)由hEFl α啟動子調(diào)控的外源基因表達(dá)框結(jié)構(gòu)，即hEFl α啟動子+MCS2 (多克隆位點 2)+SV40 PolyA0
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種同時高效表達(dá)兩個基因的真核表達(dá)載體，其特征在于，所涉及的關(guān)鍵啟動子為CMV啟動子和hEFl α啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種同時高效表達(dá)兩個基因的真核表達(dá)載體，其特征在于，所述載體還包括Kan原核抗性篩選標(biāo)記以及Neo真核抗性篩選標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種同時高效表達(dá)兩個基因的真核表達(dá)載體，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為SEQ NO I所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種同時高效表達(dá)兩個基因的真核表達(dá)載體，將如下結(jié)構(gòu)構(gòu)建至同一個真核表達(dá)載體上1)由CMV啟動子調(diào)控的外源基因表達(dá)框結(jié)構(gòu)，即CMV啟動子+MCS1(多克隆位點1)+BGHPolyA；2)由hEF1α啟動子調(diào)控的外源基因表達(dá)框結(jié)構(gòu)，即hEF1α啟動子+MCS2(多克隆位點2)+SV40PolyA。利用此發(fā)明，可以簡單、方便地構(gòu)建同時高效表達(dá)兩個外源基因的真核表達(dá)載體。
文檔編號C12N15/79GK102816789SQ201110152419
公開日2012年12月12日 申請日期2011年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月8日
發(fā)明者易銀沙 申請人:易銀沙