專利名稱：一種蓮膜聯(lián)蛋白及其表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學與植物基因工程技術領域，具體涉及一種提高植物種子耐熱性和種子活力的蓮膜聯(lián)蛋白及其應用。
背景技術：
高溫是影響植物生長、發(fā)育和繁殖的重要環(huán)境因素之一。由于溫室效應的影響，全球暖化的趨勢日益明顯，高溫導致的種子活力和存活率下降對作物品質(zhì)和產(chǎn)量造成的危害也日益加劇，因此，研究種子耐熱機制，尋找提高種子耐熱性和活力的關鍵基因，具有重要的科學意義和經(jīng)濟價值。m、Ne lumbo nuc if era Gaertn.)種子是迄今為止被證實的最長壽和最耐高溫的禾中子之一 (；Shen-Miller, et al. , 1995, Exceptional seed longevity and robust growth: ancient sacred lotus from China. Am J Bot 82: 1367-1380;)，表明蓮種子具有非常高效的防御和修復系統(tǒng)，為我們挖掘種子耐熱性和種子活力相關的新基因提供了極佳的材料。膜聯(lián)蛋白(Armexins)是一類Ca2+及磷脂結合蛋白，在除酵母以外的生物界普遍存在(Mortimer, et al. , 2008，Annexins multifunctional components of growth and adaptation. J Exp Bot 59: 533-544)。植物膜聯(lián)蛋白參與胞外分泌，細胞伸長，細胞壁合成，根瘤形成和果實成熟等生理過程。越來越多的研究表明植物膜聯(lián)蛋白具有過氧化物酶的活性，參與植物中各種逆境應答反應，包括低溫脅迫，干旱脅迫， 鹽脅迫，重金屬脅迫和氧化脅迫等(Breton，G.，et al.，2000，Two novel intrinsic annexins accumulate in wheat membranes in response to low temperature. Plant Cell Physiol 41: 177-184;Lee，S.，et al.，2004，Proteomic identification of annexins, calcium-dependent membrane binding proteins that mediate osmotic stress and abscisic acid signal transduction in Arabidopsis. Plant Cell 16: 1378-1391；Jamij S. K.，et al.， 2008，Ectopic expression of an annexin from Brassica juncea confers tolerance to abiotic and biotic stress treatments in transgenic tobacco. Plant Physiol Bioch 46: 1019-1030； Konopka-Postupolska， D.，et al.，2009，The role of annexin 1 in drought stress in Arabidopsis. Plant Physiol 150: 1394-1410)。由于活性氧(ROS)的大量產(chǎn)生導致的氧化脅迫被認為是熱傷
(Kim, K. H. , et al. , 2010， Enhanced tolerance of transgenic tall fescue plants overexpressing 2~Cys peroxiredoxin against methyl viologen and heat stresses. Biotechnol Lett 32: 571-576)，膜聯(lián)蛋白在熱適應中的作用不容忽視。Rhee 等(Rheej H. J.，et al.，2000，Annexin Iisa stress protein induced by heat, oxidative stress and a sulfhydryl-reactive agent. Eur J Biochem 267: 3220-3225)對動物細胞進行熱處理時發(fā)現(xiàn)高溫提高了 annexin I的表達，表明其可能是熱脅迫響應蛋白，但目前在植物中尚無膜聯(lián)蛋白與種子耐熱性相關的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術中的上述不足，提供一種與植物種子耐熱性和活力相關的蛋白蓮膜聯(lián)蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供上述蓮膜聯(lián)蛋白的表達載體。本發(fā)明的又一目的是提供上述蓮膜聯(lián)蛋白的應用。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)上述目的
一種蓮膜聯(lián)蛋白，命名為NnANNl {Nelumbo nucifera Annexinl)，來源于中國蓮 Qielumbo nucifera Gaertn.)，是如下(1)或(2)的蛋白質(zhì)
(1)該蛋白的氨基酸序列如SEQID N0:1所示；
(2)通過將序列SEQID NO: 1經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，且該蛋白與(1)的蛋白具有相同的生物活性。上述蓮膜聯(lián)蛋白的編碼基因(MANN1基因)，NnANNl開放讀碼框為948 bp, 5' -UTR為63 bp, 3' -UTR為312 bp，編碼315個氨基酸。該編碼基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 2所示?；蛘吲cSEQ ID NO: 2所示序列有90%以上同源性，且該DNA分子編碼的蛋白與(1)的蛋白具有相同生物活性。一種蓮膜聯(lián)蛋白表達載體，包含蓮膜聯(lián)蛋白的編碼基因。即將編碼基因插入到出發(fā)載體中得到，出發(fā)載體可以選用本領域已知的的各種載體。上述出發(fā)載體優(yōu)選為原核表達載體pET14b、pET3h或真核表達載體PBI121等。一種蓮膜聯(lián)蛋白表達載體的制備方法，步驟如下
(1)以蓮CDNA文庫為模板，以SEQID NO:3、為引物進行PCR，得到蓮膜聯(lián)蛋白的編碼
基因；
(2)將步驟(1)的PCR產(chǎn)物與pGEMT-Easy載體進行連接，得到中間載體；
(3)中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，培養(yǎng)后進行PCR、酶切和測序鑒定；
(4 )鑒定正確的菌體進行雙酶切后與出發(fā)載體連接，連接產(chǎn)物再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)，培養(yǎng)后進行PCR、酶切和測序鑒定，鑒定正確的即為蓮膜聯(lián)蛋白表達載體。一種根癌農(nóng)桿菌，含有上述的表達載體，優(yōu)選的出發(fā)菌株為根癌農(nóng)桿菌EHA105。上述蓮膜聯(lián)蛋白或其編碼基因在提高種子耐熱性能或/和促進種子萌發(fā)活性中的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
通過植物表達載體將本發(fā)明的蓮膜聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)入植物中，可以提高植物種子在熱脅迫和人工老化條件下的萌發(fā)活力。將轉(zhuǎn)入表達質(zhì)粒的種子和野生型種子用50°C高溫處理他后進行萌發(fā)實驗，結果顯示處理過的種子萌發(fā)速度和最終萌發(fā)率都明顯高于對照的野生型種子，表明能提高植物種子在熱脅迫下的萌發(fā)活力。人工老化處理后萌發(fā)實驗結果顯示處理過的種子的萌發(fā)速度和最終萌發(fā)率都遠高于野生型種子，表明野生型種子大部分都喪失了活力，而處理的種子仍然保持較高的活力。上述結果表明NnANNl具有提高植物種子耐熱性和活力的能力。該蛋白對于種子耐熱分子機制的研究，高活力和耐熱性的品種的選育具有重要的理論意義和經(jīng)濟價值，本發(fā)明在農(nóng)業(yè)領域具有廣闊的應用空間和市場前景。


圖1.植物表達載體PBI121tV/7^W/的示圖，RB為右邊界，LB為左邊界。圖2.轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的Q-PCR和Wfestern Blot檢測結果，A為Q-PCR的表達分析結果，WT表示野生型，0E1、0E2、0E3分別是3個不同的轉(zhuǎn)基因株系；B為flfestern Blot 的檢測結果，35kD是分子量大小，CBB:考馬斯亮藍。圖3.野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子熱處理后的萌發(fā)結果分析圖，WT表示野生型， OEl、0E2、0E3表示三個不同的轉(zhuǎn)基因株系。圖4.野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子熱處理后的幼苗生長圖，WT表示野生型，OEU 0E2、0E3表示三個不同的轉(zhuǎn)基因株系。圖5.野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子人工老化處理后的萌發(fā)結果分析圖，WT表示野生型，0E1、0E2、0E3表示三個不同的轉(zhuǎn)基因株系。圖6.人工老化處理野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子后的幼苗生長圖，WT表示野生型， 0E1、0E2、0E3表示三個不同的轉(zhuǎn)基因株系。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。以下實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規(guī)條件進行。實施例1蓮膜聯(lián)蛋白基因NnANNl的克隆
(1)蓮種子胚軸的準備收獲發(fā)育成熟后期的蓮種子，剝?nèi)∨咻S；
(2)總RNA的提取采用Invitrogen公司的Trizol產(chǎn)品提取總RNA；
(3)cDNA文庫構建采用 Clontech公司的 SMART cDNA library construction kit構建文庫；
(4)EST測序以獲得的陽性單克隆菌液為測序樣品，委托上海博亞生物技術公司，用 3730測序儀對PCR驗證后的陽性單克隆進行序列測定；
(5)同源檢索使用BLAST工具搜索所得EST序列在GenBank中的同源基因，確認得到的基因為蓮膜聯(lián)蛋白基因。實施例2植物表達載體的構建
(1)基因片段克隆以實施例1所述的蓮cDNA文庫為模板，通過PCR克隆得到添加了酶切位點和feci的PCR片段。PCR引物如下，下劃線部分為酶切位點 正向引物SEQ ID N0:3 5' -TCCCCCGGG ATGGCTACCATCACAGTCCCTG -3'； 反向引物SEQ ID NO:4 :5' -CTGGAGCTCTCACAGCTCTTCGCACCCCAGT -3‘； PCR反應體系為2 μ 蓮cDNA文庫，6 μ 1 dNTP (2.5 mM), 1. 5 μ 正向引物(10 μΜ)，1·5 μ 反向引物(10 μΜ)，5 μ 1 IOXPCR 緩沖液，1 μ 1 EX Taq 酶(Takara 公司產(chǎn)品)，最后補充去離子水，使總體系為50 yl。PCR的反應條件為94°C 3分鐘；然后進入如下循環(huán)94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸7分鐘。(2)T載體連接取2 μ 1 PCR產(chǎn)物與pGEMT-Easy載體進行連接，按照Promega公司的說明書步驟進行操作，構建中間載體pGEMT-MTh。(3)大腸桿菌轉(zhuǎn)化將中間載體pGEMT-MTh轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)(天根公司產(chǎn)品)，按照天根公司的產(chǎn)品說明書進行操作。在含有IPTG、X-gal和氨芐青霉素(lOOmg/1)的LB固體培養(yǎng)基上涂板，37°C過夜培養(yǎng)后，挑取白色單菌落，在含有氨芐青霉素(IOOmg/ 1)的LB液體培養(yǎng)基中生長，取少量菌液進行PCR鑒定。(4)細菌質(zhì)粒DNA的制備收集上述LB液體培養(yǎng)基中的菌體，按照天根公司的質(zhì)粒小提試劑盒說明書制備細菌質(zhì)粒DNA，酶切和測序鑒定。測序由廣州hvitrogen公司完成。(5)表達載體的構建提取測序正確的克隆的質(zhì)粒，按照Takara公司的產(chǎn)品說明書，用和feci進行雙酶切，然后回收小片段，連接入用同樣酶消化的表達載體pBI121 中，構建植物表達載體pBI121-M7^W/，示圖如圖1所示。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a感受態(tài)，進行PCR、酶切和測序鑒定。(6)根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化提取測序正確的克隆的質(zhì)粒，通過電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌 EHA105。實施例3擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化 1.擬南芥轉(zhuǎn)化前處理
當其主苔長至5-6cm時，在花序基部剪掉整個花序，去其頂端優(yōu)勢，1周后在腋芽部位長出4-6個新生側(cè)苔，待其側(cè)苔花序形成花蕾并部分開花或形成1-2個角果時，即可用于轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化前需剪去已長成的角果。轉(zhuǎn)化的前一天給植物澆足水分，并罩一個塑料袋以保持高濕環(huán)境。2.浸染培養(yǎng)基的準備
用于浸泡擬南芥花絮的浸染培養(yǎng)基成分為含5%的蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基，pH=5. 8 (用 KOH調(diào)節(jié))，高壓滅菌。用時添加0. 02%-0. 05%表面活性劑Silwet L-77或表面活性劑吐溫-20 (tween-20)，操作需輕柔。3.農(nóng)桿菌準備及擬南芥轉(zhuǎn)化
(1)菌種的活化將儲存的已轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105液或平板保存的菌在含卡那霉素 (Km, 100mg/L )和利福平(Rif,30mg/L)的YEB固體培養(yǎng)基上劃板活化，并進行PCR檢測；
(2)挑取活化的含目的基因的單克隆陽性農(nóng)桿菌至5ml新鮮含卡那霉素和利福平的 YEB液體培基中，28 0C，180rpm搖培24小時；
(3)取上述菌液5ml(1%- )接至500 ml新鮮含卡那霉素和利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，180rpm培養(yǎng)18-24小時，使OD值達到0. 8左右(用YEB+Rif+Km作為空白對照)；
(4)將上述菌液分裝到100ml離心管中，室溫，5000轉(zhuǎn)離心20分鐘收集菌體；
(5)將細菌懸浮在浸染培養(yǎng)基中，使最終菌體適宜濃度0D600值大約為0.8-1 (用浸染培養(yǎng)基作對照)；
(6)將上述浸染液倒在燒杯中，將待轉(zhuǎn)化的植物迅速倒扣在浸染液中，使花序浸沒60 秒鐘后取出。操作時盡量小心，不要讓土屑等掉入到浸染培養(yǎng)基中；
(7)轉(zhuǎn)化后用吸水紙吸去過多的菌液，但不需要吸得太干。將植株平放，并用黑色塑料袋罩住擬南芥地上部分。保濕暗培養(yǎng)16-24h后，小心去掉塑料袋，并澆足水，恢復正常光眧.
(8)為了提高轉(zhuǎn)化率，可以在一周以后重復一次侵染過程；
(9)正常管理，收獲成熟種子。收獲后的種子在含有50mg/l的卡那霉素和150mg/l的羧芐青霉素的MS固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株。
實施例4轉(zhuǎn)基因種子的Q-PCR檢測
(1)總RNA的提取按照百泰克公司的植物通用RNA提取試劑盒說明書步驟提取野生型和不同的轉(zhuǎn)基因株系的擬南芥干種子總RNA ；
(2)第一鏈cDNA 的合成按照 Takara 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit的說明書步驟操作；
(3)Q-PCR 反應 NnANNl基因引物
正向引物SEQ ID NO: 5 :5' - TGCGAAGTCTGACAATCGGA -3'； 反向引物SEQ ID NO: 6:5' -GCTCACATCTACCTCATCACCAT -3'。內(nèi)參1 tin2基因引物
正向引物SEQ ID NO: 7 :5' - ATTACCCGATGGGCAAGTCA-3‘； 反向引物SEQ ID NO: 8 :5' - TGCTCATACGGTCAGCGATA-3‘。NnANNl和1 tin2的Q-PCR反應體系為1 μ 稀釋50倍的第一鏈cDNA模板， 12. 5μ 1 SYBR熒光實時定量PCR Master Mix CToyobo公司產(chǎn)品)，0. 5 μ 1正向引物(10 μΜ)，0.5 μ 反向引物(10 μ Μ)，最后補充去離子水，使總體系為25 μ 。PCR反應條件為95°C 10秒，58°C 15秒，72°C 20秒。反應循環(huán)數(shù)為40。Q-PCR的結果如圖2中A所示，在野生型擬南芥種子中沒有檢測到蓮膜聯(lián)蛋白基因的表達，而在三個不同的轉(zhuǎn)基因株系中都能檢測到不同程度的表達。實施例5轉(zhuǎn)基因種子的Wfestern Blot檢測
(1)原核表達以實施例2所述的中間載體pGEMT-MTh為模板，通過PCR克隆得到添加了酶切位點和損ol的PCR片段。PCR引物如下，下劃線部分為酶切位點 正向引物:SEQ ID NO: 9
5' -CCGGAATTC ATGGCTACCATCACAGTCCCTG -3'；
反向引物:SEQ ID NO: 10
5' - CCGCTCGAGTCACAGCTCTTCGCACCCCAGT-3‘；
PCR 反應體系為1 μ 1 模板，4 μ 1 dNTP (2. 5 mM),2 μ 1 正向引物(10 μ Μ), 2 μ 1 反向引物(10 μ Μ), 5 μ 1 IOXPCR緩沖液，0. 3 μ 1 EX Taq酶(Takara公司產(chǎn)品)，最后補充去離子水，使總體系為50 μ 。PCR反應程序94°C 3分鐘；然后進入如下循環(huán)94°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸7分鐘。純化后的PCR產(chǎn)物用和損ol酶切后，回收，連接入用同樣酶消化的表達載體pET-14b(N0Vagen公司產(chǎn)品)中，構建原核表達載體6His-NnANNl。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，進行PCR、酶切和測序鑒定，方法與實施例2相同。蛋白的純化按照Novagen公司的His bind purification kit說明書進行。(2)抗體制備上述純化后的蛋白用于注射兔子制備特異性抗體anti-NnANNl。(3)蛋白提取野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的蛋白提取參照Fan等(1997， Antisense suppression of phospholipase D [alpha] retards abscisic acid [mdash] and ethylene-promoted senescence of postharvest arabidopsis Leaves. The Plant Cell Online 9: 2183)的方法。(4) Western Blot 免疫印記參照 Mizzen (Mizzen, C. Α. , et al. , 1996，Sensitive detection of metallothioneins—l, _2 and _3 in tissue homogenates by immunoblotting: a method for enhanced membrane transfer and retention. J. Biochem. Bioph. Meth. 32: 77-83)的方法。Western Blot 的結果如圖 2 中 B 所示，在野生型擬南芥種子沒有檢測到蓮膜聯(lián)蛋白NnANNl的積累，而在三個不同的轉(zhuǎn)基因株系中都能檢測到不同程度的蓮膜聯(lián)蛋白NnANNl的積累。實施例6轉(zhuǎn)基因種子的熱脅迫萌發(fā)實驗
野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在消毒滅菌后，播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基上放置于4°C層積處理兩天后，50°C培養(yǎng)箱中處理6 h，高溫處理后的種子在正常條件下進行萌發(fā)。統(tǒng)計每一天種子的萌發(fā)率，共計7天，萌發(fā)情況如圖3所示，轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)速度和最終的萌發(fā)率都遠高于野生型的種子。在播種后第七天，野生型種子的萌發(fā)率僅為16%，而轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率高達50-64%，表明過量表達基因能提高種子在熱脅迫下萌發(fā)的活力。熱脅迫處理的種子幼苗生長情況見圖4，野生型幼苗長勢明顯弱于三個轉(zhuǎn)基因株系。實施例7轉(zhuǎn)基因種子經(jīng)人工老化處理后的萌發(fā)實驗
(1)人工老化是在干燥器中完成的。老化前先用10%市售的漂白劑(bleach)處理干燥器等器皿30分鐘，然后用大量清水沖洗干燥器，最后用滅菌水再沖洗一次，晾干，防止人工老化期間真菌的生長。(2)在干燥器底部注入滅菌水，將干燥器密封后放置于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中，溫度設為43°C，平衡兩天，讓干燥器中的濕度達到100%。(3)將野生型和轉(zhuǎn)基因的擬南芥種子用1. 5 ml的去掉蓋子的離心管裝好后(每管大約100粒)放置于離心管架上后迅速放入已經(jīng)平衡好的干燥器中，密封好干燥器，處理72 小時。處理期間盡量不要打開恒溫培養(yǎng)箱的門。(4)72小時后，將處理好的擬南芥種子取出，平衡至室溫后馬上進行消毒滅菌，4°C 層積處理兩天后進行萌發(fā)實驗，統(tǒng)計萌發(fā)率及對幼苗的生長情況進行拍照。人工老化后的種子萌發(fā)結果如圖5所示，轉(zhuǎn)基因種子的萌發(fā)速度和最終的萌發(fā)率都遠高于野生型的種子。在播種后第十天，野生型種子的萌發(fā)率僅為20%，而轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率高達58-70%。 處理后的幼苗生長情況見圖6，野生型經(jīng)過老化處理基本上沒有生長，而三個轉(zhuǎn)基因株系的幼苗能夠正常生長，表明過量表達基因能提高種子的活力。
權利要求
1.一種蓮膜聯(lián)蛋白，其特征在于該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.權利要求1所述蓮膜聯(lián)蛋白的編碼基因，其特征在于核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.一種蓮膜聯(lián)蛋白表達載體，其特征在于包含權利要求2所述的編碼基因。
4.根據(jù)權利要求3所述的表達載體，其特征在于出發(fā)載體為原核表達載體pET14b、 pET32a或真核表達載體pBI121。
5.權利要求3或4所述表達載體的制備方法，其特征在于步驟如下(1)以蓮cDNA文庫為模板，以SEQID NO:3、為引物進行PCR，得到蓮膜聯(lián)蛋白的編碼基因；(2)將步驟(1)的PCR產(chǎn)物與pGEMT-Easy載體進行連接，得到中間載體；(3)中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，培養(yǎng)后進行PCR、酶切和測序鑒定；(4 )鑒定正確的菌體進行雙酶切后與出發(fā)載體連接，連接產(chǎn)物再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)，培養(yǎng)后進行PCR、酶切和測序鑒定，鑒定正確的即為蓮膜聯(lián)蛋白表達載體。
6.一種根癌農(nóng)桿菌，其特征在于含有權利要求3或4所述的表達載體。
7.根據(jù)權利要求6所述的根癌農(nóng)桿菌，其特征在于宿主菌株為根癌農(nóng)桿菌EHA105。
8.權利要求1所述蓮膜聯(lián)蛋白在提高種子耐熱性能或促進種子萌發(fā)活性中的應用。
9.權利要求2所述蓮膜聯(lián)蛋白的編碼基因在提高種子耐熱性能或促進種子萌發(fā)活性中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蓮膜聯(lián)蛋白及其表達載體和應用，屬于植物基因工程技術領域。本發(fā)明的蓮膜聯(lián)蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還公開了該蓮膜聯(lián)蛋白的表達載體，是由其編碼基因插入到原核或真核表達載體中構建而成的。本發(fā)明的蓮膜聯(lián)蛋白能夠有效提高植物種子耐熱性能，增強種子的萌發(fā)活性，在植物品種選育和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領域具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N15/63GK102229662SQ20111015893
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權日2011年6月14日
發(fā)明者周玉亮, 楚璞, 陳虎輝, 黃上志, 黎茵 申請人:中山大學