專利名稱：一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法，更確切地說(shuō)是涉及一種采用黑曲霉菌RFW-5作為菌種對(duì)廢渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的方法。
背景技術(shù)：
來(lái)自屠宰場(chǎng)，奶制品加工廠和餐飲業(yè)污水中含有大量難生物降解的油脂。高濃度的油脂會(huì)對(duì)后續(xù)處理產(chǎn)生一系列問(wèn)題，如降低傳質(zhì)效率、絲狀細(xì)菌大量繁殖進(jìn)而導(dǎo)致沉降困難、污泥上浮、堵塞管網(wǎng)和產(chǎn)生惡臭氣體等。脂肪水解酶是一種酶制劑，它的主要作用是水解脂肪，將脂肪水解為甘油和脂肪酸。大量學(xué)者(如巴西的 Denise M. G. Freire、Magali C. Cammarota、Daniela R. Rosa 等人)研究發(fā)現(xiàn)，利用脂肪水解酶處理油脂污水會(huì)提高整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)的去除效率，進(jìn)而得到較好的出水。巴西的學(xué)者Denise M. G. Freire，利用棕櫚油餅廢棄物為底物，經(jīng)從環(huán)境中分離的黑曲霉菌(Penicillium sp. fungus)在溫度35° C、環(huán)境相對(duì)濕度75%條件下發(fā)酵，得到了 20U/g的酶活。然后將發(fā)酵物以0. l%(w/v)的接種量接種到1200mg/L的油脂污水中，30° C處理M小時(shí)后，游離脂肪酸濃度比初始時(shí)高了 8倍。將經(jīng)發(fā)酵物處理過(guò)的油脂污水用厭氧反應(yīng)器繼續(xù)處理，發(fā)現(xiàn)COD去除率90%左右，而該厭氧反應(yīng)器對(duì)原水的COD去除率只有32%。因此，脂肪水解酶在油脂污水的生物降解中有重要應(yīng)用。目前商業(yè)化的脂肪水解酶使用液體深層發(fā)酵獲得的比較多，雖然純度高，但價(jià)格昂貴限制了其廣泛應(yīng)用。與液體深層發(fā)酵相比，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶可能更為合適(Mitchell et al.，2002; Pandey, 2003)。固態(tài)發(fā)酵(SSF)過(guò)程中使用的水較少，從而有以下優(yōu)點(diǎn)首先，發(fā)酵罐的體積大幅度縮小，容積利用率更高；發(fā)酵結(jié)束后，產(chǎn)品濃度高， 產(chǎn)物干燥后就可以直接使用；污水產(chǎn)生量少，進(jìn)而處理費(fèi)用低(Castilho et al. , 2000)。 微生物，特別是絲狀真菌，固態(tài)發(fā)酵(SSF)條件與它們的自然生境相似，所以可以獲得最大數(shù)量的酶。另外，固態(tài)發(fā)酵所用培養(yǎng)基可以是糠，麩和其它來(lái)自于植物的復(fù)合物質(zhì)。因此， 發(fā)酵培養(yǎng)基幾乎不需要其它添加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。上面所述的物質(zhì)都是工農(nóng)業(yè)廢棄物，所以廉價(jià)充足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法。利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法是將黑曲霉RFW-5接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在接觸空氣條件下，于溫度35、2° C，環(huán)境相對(duì)濕度75、0%固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)3天達(dá)到產(chǎn)酶高峰，用PH為7. 0，IOOmM的磷酸緩沖液浸提培養(yǎng)物，離心，上清液即脂肪水解酶溶液；所述的的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為重量百分比為10. 0 14. 0%的豆餅，重量百分比為8. 0 11. 0%的甘蔗渣，重量百分比為10. 0 14. 0%的花生餅，補(bǔ)充溶液61. 0 72. 0 %L/kg。所述的黑曲霉RFW-5保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2010年12月10日；保藏編號(hào)CGMCC No. 4450 ；分類命名黑曲霉Asper識(shí) niger。所述的大豆餅為大豆油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在12%以下，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)20目篩的顆粒。所述的甘蔗渣為甘蔗在經(jīng)人類食用后產(chǎn)生的甘蔗廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在12%以下，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)100目篩的顆粒。所述的花生餅為花生油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在13%以下，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)20目篩的顆粒。所述的的補(bǔ)充溶液成份為=NaCl 3. 0 5. 0g，KH2PO4 0. 1 0. 3g， MgSO4 ·7Η20 0. 05 0. lg，K2HPO4 L 2 1. 5g, (NH4)2SO4 0· 8 1. 0g,Tween80 15 20mL, 食用油4 5mL，蒸餾水1000mL。本發(fā)明制備的脂肪水解酶所用原料價(jià)廉，酶產(chǎn)率高，發(fā)酵周期短，工藝簡(jiǎn)單，具有很高的工業(yè)化開(kāi)發(fā)價(jià)值；并且為高濃度油脂污水的處理提供了一條新途徑。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶實(shí)驗(yàn)1
本發(fā)明所用黑曲霉菌RFW-5是從環(huán)境中分離、篩選獲得，目前已將其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2010年12月10日；保藏編號(hào)CGMCC No. 4450 ；分類命名黑曲霉 Asper^iV^As niger。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為重量百分比為10. 0%的豆餅，重量百分比為8. 0%的甘蔗渣，重量百分比為10.0%的花生餅，補(bǔ)充溶液72.0 % (L/kg)。大豆餅為大豆油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在12%，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)20目篩的顆粒；甘蔗渣為甘蔗在經(jīng)人類食用后產(chǎn)生的甘蔗廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在12%，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)100 目篩的顆粒；花生餅為花生油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在13%，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)20目篩的顆粒；補(bǔ)充溶液成份為=NaCl 3. 0g, KH2PO4 0. lg, MgSO4 · 7H20 0. 05g, K2HPO4 1. 2g, (NH4)2SO4 0. 8g, Tween80 15mL，食用油 4mL，蒸餾水 IOOOmL。固態(tài)發(fā)酵操作方法如下按發(fā)酵培養(yǎng)基所述的原料比配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基分裝于 IOOmL的三角瓶中，每瓶30g，于121° C高壓滅菌30分鐘；接種黑曲霉菌RFW-5，于溫度 35° C，環(huán)境相對(duì)濕度75%、接觸空氣條件下，靜置培養(yǎng)3天；用pH為7. 0，IOOmM的磷酸緩沖液浸提培養(yǎng)物(在200rpm，37° C振搖30min)，1600 X g離心2min，上清液即脂肪水解酶溶液。脂肪水解酶酶活測(cè)定采用滴定法。測(cè)定方法具體如下取ISmL的含有5%(w/v)阿拉伯膠和5%(w/v)橄欖油的pH 7. OUOOmM的磷酸緩沖溶液于IOOmL三角瓶中，加入2mL脂肪水解酶液。置于200rpm，37° C搖床中振搖15min。通過(guò)添加20mL丙酮和乙醇(1:1 ν/ ν)的混合物終止反應(yīng)。然后再次將其放入200rpm、37° C搖床中振搖IOmin以使游離脂肪酸分離出來(lái)。添加2低酚酞試劑，然后使用O.Olmol/L的NaOH滴定至紅色pH 10.0?？瞻讓?duì)照為先將2mL脂肪水解酶液加入到20mL丙酮和乙醇(1:1 ν/ν)的混合物中，再將該混合物加入到含有相同底物的IOOmL三角瓶中。1單位酶活定義為實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘能催化產(chǎn)生IMfflol脂肪酸的酶數(shù)量。經(jīng)測(cè)定本次固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)獲得的脂肪水解酶酶活為27. 5單位/克干固體。實(shí)施例2 固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶實(shí)驗(yàn)2
本發(fā)明所用黑曲霉菌RFW-5是從環(huán)境中分離、篩選獲得，目前已將其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2010年12月10日；保藏編號(hào)CGMCC No. 4450 ；分類命名黑曲霉 Asper^iV^As niger。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為重量百分比為14. 0%的豆餅，重量百分比為11. 0%的甘蔗渣， 重量百分比為14.0%的花生餅，補(bǔ)充溶液61.0 %(L/kg)。大豆餅為大豆油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在12%，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)20目篩的顆粒；甘蔗渣為甘蔗在經(jīng)人類食用后產(chǎn)生的甘蔗廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在12%，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)100 目篩的顆粒；花生餅為花生油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在13%，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)20目篩的顆粒；補(bǔ)充溶液成份為=NaCl 5. 0g, KH2PO4 0. 3g，MgSO4 · 7H20 0. lg，K2HPO4 1. 5g, (NH4)2SO4 1. Og, Tween80 20mL，食用油 5mL，蒸餾水 1000mL。固態(tài)發(fā)酵操作方法如下按發(fā)酵培養(yǎng)基所述的原料比配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基分裝于 IOOmL的三角瓶中，每瓶40g，于121° C高壓滅菌30分鐘；接種黑曲霉菌RFW-5，于溫度 42° C，環(huán)境相對(duì)濕度80%、接觸空氣條件下，靜置培養(yǎng)3天；用pH為7. 0，IOOmM的磷酸緩沖液浸提培養(yǎng)物(在200rpm，37° C振搖30min)，1600 X g離心2min，上清液即脂肪水解酶溶液。脂肪水解酶酶活測(cè)定采用滴定法。測(cè)定方法具體如下取ISmL的含有5%(w/v)阿拉伯膠和5%(w/v)橄欖油的pH 7. OUOOmM的磷酸緩沖溶液于IOOmL三角瓶中，加入2mL脂肪水解酶液。置于200rpm，37° C搖床中振搖15min。通過(guò)添加20mL丙酮和乙醇(1:1 ν/ ν)的混合物終止反應(yīng)。然后再次將其放入200rpm、37° C搖床中振搖IOmin以使游離脂肪酸分離出來(lái)。添加2低酚酞試劑，然后使用O.Olmol/L的NaOH滴定至紅色pH 10.0?？瞻讓?duì)照為先將2mL脂肪水解酶液加入到20mL丙酮和乙醇(1:1 ν/ν)的混合物中，再將該混合物加入到含有相同底物的IOOmL三角瓶中。1單位酶活定義為實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘能催化產(chǎn)生IMfflol脂肪酸的酶數(shù)量。經(jīng)測(cè)定本次固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)獲得的脂肪水解酶酶活為22. 7單位/克干固體。
權(quán)利要求
1.一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法，其特征將黑曲霉RFW-5接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在接觸空氣條件下，于溫度35、2° C，環(huán)境相對(duì)濕度75、0%固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng) 3天達(dá)到產(chǎn)酶高峰，用pH為7. 0，IOOmM的磷酸緩沖液浸提培養(yǎng)物，離心，上清液即脂肪水解酶溶液；所述的的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為重量百分比為10. 0 14. 0%的豆餅，重量百分比為 8. 0 11. 0%的甘蔗渣，重量百分比為10. 0 14. 0%的花生餅，補(bǔ)充溶液61. 0 72. 0 %L/kg ο
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法，其特征在于所述的黑曲霉RFW-5保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2010年12月10日；保藏編號(hào)CGMCC No. 4450 ；分類命名黑曲霉Asper識(shí)niger。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法，其特征在于所述的大豆餅為大豆油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在12%以下，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)20目篩的顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法，其特征在于所述的甘蔗渣為甘蔗在經(jīng)人類食用后產(chǎn)生的甘蔗廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在 12%以下，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)100目篩的顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法，其特征在于所述的花生餅為花生油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢渣，經(jīng)脫水干燥加工成含水率在13%以下，再經(jīng)粉碎處理能過(guò)20目篩的顆粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法，其特征在于所述的的補(bǔ)充溶液成份為=NaCl 3. 0 5. OgjKH2PO4 0. 1 0. 3g,MgSO4 ·7Η20 0. 05 0. lg, K2HPO4 1. 2 1. 5g, (NH4)2SO4 0. 8 1. 0g, Tween80 15 20mL，食用油 4 5mL，蒸餾水 lOOOmL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用廢渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)脂肪水解酶的制備方法，屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。發(fā)明將黑曲霉RFW-5接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在接觸空氣條件下，于溫度35~42°C，環(huán)境相對(duì)濕度75~80%固態(tài)發(fā)酵，培養(yǎng)3天達(dá)到產(chǎn)酶高峰。用pH為7.0，100mM的磷酸緩沖液浸提培養(yǎng)物，離心，上清液即脂肪水解酶溶液。經(jīng)滴定法測(cè)定酶活，脂肪水解酶活達(dá)到32.3單位/克干固體。本發(fā)明制備的脂肪水解酶所用原料價(jià)廉，酶產(chǎn)率高，發(fā)酵周期短，工藝簡(jiǎn)單，具有很高的工業(yè)化開(kāi)發(fā)價(jià)值；并且為高濃度油脂污水的處理提供了一條新途徑。
文檔編號(hào)C12N9/20GK102229919SQ201110168048
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者劉國(guó)防, 楊尚源, 梁志偉, 王云龍, 陳英旭 申請(qǐng)人:杭州波易環(huán)保技術(shù)有限公司, 浙江大學(xué)