專利名稱：：脂解酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有脂解酶(lipolyticenzyme)活性的多肽和制備該多肽的方法。
背景技術(shù)：
：WO8802775描述了南極念珠菌(OwW^"wtor"/ca)脂肪酶B(CALB)。Uppenberg，Hansen,Patkar，Jones,Structure2,293-308(1994)描述了CALB的氨基酸序列和三維(3D)結(jié)構(gòu)。所述3D結(jié)構(gòu)可以在ResearchCollaboratory庫)(RCBSPDB)(http:〃www.rcsb.org/)中找到，其識別號為1TCA。CALB變體在Zhang等Prot.Eng.2003，16,599-605;Lutz.2004，Tetrahedron:Asymmetry,15，2743-2748;Qian和Lutz,JACS,2005，127,13466-13467;和WO2004/024954中描述。W09324619描述了來自//，/zo^ma屬菌種的脂肪酶。其它脂肪酶的氨基酸序列可以在UniProt[theUniversalProteinResource(通用蛋白質(zhì)資源)]中使用登錄號Q4pepl、Q7RYD2、Q2UE03、Q4WG73、Q6BVP4和Q4HUY1找到。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明人對1TCA結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)(MD);漠?dāng)M。所述分析揭示出兩種迄今未知的具有顯著移動(dòng)性(mobility)的蓋(lids)，Lid1由第135或136至第155或160殘基組成，而Lid2由第267-295殘基組成。所述模擬指出了在水溶液中更類似于閉合的形式和在有機(jī)溶液中更充分開放(open)的形式。所述分析揭示了3D結(jié)構(gòu)中影響所述脂肪酶的活性和功能性的重要區(qū)域，而發(fā)明人將這用于設(shè)計(jì)脂解酶變體，其具有增加的比活性，尤其是針對大型底物(bulkysubstrate)(例如分支的酸或長鏈脂肪酸和/或仲醇的酯)和/或在高pH增加的活性(4交高的最適pH)和/或增加的對映選^^性(enantioselectivity)。另外，以CALB與一些同源脂肪酶序列的比對為基礎(chǔ)，發(fā)明人已經(jīng)選擇了氨基酸殘基并且設(shè)計(jì)了脂解酶變體。因此，本發(fā)明提供一種制備多肽的方法，其包括a)選擇親本多肽，該親本多肽具有脂解酶活性并具有與CALB(SEQIDNO:l)有至少30%同一性的氨基酸序列，b)在所述序列中選擇對應(yīng)于CALB(SEQIDNO:l)的殘基1、13、25、38-51、53-55、58、69-79、91、92、96、97、99、103、104-110、113、132-168、173、187-193、197-205、215、223-231、242、244、256、259、261-298、303、305、308-313或315中任何的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，c)改變所選氨基g交序列，其中所述改變包含取代或缺失所選殘基或插入至少一個(gè)殘基〗吏其與所選殘基相鄰(insertionofatleastoneresidueadjacenttotheselectedresidue),d)制備具有改變的氨基酸序列的改變的多肽，e)測定改變的多肽的脂解酶活性或?qū)︳人狨ユI的對映選擇性，和f)選擇與親本多肽相比具有更高脂解酶活性或更高對映選擇性的改變的多肽。本發(fā)明還提供多肽，所述多肽a)具有脂解酶活性，和b)具有氨基酸序列，其與CALB(SEQIDNO:l)具有至少80%同一性(尤其是至少90%或至少95%同一性)并且與CALB(SEQIDNO:l)有差異，所述差異包含在對應(yīng)于殘基1、13、25、38-51、53-55、58、69-79、91、92、96、97、99、103、104-110、113、132-168、173、187-193、197-205、215、223-231、242、244、256、259、261-298、303、305、308-313或315中任何的位置進(jìn)行的氨基酸取代、缺失或插入。最后，本發(fā)明提供上述變體多肽在脂肪酶催化的工藝中的用途。附圖簡述圖1顯示氨基酸序列SEQIDNOS.1-7的比對。發(fā)明詳述親本多肽親本多肽具有脂解酶活性和與WO8802775中描述的南極念珠菌脂肪酶B(CALB,SEQIDNO:l)具有至少30%同一性(尤其是至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90。/。)的氨基酸序列，并且南極念珠菌脂肪酶B的序列在Uppenberg，丄，Hansen,M.T.，Patkar，S.,Jones,T.A.，Structurev2第293-308頁，1994中給出。所述親本多肽可以是以下脂肪酶中的任何。比對示于圖1。SEQIDNO:1:南極念珠菌脂肪酶B(CALB)，1TCASEQIDNO:2://;^/zozjwa屬菌種C^y//70zywasp.)，W09324619SEQIDNO:3:玉蜀黍黑粉菌(""/agow，cfo)，UniProtQ4peplSEQIDNO:4:玉蜀黍赤霉(G/Mwe〃a(禾本科鐮孑包CPwaWwwgraw/wear蘭)),UniProtQ4HUY1SEQIDNO:5:;又^^德、巴利酵母(Z)ekz^yow7c&s/wrae""),UniProtQ6BVP4SEQIDNO:6:煙曲霉0^/7^^〃ws/wm/ga^y),UniProtQ4WG73SEQIDNO:7:米曲霉(v^/^^'〃^wjzoe),UniProtQ2UE03SEQIDNO:8:粗糙脈孢菌(A^wrosporacrowa)月旨肪酶，UniProtQ7RYD2比對使用EMBOSS包(http:〃www.emboss.org)2.8.0版的Needle程序進(jìn)行，使用以下參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分(Gapopeningpenalty):10.0,缺口延伸罰分(Gapextensionpenalty):0.50，取代矩陣(Substitutionmatrix):EBLOSUM62。i亥庫欠i"牛在i^WSOS5V77ze五wro/ea"Afo/ecw/ar5b^hvareSw/fe(2000」，Rice,RLongden,I.和Bleasby,A.，TrendsinGenetics16,(6)第276-277頁中描述。程序Needle執(zhí)行Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453和Kruskal，J.B.(1983)中描述的全局比對算法?？梢酝ㄟ^相同的方法或通過D,Sankoff和J.B.Kruskal,(編)，Timewarps,stringeditsandmacromolecules:thetheoryandpracticeofsequence,comparison,第1-44頁AddisonWesley中描述的方法將其它親本多肽與圖1中的序列進(jìn)行比對。三維(3D)結(jié)構(gòu)和蓋在3D結(jié)構(gòu)1TCA中，發(fā)明人鑒定出兩個(gè)具有高移動(dòng)性的蓋，位于SEQIDNO:1的第135或136殘基至第155或160殘基(Lidl)以及第267-295殘基(Lid2)。MD模擬指出以下區(qū)域由于特別高的移動(dòng)性而尤其感興趣Lidl中的殘基141-149，以及Lid2中的以下區(qū)域267-269、272、275-276、279-280、282-283、286-290。M酸殘基的選擇可以選擇的氨基酸殘基在3D結(jié)構(gòu)內(nèi)Lid1或Lid2中殘基的非氫原子的8A之內(nèi)具有非氫原子。以這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)在結(jié)構(gòu)1TCA中選出以下殘基SEQIDNO:1的38-51、53-55、58、69-79、104-110、113、132-168、173、187-193、197-205、223-231、259、261-298、305、308-313、315。所述殘基尤其可以選自蓋的6A之內(nèi)，得到以下ITCA中的殘基40-42、46-51、54、58、70-77、79、104-107、109、133-165、167、173、187-192、197-203、223-225、228-229、261-297、308-312。氨基酸殘基也可以通過這樣的方式選擇比對同源脂解酶序列并且選擇位于具有可變性的位置上的殘基，即，在該位置處不同的序列具有不同的殘基。由此，基于圖1中所示比對通過與//^/zozyma脂肪酶(SEQIDNO:2)的比較能夠選出CALB(SEQIDNO:l)中的以下殘基1、3、5、10、12-15、25、30、31、32、57、62、66、76、78、80、83、88、89、91、92、96、97、114、121、123、143、147-149、159、163、164、168、169、174、188、194、195、197、199、205、210、214、215、221、223、229、238、242、244、249、251、254、256、261、265、268、269、272-274、277-280、282-284、287、303-306、309、314、315、317。以下殘基是特別感興趣的CALB(SEQIDNO:l)的1、13、25、38、42、74、140、143、147、164、168、190、199、215、223、242、244、256、265、277、280、281、283、284、285、292、303、315。其它脂肪酶中相應(yīng)的殘基可以由序列比對鑒定。幾個(gè)序列的比對示于圖1。其它序列可以通過已知方法比對，諸如使用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的AlignX(Vectorntisuite9.0.0中的組件)。改變的M酸序列改變的氨基酸序列通過在一個(gè)或多個(gè)所選位置進(jìn)行氨基酸改變和任選地也在其它位置進(jìn)行氨基酸改變而從親本序列衍生。每個(gè)氨基酸改變由取代或缺失所選殘基或插入至少一個(gè)殘基使其與所選殘基在N-或C-末端側(cè)相鄰纟且成。具體取代可以任選地組合SEQIDNO:1中的以下改變K13Q、A25G、P38V,L,S、T42N、N74Q、V78I、Y91S、A92S、N96S、L99V、W104H、D134L,M，N、T138L、L140E、P143S,L、D145S、A146T、L147N，F(xiàn)、A148P、V149P、S150A、W155Q,N、Q157N、T158S、L163F、T164V、R168D、V190I,A、S197L,G、L199P、V215I、D223G、T229Y、R242A、T244P、T256K、L261A、D265P、P268A、E269Q、L277I、P280V、A281S、A283K、A284N、1285E，D、G288D、N292C，Q、P303K、K308D、或V3151。多重取代oI258DG288DoS197GL199P〇T164VL163F〇V190XQ157X〇A281XW155XoD223XA281XoD223XI285X〇A281XI285XoA281XW155XA148XoD145XK308XK138XoD223XA281XI285X插入L147FN、G137ASV、V190GAH、L1QL、L1QGPL缺失N97*基于比對諸如圖1中所示，可將一個(gè)序列用作模板用于在另一序列中的改變。因此，可以將一個(gè)序列的Lid1或Lid2用另一序列的相應(yīng)蓋區(qū)取代。以下變體是使用所示多肽作為模板通過改變CALB的Lid1而設(shè)計(jì)的Q7RYD2(粗糙脈孢菌)作為模板Y135FK136HV139MG142YQ4HUY1(禾本科鐮孢)作為模板V139IG142NP143IL144G/fy//702yma屬菌種脂肪酶作為模板L140EP143LL147FA148GV149L。Q4PEP1(玉蜀黍黑粉菌)作為模板V139IL140EP143LD145SA146TL147FA148GV149LS150AA151SP152Q。以上變體中的每一個(gè)均可任選地與N292C和/或D223G和/或A281S和/或I285E組合。可以在SEQIDNO:2(/^/7/z02yma屬菌種脂肪酶)中進(jìn)行以下取代V192I、Q159N、D136L,M，N、P41V,L、S50A、N45S、W106H。氛基酸改變的命名法在本說明書中，使用單字母密碼來描述氨基酸取代，例如W155Q。用X表示使用任意不同的殘基進(jìn)行的取代(例如VI90X)。將多重取代連寫，例如S197GL199P表示具有兩個(gè)取代的變體?？蛇x方案用逗號表示，例如W155Q,N表示用Q或N取代W155。星號表示缺失。插入表示為用兩個(gè)或更多個(gè)殘基取代一個(gè)殘基(例如L147FN)。脂解酶活性親本和變體多肽具有脂解酶活性(尤其是脂肪酶活性)，即它們能夠水解羧酸酯鍵以釋放羧酸根(carboxylate)(EC3丄1)，尤其是水解甘油三酯中的酯鍵(三酰甘油脂肪酶活性，EC3.1.1.3)。酶活性可以以比活性表示，即，每mg酶蛋白的水解活性。酶蛋白的量可以例如由280nm的吸光度或通過活性部位滴定(active-sitetitration)(AST)測定，如Rotticci等Biochim.Biophys.Acta2000,1483,132-140所述。對映選擇性對映選擇性通常是CaLB催化的反應(yīng)中一個(gè)重要的參數(shù)，在水解和合成方向中均是。底物可以是兩種對映體的外消旋混合物，或者底物可以是前手性內(nèi)消旋形式的。在這兩種情況下通常都期望單一的對映體產(chǎn)物。對映體過量(ee)通過如下來測量定量兩種產(chǎn)物對映體的量，再計(jì)算ee二(期望的對映體的產(chǎn)量-另外的對映體的產(chǎn)量)/(兩個(gè)產(chǎn)量的和)。定量通常通過手性氣體層析(GC)或高效液相層析(HPLC)進(jìn)行。脂解酶變體的用途脂解酶變體可以用于脂肪酶催化的反應(yīng)中的生物催化，在酯水解和合成反應(yīng)中均可使用，例如用于一些聚合物的合成中。脂肪酶催化的反應(yīng)可以是:9a)以羧酸酯和水為反應(yīng)物，并以游離羧酸和醇為產(chǎn)物的水解，b)以游離羧酸和醇為反應(yīng)物，并以羧酸酯為產(chǎn)物的酯合成，c)以羧酸酯和醇為反應(yīng)物的醇解，或d)以羧酸酯和游離脂肪酸為反應(yīng)物的酸解。如同CALB,本發(fā)明的變體尤其可以用于這樣的應(yīng)用，其中酶的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和/或立體選擇性、穩(wěn)定性和反應(yīng)速率或接受相對寬范圍的底物的能力是重要的。反應(yīng)產(chǎn)物通常用于化學(xué)工業(yè)、精細(xì)化學(xué)品工業(yè)、制藥工業(yè)或農(nóng)用化學(xué)工業(yè)中，或作為食品成分使用。可以將變體固定化，例如通過吸附在吸附樹脂(adsorbentresin)諸如聚丙烯上。脂肪酶催化的反應(yīng)中的酯可具有大酸基團(tuán)或者大或仲醇部分，諸如pNP2—曱基—丁酸酯(pNP2_Me-butyrate)、6,8-二氟-1甲基傘形酮辛酸酯(6,8-difluro-4-methylumbelliferyloctanoate)(DiFMU辛酸酉旨)或異丙基脂肪酸酯(iso-propylfattyacidester)(例如C16-C18脂肪酸，其可以是飽和或不飽和的)。可p乂々口A.J.J.Straathof，S.Panke,A.Schmid.Cwr5/o&c/mo/.2002，73,548-556;E.M.Anderson,K.M.Larsson,O,Kirk.腸ca/.腸/ra肌1998,76，181-204;R.A.Gross,A.K謹(jǐn)ar,B.Kaira.C7z涯尺ev.2001,川/，2097-2124中對CALB所描述的來4吏用變體。實(shí)施例實(shí)施例l:通過分子動(dòng)力學(xué)選擇氨基酸殘基根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)了2個(gè)對于南極念珠菌脂肪酶B的活性非常重要的區(qū)域，如下。使用CHARMm準(zhǔn)備用于模擬的1TCA結(jié)構(gòu)。使用命令HBUILD向蛋白質(zhì)和水兩者添加氬原子。所述系統(tǒng)包埋在外在的水分子(explicitwatermolecules)中，并且限制在邊長等于90埃(Angstroms)的立方體框中。共有24630個(gè)水分子，包括1TCA結(jié)構(gòu)中已經(jīng)存在的那些。使用NAMD在恒溫300K和恒壓1.01325大氣壓下進(jìn)行總共20納秒(nanosecond)的模擬。使用Berendsen的偶聯(lián)方法將溫度和壓力保持在理想值。然后使用CHARMm分析模擬的結(jié)果(CHARMM的參考文獻(xiàn)MacKerell,A.D.，Bashford,D.，Bellott,M，Dunbrack，R.L.，E糧seck，丄D.，F(xiàn)ield,M.J.,Fischer,S.,Gao，丄,Guo，H.,Ha,S.,Joseph-McCarthy,D.，Kuchnir,L.,Kuczera，K.,Lau,F.T,K.，Mattos，C.,Michnick，S.,Ngo,T.,Nguyen,D.T"Prodhom,B.，Reiher,W.E.,Roux,B.,Schlenkrich，M.,Smith,J.C，Stote,R.,Straub，J.,Watanabe,M.,Wiorkiewicz-Kuczera,J.,Yin,D.,Karplus,M.尸/z，C7z置B1998,3586;MacKerell,A.D.,Jr.,Brooks,B.,Brooks,C.L.，III,Nilsson,L,，Roux,B.,Won,Y.,Karplus,M.于T7ze五"cyc/o/WaCom戶她'owa/CT^/m'^wSchleyer，P.v.R.等編;JohnWiley&Sons:Chichester,1998;第一巻，第271頁；Brooks,B.R.,Bruccoleri,R.E.,Olafson,B,D.,States,D.J.,Swaminathan:S.,Karplus,M./C戸/.Oem.1983，《187)。所述分析揭示了迄今未知的具有高移動(dòng)性的蓋。發(fā)現(xiàn)了當(dāng)酶處于溶液中時(shí)幾個(gè)區(qū)域會移動(dòng)?？偨Y(jié)出酶的功能性和特異性依賴于這種移動(dòng)性和優(yōu)選用于水解或合成反應(yīng)的介質(zhì)中存在的特定結(jié)構(gòu)。該模擬指示了在水溶液中更類似于閉合的形式和在有機(jī)溶劑溶液中更充分開放的形式，即在一些含有表面活性劑的水溶液(surfactantcontainingwatersolution)中更類似于晶體結(jié)構(gòu)。對CALB中殘基的C-a原子使用各向同性的RootMeanSquareDisplacements(均方根位移)計(jì)算，以及上述模擬，鑒定了移動(dòng)性增加的區(qū)域。發(fā)現(xiàn)移動(dòng)的蓋區(qū)對于Lidl是第136-160殘基，并且對于Lid2是第267-295殘基?？梢缘贸雠c這些新蓋相鄰的殘基與蓋移動(dòng)性相互作用，并且因此對于酶的活性是非常重要的。實(shí)施例2:水解反應(yīng)評估了變體對pNP-丁酸酯(pNP-butyrate)、夕卜消旋pNP2-甲基丁酸酯(racemicpNP2-methylbutyrate)和6，8-二氟-4-曱基傘形酮辛酸酯(DiFMU辛酸酯)的水解活性。根據(jù)/腸/.C7z隱1971，風(fēng)6019-6023合成了外消旋pNP2-曱基-丁酸酯。購自MolecularProbes的DiFMU辛酸酯之前已經(jīng)由Lutz等C/爿w.C7z縫Soc.2005,"7，13466-13467)在CALB測定法中進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)。pNP2-曱基-丁酸酯選擇對具有大酸基團(tuán)的底物的接受力改善的變體，而DiFMU辛酸酯選擇對大醇部分的接受力改善的變體。反應(yīng)在50mM含0.1%TritonX-100的pH7,0磷酸緩沖水溶液中進(jìn)行。在微量滴定板中跟蹤反應(yīng)動(dòng)力學(xué)約15分鐘，在405nm(pNP)或350/485nm(DiFMU的ex/em)測量?；诿傅腁，將活性標(biāo)準(zhǔn)化。DiFMU辛酸酯結(jié)果如下顯示為對于不同底物的活性，以CALB野生型的。/。表示。變體pNP丁酸酯pNP2-曱基-丁酸酯DiFMU辛酸酯N74Q77113110P143S5011342A281S215232208P38S3510744N292Q73158105L1QGPL6314485L1QL6519349I285E233332236L147F9823290L147N7917879N292C8028290L140E5115179P143L79192112A146T5512642P280V4810036A283K10411594A284N6512519T103G,A148P701670W104H,A148Pn1460N74Q,A281S881560VI90A64143L199P7416275T256K10512079T42N352164712<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>該結(jié)果證明通過取代單個(gè)所選氨基酸殘基可以將針對大底物(分支脂肪酸的酯)的比活性增加高至37倍。實(shí)施例3:具有蓋取代的變體(variantwithlidreplacement)通過用鐮孢屬CPwran'Mw)脂肪酶(SEQIDNO:4)、德巴利酵母屬(DWfl70m;;ca)脂肪酶(SEQIDNO:5)或脈孢菌屬(7Vewra^ora)脂肪酶(SEQIDNO:8)的相應(yīng)殘基取代Lidl設(shè)計(jì)了基于CaLB野生型(SEQIDNO:體。將結(jié)果表示為活性占對于相同底物的CALB活性的百分?jǐn)?shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>V139I,G142N，P143I,L144G,D145G,L147T，A148G，V149L,S150IN,A151T，S153A,W155V，A281S10521612631Y135F,K136H,V139M,G142Y,P143G,D145C,L147G,A148N,V149F,S150GKVAKAGAPC，A151P,W155L,A281S378239776該結(jié)果證明通過將一種脂肪酶的蓋用另一脂肪酶的蓋替換能夠顯著增加針對大底物的比活性，并且這可以通過與所選殘基的單取代進(jìn)行組合來進(jìn)一步增加。實(shí)施例4:對映選擇性使用2mMpNP2-曱基-丁酸酯作為底物，在含1%TritonX-100的0.5MpH7.0的磷酸鈉緩沖液中以2mL規(guī)模進(jìn)行了水解反應(yīng)。通過添加2MHC1(0.1mLM吏反應(yīng)終止，然后萃取到Et20(2mL)中。通過手性GC分析(VarianCP-Chiralsil-DEXCB10m柱，溫度程序?yàn)槊糠昼?。C，從80至180。C)之后，將E(對映體比例)計(jì)算為E=ln[eep(l-ees)/(eep+ees)]/ln[eep(l+ees)/(eep+ees)],其中ees和eep分別是底物和產(chǎn)物的ee(對映體過量)。每種酶的反應(yīng)以一式三份進(jìn)行(在不同的轉(zhuǎn)化率終止)，并且將E作為平均值報(bào)道。測試CALB并且與變體Y135F,K136H,V139M,G142Y,P143G，D145C,L147G,A148N,V149F,S150GKVAKAGAPC,A151P,W155L比較。結(jié)果為對于變體E-2.4且對于親本脂肪酶(CALB)E=1.05,顯示CALB幾乎完全沒有選擇性，但是變體具有增加的對映選擇性。實(shí)施例5:長鏈脂肪酸酯的水解以pNP月桂酸酯(pNPlaurate)作為長鏈底物，測定了CALB變體的米-曼氏常數(shù)(Michaelis-Mentenconstant)。在含有1%TritonX-100(在高底物濃度—時(shí)防止溶液渾濁)的0.5M磷酸鈉緩沖液,pH7.0中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>該結(jié)果說明所述變體對長鏈底物的活性(按keat/KM測量)是親本脂肪酵的23"(咅(thevariantis23timesmoreactivethantheparentlipaseonthelong-chainsubstrate)。實(shí)施例6:異丙酯的水解還在棕櫚酸異丙酯(iso-propylpamitate)的水解中測試了前文實(shí)施例中使用的變體。結(jié)果顯示所述變體所進(jìn)行的水解比CALB高26%。水解如下進(jìn)行將棕櫚酸異丙酯作為底物添加至50mM乙酸鈉pH5.0(=緩沖液)中達(dá)到3mg/ml的濃度，加熱至60。C持續(xù)5分鐘，再通過UltraTurrax均質(zhì)化45秒，并且在制備之后立即使用。將純化的酶制備物在脫鹽水和10ppmTritonX-100中稀釋成對應(yīng)于OD280=0,00016的濃度。在PCR板中將20piL緩沖液、60(iL底物和20(iL酶溶液在800RPM混合20秒，再轉(zhuǎn)移至PCR熱循環(huán)儀(PCRthermocycler)在30。C進(jìn)行30分鐘的反應(yīng)，其后在90。C進(jìn)行5分鐘使酶失活，再添加20jliL10%TritonXlOO溶液(在脫鹽水中)。產(chǎn)生的脂肪酸的量用Wako的NEFAC試劑盒測定，并且計(jì)算6次測定的平均值減去酶空白作為結(jié)果。實(shí)施例7:在高pH的活性在30。C在多個(gè)pH以三丁酸甘油酯(tributyrin)作為底物并且以阿拉伯樹膠(gumarabic)作為乳化劑測定了兩種CALB變體的脂肪酶活性。結(jié)果表示為相對活性，耳又pH7.0的活性作為100。_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>可見所述變體在堿性pH(pH7-9)的活性增加并且具有較高的最適pH。實(shí)施例8:合成反應(yīng)將所述變體通過物理吸附以20mg/g的加載量(loading)(基于A280)固定在Accurel多孔聚丙烯上。反應(yīng)在Eppendorf管中使用1mmol的各種反應(yīng)物、約0.8mL己烷和5mg固定化的酶在40。C、1200rpm進(jìn)行。將樣品取出用于NMR和手性GC分析。以2-乙基-1-己醇和乙酸乙烯酯作為反應(yīng)物的合成反應(yīng)的結(jié)果按照轉(zhuǎn)化率％(ee。/。)如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>對映體比例通過上文給出的公式計(jì)算。結(jié)果為對于親本脂肪酶(CALB)E=1.9，而對于兩種變體E二3.0和E二3.2。因此該結(jié)果顯示所述兩種變體的改進(jìn)的對映選擇性。以相同的方式進(jìn)行了另一實(shí)驗(yàn)，但是以苯曱酸乙烯酯和l-己醇作為反應(yīng)物。72小時(shí)之后，變體I285E的轉(zhuǎn)化率為17。/。，而親本CALB的轉(zhuǎn)化率為9。/。。權(quán)利要求1.一種制備多肽的方法，包括a)選擇親本多肽，該親本多肽具有脂解酶活性并具有與SEQIDNO1有至少30％序列同一性的氨基酸序列，b)在所述序列中選擇對應(yīng)于SEQIDNO1的殘基1、13、25、38-51、53-55、58、69-79、91、92、96、97、99、103、104-110、113、132-168、173、187-193、197-205、215、223-231、242、244、256、259、261-298、303、305、308-313或315中任何的至少一個(gè)氨基酸殘基，c)改變所述氨基酸序列，其中所述改變包含取代或缺失所選殘基或插入至少一個(gè)殘基使其與所選殘基相鄰，d)制備具有改變的氨基酸序列的改變的多肽，e)測定改變的多肽的脂解酶比活性、在堿性pH的脂解活性和/或?qū)τ尺x擇性，和f)選擇改變的多肽，其與親本多肽相比具有更高的脂解酶比活性、在堿性pH更高的活性和/或增加的對映選擇性。2.權(quán)利要求1的方法，其中所選殘基對應(yīng)于SEQIDNO:1的殘基1、13、25、38、42、74、140、143、147、164、168、190、199、215、223、242、244、256、265、277、280、281、283、284、285、292、303.315、135-160或267-295中的任何。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述改變包含將所選殘基用SEQIDNOS:1-8中任何的相應(yīng)位置上存在的殘基取代。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述親本多肽選自SEQIDNOS:1-8。5.—種多肽，所述多肽a)具有脂解酶活性，和b)具有氨基酸序列，其與SEQIDNO:1有至少80%同一性并且與SEQIDNO:1相比在對應(yīng)于殘基1、13、25、38、42、74、140、143、147、164、168、190、199、215、223、242、244、256、265、277、280、283、284、285、292、303、315、135-160或267-295中任何的位置上包含氨基酸取代、缺失或插入。6.權(quán)利要求5的多肽，其中與SEQIDNO:1的差異包含對應(yīng)于如下的改變N74Q、P143S、A281S、P38S、N292Q、L1QGPL、L1QL、1285E、L147F、L147N、N292C、L140E、P143L、A146T、P280V、A283K、A284N、T103G、A148P、W104H、A148P、N74Q、A281S、V190A、L199P、T256K、T42N、R242A、V215I、T164V、L163F、T164V、D265P、P303K、R168D、A25G、V315I、T244P、K13Q、L277I、Y91S、A92S、N96S、N97*、L99V、或D223G。7.權(quán)利要求5或6的多肽，所述多肽與SEQIDNO:1相比包含如下的氨基酸改變組a)V139IG142NP143IL144GD145GL147TA148GV149LS150INA151TS153AW155V;b)Y135FV139RL140MA141VG142PP143VD145CA146PL147SA148FV149PS150KLSCA151PW155L;c)Y135FK136HV139MG142YP143GD145CL147GA148NV149FS150GKVAKAGAPCA151PW155L;d)V139IG142NP143IL144GD145GL147TA148GV149LS150INA151TS153AW155VA281S;或e)Y135FK136HV139MG142YP143GD145CL147GA148NV149FS150GKVAKAGAPCA151PW155LA281S。8.固定化形式的權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的多肽。9.一種進(jìn)行脂肪酶催化的反應(yīng)的方法，所述方法包括將反應(yīng)物與任一前述權(quán)利要求的多肽接觸，其中所述反應(yīng)是a)以羧酸酯和水為反應(yīng)物，并以游離羧酸和醇為產(chǎn)物的水解，b)以游離羧酸和醇為反應(yīng)物，并以羧酸酯為產(chǎn)物的酯合成，c)以羧酸酯和醇為反應(yīng)物的醇解，或d)以羧酸酯和游離脂肪酸為反應(yīng)物的酸解。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述反應(yīng)是異丙酯的水解，或以異丙醇作為反應(yīng)物的醇解或酯合成。全文摘要對南極念珠菌脂肪酶B三維結(jié)構(gòu)的分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬揭示了兩種具有顯著移動(dòng)性的迄今未知的蓋，并且將這個(gè)發(fā)現(xiàn)用于設(shè)計(jì)脂解酶活性增加的脂肪酶變體。文檔編號C12N9/20GK101541956SQ200780044099公開日2009年9月23日申請日期2007年11月26日優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日發(fā)明者倫納多·德馬里亞,杰斯珀·布拉斯克,沙姆坎特·A·帕特卡,邁克爾·斯克喬特,金·博爾奇,阿蘭·斯文德森申請人:諾維信公司