專利名稱：改進(jìn)的脂解酶和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及脂解酶領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及用重組DNA技術(shù)改進(jìn)過的脂解酶，涉及有關(guān)生產(chǎn)它們的方法以及其用途，特別是用于酶洗滌劑組合物中。
脂解酶是能夠?qū)⒏视腿ニ獬捎坞x脂肪酸和甘油二酯，單酸甘油酯并最終水解成甘油的酶。它們也可裂解更復(fù)雜的酯如植物中的角質(zhì)層或皮膚的皮脂。脂解酶用于工業(yè)上的各種酶加工，如甘油三酯的酯交換和酯基轉(zhuǎn)移以及酯的合成。也可將它們用于洗滌劑組合物以達(dá)到改善洗滌劑產(chǎn)品去除脂肪特性的目的。
應(yīng)用最廣泛的脂解酶是脂酶(EC3.1.1.3)。例如，EP-A-258068和EP-A-305216(均屬Novo Nordisk)都描述了用rDNA技術(shù)經(jīng)異源宿主微生物生產(chǎn)真菌酯酶，特別是來自Thermomyces Lanuginosus/Humicola Lanuginosa的酯酶。EP-A-331376(Amano)描述了酯酶和用rDNA技術(shù)生產(chǎn)它們的方法及它們的用途，包括來自蔥頭假單孢菌的氨基酸序列。在WO-A-89/09263和EP-A-218272(均屬Gist-Brocades)中進(jìn)一步給出了用rDNA技術(shù)生產(chǎn)的其它酯酶的實例。盡管有大量關(guān)于酯酶和其修飾物的公開文獻(xiàn)，但迄今為止，僅發(fā)現(xiàn)來自Humicola Lanuginosa的酯酶具有廣泛的商業(yè)應(yīng)用，可作為商標(biāo)名為Lipolase(TM)的洗滌產(chǎn)品的附加成分。
酯酶的一個特征是它們表現(xiàn)出界面活性，這意味著對已形成界面或膠束的底物的酶活性比完全溶解的底物高出很多。若底物濃度高于底物的臨界膠束濃度(CMC)，則由酯解活性的突然增加反映出界面活性，并形成界面。在酶活性對底物濃度的曲線圖中，可通過實驗觀察到這種現(xiàn)象表現(xiàn)為不連續(xù)性。
已經(jīng)從酯酶分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變，解釋了酯酶界面活性的機(jī)制。在游離的，未結(jié)合狀態(tài)，螺旋形蓋蓋住了催化結(jié)合位點。結(jié)合到脂底物上后，代替了與蓋的結(jié)合，催化位點暴露出來。也認(rèn)為螺旋蓋與脂界面相互作用，因此，使酶保持與界面的結(jié)合。
WO-A-92/05249(Novo Nordisk)公開了遺傳工程方法修飾的酯酶(特別是來自Humicola Lanuginosa的酯酶)，在脂接觸區(qū)對其進(jìn)行了修飾。在該申請中，將脂接觸區(qū)定義為在活性結(jié)構(gòu)中由螺旋形蓋覆蓋的表面。修飾涉及酯接觸區(qū)中一個或多個氨基酸殘基的缺失或取代，以便增加脂接觸區(qū)的靜電荷和/或降低脂接觸區(qū)的疏水性，或者以便改變脂接觸區(qū)的表面構(gòu)型。通過缺失脂接觸區(qū)中的一個或多個帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，或者用中性或更多的帶正電荷的氨基酸取代這些殘基，和/或用帶正電荷的氨基酸取代脂接觸區(qū)中的一個或多個中性氨基酸殘基，和/或缺失脂接觸區(qū)中的一個或多個親水的氨基酸殘基，或用疏水氨基酸取代這些殘基來達(dá)到上述目的。
角質(zhì)酶是酶的一個亞類(EC3.1.1.50)，蠟酯水解酶。這些酶能夠降解角質(zhì)(一種植物中產(chǎn)生的作為葉子和莖上保護(hù)性包被的酯化長鏈脂肪酸和脂肪醇網(wǎng))。另外，它們具有一些脂解活性，即，它們能夠水解甘油三酯。因此，認(rèn)為它們是一種特殊的酯酶。但與酯酶相反，角質(zhì)酶不表現(xiàn)出任何基本的界面活性。
可以從許多來源，如植物(花粉)，細(xì)菌和真菌得到角質(zhì)酶。由于它們的脂肪降解特性，已提出將角質(zhì)酶作為酶洗滌劑組合物的成分。例如，WO-A-88/09367(Genencor)提出將一種表面活性劑和一種基本上純的細(xì)菌角質(zhì)酶組合起來以配制有效的清洗組合物。公開的是含有從克蘭氏陰性菌惡臭假單孢菌ATCC53552得到的角質(zhì)酶的洗滌劑組合物。然而，在最近的歐洲專利申請EP-A-476915(Clorox)中，它公開了相同的酶-將其稱為脂酶-若按常規(guī)方法使用在從織物上除去油漬方面不比其它脂酶更有效。
最近，已確定了來自茄病鐮孢的角質(zhì)酶的三維結(jié)構(gòu)(Martinez)等人，(1992)Nature 356，615-618)。發(fā)現(xiàn)該酶不具有覆蓋催化結(jié)合位點的螺旋形蓋。而活性位點絲氨基殘基似乎能為溶劑接近。這些發(fā)現(xiàn)看起來可證實目前關(guān)于酯酶中介面活性機(jī)制的理論。
已將來自茄病鐮孢的角質(zhì)酶克隆并定序(Ettinger等人，(1987)Biochemistry 26，7883-7892)。WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)描述了該基因在大腸桿菌中的克隆和生產(chǎn)。在沒有和存在角質(zhì)酶與底物間界面的兩種情況下，角質(zhì)酶可有效催化含水或非水介質(zhì)中酯的水解與合成。以其正常穩(wěn)定性為基礎(chǔ)上可用這種角質(zhì)酶生產(chǎn)清洗劑如洗衣用洗滌劑和其它專門溶解脂肪的制品，如化妝品組合物和香波。既未公開以經(jīng)濟(jì)可行的途徑生產(chǎn)該酶的方法，也沒公開含角質(zhì)酶的特定酶洗滌劑組合物。
由于該特性(即沒有界面活性)，對于本專利申請來說，我們將角質(zhì)酶定義為基本上不表現(xiàn)界面活性的脂解酶。因此，角質(zhì)酶與經(jīng)典的脂酶不同，即它們沒有覆蓋催化結(jié)合位點的螺旋狀蓋。
如上文提到的，迄今為止，僅發(fā)現(xiàn)得自Humicola Lanuginosa的脂酶有廣泛的商業(yè)應(yīng)用，可作為商標(biāo)名為Lipolase(TM)的洗滌產(chǎn)品的附加成分。在Chemistry和Industry(1990，page 183-186)，Henrik Malmos在他的文章中提到已經(jīng)知道，一般在洗滌過程中，脂酶的活性低，而且Lipolase(TM)也不例外。在干燥過程中，若織物的水含量減少，則酶會重新得到其活性并水解脂肪油漬。在接下去的洗滌過程中，除去水解的物質(zhì)。這可以解釋為什么在第一次洗滌過程中脂酶的作用低而在接下去的過程中作用明顯。因此，仍需要在洗滌過程中表面出任何顯著活性的脂解酶。
我們已發(fā)現(xiàn)角質(zhì)酶(特別是來自茄病鐮孢的角質(zhì)酶)表現(xiàn)出明顯的洗滌效果。然而，還需要具有改善的洗滌用脂解酶活性的角質(zhì)酶和生產(chǎn)所述酶的方法。
本發(fā)明的目的是提供經(jīng)過修飾以提高其性能，特別是它們的洗滌用脂解活性的角質(zhì)酶。
我們現(xiàn)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過修飾氨基酸序列，這樣提高酶表面的疏水性，可以改善真核角質(zhì)酶的特別是來自茄病鐮孢，Colletotrichum Capsici，盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea的角質(zhì)酶的脂解活性。
母體角質(zhì)酶的角質(zhì)酶變異體，其中已修飾過氨基酸序列，這樣就提高了酶表面的疏水性。最好是，提高酶表面的疏水性以便形成擴(kuò)大的脂接觸區(qū)。
本發(fā)明涉及角質(zhì)酶的變異體。按上文所討論的，可從許多來源，如植物(如花粉)，細(xì)菌和真菌獲得角質(zhì)酶。為了用重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾，在本發(fā)明中用作母體角質(zhì)酶或起始物質(zhì)的角質(zhì)酶選自真核的角質(zhì)酶。真核角質(zhì)酶可從各種來源獲得，例如植物(如花粉)，或真菌。
(真核的)真菌角質(zhì)酶似乎含有具有不同特異性(葉-特異性和莖-特異性)的兩個家族。具有葉-特異性的角質(zhì)酶往往會有酸或中性最佳PH，而具有莖-特異性的角質(zhì)酶往往會有堿性最佳PH。具有堿性最佳PH的角質(zhì)酶更適用于堿合成的洗滌劑組合物如重垢織物洗滌粉和液體。具有酸性至中性最佳PH的角質(zhì)酶更適用于輕垢織物或漂洗調(diào)理劑，而且適用于工業(yè)用清洗產(chǎn)品。
在下列表Ⅰ中，列出了具有莖-特異性的四種不同角質(zhì)酶，以及它們的最佳PH。
表Ⅰ具有莖-特異性的角質(zhì)酶的實例 最佳PH茄病鐮孢 9玫瑰色鐮孢 10茄屬絲核菌 8.5甘藍(lán)鏈格孢(PNBase I) 9在本發(fā)明中特別優(yōu)選的是從野生型茄病鐮孢(Ettinger等人，1987)得到的角質(zhì)酶。若用于特定的洗滌劑組合物，則這種角質(zhì)酶表現(xiàn)出明顯的“洗滌用”效果。
為了用重組DNA技術(shù)進(jìn)行修飾，在本發(fā)明中適宜作母體角質(zhì)酶或起始物質(zhì)的是與來自茄病鐮孢的角質(zhì)酶有高度氨基酸序列同源性的角質(zhì)酶。實例是來自Colletotrichum capsici，盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea。在

圖12中列出了這些角質(zhì)酶的部分氨基酸并且可以看出有高度的同源性。
除通過修飾其基因改進(jìn)茄病鐮孢外，用從茄病鐮孢得到的5′-和3′-DNA探針，編碼(前)角質(zhì)酶的Colletotrichum capsici，盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea cDNA和識別其它脂解酶中保守序列的探針可分離編碼來自其它真核生物的角質(zhì)酶的遺傳信息，并且如果需要，通過聚合酶鏈反應(yīng)或PCR技術(shù)(參見，例如WO-A-92/05249)，用這些探針擴(kuò)增從生產(chǎn)角質(zhì)酶的真核細(xì)胞的信使RNA′s(mRNA′s)得到的cDNA′s。按標(biāo)準(zhǔn)方法，在大腸桿菌中克隆并表達(dá)角質(zhì)酶編碼基因后，在適當(dāng)條件下，檢測角質(zhì)酶在(脂肪)污點除去方面的性能。用這樣的方法，可以得到許多具有改善的洗滌用性能的，上述角質(zhì)酶的天然變異體。此外，這些天然產(chǎn)生的角質(zhì)酶的序列為進(jìn)一步進(jìn)行茄病鐮孢角質(zhì)酶的蛋白質(zhì)工程提供了極好的基礎(chǔ)。
在有關(guān)決定“洗滌用”脂解酶活性的因素的新觀點及仔細(xì)觀察茄病鐮孢角質(zhì)酶三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，我們已發(fā)現(xiàn)許多如何提高這種角質(zhì)酶性能的可能性和一般用重組DNA技術(shù)得到的角質(zhì)酶。
由于角質(zhì)酶基本上不同于象Lipolase(TM)那樣的脂酶，因此，角質(zhì)酶底物(脂界面)間的相互作用所基于的原理也不同于可結(jié)合底物的疏水區(qū)，其蓋打開和暴露的原理(Brzozowski等人，(1991)Nature 351，491-494)。
本發(fā)明指出，可以修飾角質(zhì)酶，這樣可以改善與底物的相互作用而不會在修飾的角質(zhì)酶的表面上形成上述大的疏水區(qū)，使得角質(zhì)酶分子開始聚集?？梢酝ㄟ^導(dǎo)入疏水氨基酸象丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，以及甲硫氨酸并降低谷氨酸、谷氨酸胺和組氨酸的水平，如果這些氨基酸的疏水側(cè)鏈不會被埋在角質(zhì)酶的疏水核心中，則從而可增加疏水表面。一般不認(rèn)為甲硫氨酸是疏水氨基酸。然而，若加到特定的位置上，在角質(zhì)酶分子表面，甲硫氨酸可有效地起到提高疏水性的作用。
在某些情況下，發(fā)現(xiàn)除導(dǎo)入疏水氨基酸外，導(dǎo)入帶電荷的氨基酸也有益于避免酶的聚集。令人驚奇地是，我們發(fā)現(xiàn)，若加到角質(zhì)酶分子的特定位置，帶正電荷的氨基酸象賴氨酸和精氨酸也能增加疏水表面面積。這限于賴氨酸和精氨酸中的亞甲基未埋在分子中的角質(zhì)酶分子中的那些位置。用賴氨酸或精氨酸的優(yōu)點是氨基-或亞氨基增加了暴露亞甲基并因此能夠與脂相相互作用的可能性。
通常不認(rèn)為賴氨酸和精氨酸是疏水氨基酸。然而，形成這些殘基側(cè)鏈的原子含有許多可以與脂相相互作用的原子(在亞甲基部分)。事實上，賴氨酸殘基疏水部分的大小可以與纈氨酸殘基的相比。
如果導(dǎo)入正電荷會對角質(zhì)酶的其它內(nèi)在特性產(chǎn)生副作用，那么通過在或靠近與脂相相互作用的角質(zhì)酶分子部分的表面，導(dǎo)入平衡的負(fù)電荷或消除靜電荷來抵消這種副作用。
觀察活性位點周圍，茄病鐮孢角質(zhì)酶表面的疏水性，發(fā)現(xiàn)這樣的疏水性不是最佳的。為了使其得到提高，可以用更松散的疏水殘基取代該區(qū)域中的特定氨基酸。
為了更好地理解脂解酶中結(jié)構(gòu)和功能間的相互關(guān)系，我們仔細(xì)研究了許多所述酶的三維(3D)結(jié)構(gòu)。在這些結(jié)構(gòu)還未發(fā)表時，我們用分子模擬技術(shù)的方法推導(dǎo)出了其結(jié)構(gòu)。
用X射線晶體學(xué)方法已經(jīng)確定了Rhizomucor miehei脂酶的3D結(jié)構(gòu)(Brady等人(1990)Nature 343，767-770，Brzozowski等人(1991)Nature 351，491-494，Derewenda等人(1992)Biochemistry 31，1532-1541)?；钚晕稽cSer 144(屬于Ser-His-Asp蛋白酶那樣的催化三元素組)被埋在短的螺旋狀蓋下(殘基85-91)。其活性位點Ser被埋的結(jié)構(gòu)在下文將被稱為酶的“關(guān)閉的”酶象。認(rèn)為在油-水界面的吸附作用與螺旋狀蓋的運動有關(guān)。作為這種運動的結(jié)果，活性位點絲氨酸變成暴露的并增加了活性位點周圍的疏水區(qū)。認(rèn)為“開的”構(gòu)象相當(dāng)于在油-水界面吸附的活性酶。
已經(jīng)將真菌Rhizomucor miehei“關(guān)閉”形式的Ca-等同物寄存在Brookhaven的Protein Data Bank。用完善的計算方法生產(chǎn)Rhizomucor miehei脂酶的全部蛋白質(zhì)等同物(骨架和側(cè)鏈)。用S.Wodak等人(1989)，Protein Engineering 2，335-345)描述的計算方法，生產(chǎn)Rhizomucor miehei脂酶的粗起始模型。在SYBYL分子模型化軟件包(TRIPOS associates，Inc.St.Louis，Missouri)提供了該方法。隨后，通過使用在BIOSYM分子模型化軟件包(BIOSYM，San Diego，California)中提供的能量最小化(EM)和分子動力學(xué)(MD)技術(shù)改進(jìn)模型。在模型的EM和MD完善過程中，使用已知方法。同時按潛在能量功能和已知結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)對模型作詳細(xì)的能量最優(yōu)化處理。通過如氫鍵的數(shù)量和質(zhì)量，氫在二級結(jié)構(gòu)單體中的結(jié)合模式，肽單位的方向，主鏈二面角的值，芳香基團(tuán)的相反作用角及空腔的大小等標(biāo)準(zhǔn)評估模型的質(zhì)量。此外，檢查該模型不適當(dāng)包埋的電荷，特別是暴露的疏水殘基和能量方面二硫鍵不適當(dāng)?shù)奈恢?。從Ponder & Richards旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體庫(Ponder等人，(1987)J.Mol.Biol 193，775-791)選擇相關(guān)的側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。來自該庫的特定側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的最終選擇是以上述提到的結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)評價為基礎(chǔ)的。用MD將側(cè)鏈原子退火到位。有關(guān)該模型結(jié)構(gòu)與已知結(jié)構(gòu)特性一致性的詳細(xì)檢測及優(yōu)化結(jié)構(gòu)特征的EM和MD計算使得可得到Rhizomucor miehei脂酶的可靠的全原子模型。用MD計算機(jī)模擬分析得到Rhzomucor miehei脂酶的“開”構(gòu)象，其中將C10-甘油三酯對接在脂酶的活性位點。與發(fā)表的開結(jié)構(gòu)構(gòu)象特征(Derewenda等人，Biochemistry(1992)31，1532-1541)作詳細(xì)的比較發(fā)現(xiàn)，用這種方法得到的“開”構(gòu)象的計算機(jī)模型是基本相同的。
從真菌Rhizomucor miehei脂酶的已知3D結(jié)構(gòu)開始，通過使用SYBYL分子模擬軟件包(TRIPOS associates Inc.St.Louis，Missouri)的COMPOSER軟件提供的法則為基礎(chǔ)的可對比模擬技術(shù)得到Humicola Langinosa脂酶“開”和“關(guān)閉”的3D-結(jié)構(gòu)。用與上述相同的計算方法改進(jìn)得到的Humicola Lanuginosa脂酶模型。
通過比較真菌Rhizomucor miehei脂酶和Humicola Lanuginosa脂酶的三維(3D)結(jié)構(gòu)，鑒定與底物吸附到酶上有關(guān)的脂酶分子部分。
從茄病鐮孢角質(zhì)酶的已知3D結(jié)構(gòu)開始，通過使用SYBYL分子模擬軟件包(TRIPOS associates Inc.St.Louis，Missouri)的COMPOSER軟件中提供的法則為基礎(chǔ)的可對比模擬技術(shù)，得到盤長孢狀毛盤孢角質(zhì)酶的3D-結(jié)構(gòu)。用與上述相同的計算方法，改進(jìn)得到的盤長孢狀毛盤孢角質(zhì)酶模型。
從下列表Ⅱ中列出的脂解酶的三維結(jié)構(gòu)，出乎意料地觀察到人們可以定義一個特定的載體，該載體最小面積地覆蓋茄病鐮孢角質(zhì)酶116到120殘基的全部Ca-原子。該載體基本上垂直于與底物發(fā)生相互作用的表面。
從下列表Ⅱ，接著比較大量不同來源脂解酶的一級序列，來自茄病鐮孢的角質(zhì)酶的氨基酸殘基116到120似乎位于具有很大程度功能同源性的區(qū)域。用脂解酶的一致序列Gly-(His/Tyr)-Ser-X-Gly可以指導(dǎo)排列。
表ⅡHumicola Lanuginosa 脂酶 YRVVFTGHSLGGALATVAGADLRGNGY米赫毛霉脂酶 YDVAVTGHSLGGATALLCALGLYQREE人胰脂酶 SNVHVIGHSLGAHAAGEAGRRTVGTIG鐮刀菌屬種的角質(zhì)酶 ATLEAGGYSQGAALAAASIEDLDSAIR盤長孢狀毛盤孢角質(zhì)酶 AAIVSGGYSQGTAVMAGSISGLSTTIK因此，我們使用覆蓋茄病鐮孢角質(zhì)酶中氨基酸殘基116到120的載體以確定部分角質(zhì)酶分子，其中應(yīng)進(jìn)行氨基酸修飾以使得到其有改善的洗滌用活性的角質(zhì)酶。下列表Ⅲ給出了表Ⅱ中所示脂解酶所鄰接的氨基酸的結(jié)構(gòu)。
表Ⅲ鏈 鏈 螺旋 活性位點H.lanuginosa脂酶 138-141 142 ser*146 147-159 his258米赫毛霉脂酶 136-139 (fit:140-ser*144) 145-157 his257人胰脂酶 144-147 (fit:148-ser*152) 153-165 his263鐮刀菌角質(zhì)酶 112-115 (fit:116-ser*120) 121-133 his188盤長孢狀毛盤 112-115 (fit:116-ser*120) 121-133 his188孢角質(zhì)酶Ser*=活性位點的絲氨酸本發(fā)明一方面是提供一種具有改善的洗滌用脂解活性的修飾過的角質(zhì)酶，其中修飾氨基酸的序列以提高該酶表面的疏水性。最好是提高鄰近脂接觸區(qū)的酶表面的疏水性以形成增大的脂接觸區(qū)。
通過用選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和組氨酸的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基，可達(dá)到提高角質(zhì)酶表面疏水性的目的。優(yōu)選的是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
發(fā)現(xiàn)除以這樣的方式修飾氨基酸序列有助于提高表面疏水性外，還可通過導(dǎo)入一個或多個賴氨酸或精氨酸殘基來導(dǎo)入一個或多個正電荷。
最好是，修飾的殘基位于由載體確定的分子部分，該載體最小面積覆蓋茄病鐮孢角質(zhì)酶殘基116到120的全部Ca-原子，或不同角質(zhì)酶相應(yīng)的Ca-原子，并水平垂直于所述載體，同時含殘基117的Ca-原子，或不同角質(zhì)酶相應(yīng)的Ca-原子。
如上所述，已公開了茄病鐮孢角質(zhì)酶的三維結(jié)構(gòu)。在那種情況下，應(yīng)清楚修飾將會產(chǎn)生在本發(fā)明范圍內(nèi)的修飾物。假如還不知道特定角質(zhì)酶的三維結(jié)構(gòu)，然而，通過排列已知序列(見圖12)的氨基酸序列，根據(jù)脂解酶的一致序列Gly-(His/Tyr)-Ser-X-Gly，可以得到在本發(fā)明范圍內(nèi)的修飾物。最好是，在該方法中也使用分子模擬技術(shù)。
按本發(fā)明生產(chǎn)的角質(zhì)酶變異體，若用作洗滌劑或清洗組合物的成分，可在酶活性方面帶來優(yōu)越性。特別是，在洗滌過程的主要環(huán)節(jié)中，發(fā)現(xiàn)它們有改善的洗滌用性能。洗滌過程主要環(huán)節(jié)中的洗滌用性能，是指用正常的洗滌條件(就所關(guān)心的濃度、水的硬度、溫度而言)，在歐洲型自動洗衣機(jī)的單一洗滌過程中，含酶的洗滌劑組合物能夠從弄臟的織物上除去顯著量的油污。應(yīng)注意到，在相同條件下，傳統(tǒng)商業(yè)上可得到的脂解酶Lipolase(TM)(來自Novo Nordisk)對油污看起來沒有任何顯著的洗滌用效果。
用下列檢測評估酶對油污的洗滌用效果。將棉含量低于10%的新聚酯試驗品用無酶的洗滌劑產(chǎn)品(如下列給出的一種)預(yù)洗滌，隨后徹底地漂洗。然后用橄欖油或另一種適宜的，可水解油污弄臟上述未臟的布。在100ml聚苯乙烯瓶的30ml洗滌液中溫育每塊試驗品布(重約1g)。該洗滌液含有下列以每升1g的劑量給出的洗滌劑產(chǎn)品。在充滿水的iele TMT洗衣機(jī)中，并使用正常的30℃主要洗滌步驟將瓶子攪拌30分鐘，以3LU/ml將角質(zhì)酶加到洗滌液中。對照組不含任何酶。洗衣粉有下列組分(以%重量計)乙氧化醇非離子表面活性劑 9.5硫酸鈉 38.6碳酸鈉 40.4硅酸鈉(Na2O∶Si2O＝2.4) 7.3水 4.2我們用C12-C15的乙氧化醇10.5-13EO作為非離子表面活性劑，但乙氧化醇非離子的天然物可在很寬的范圍內(nèi)變化。
洗滌后，用冷水徹底地漂洗布并在帶冷空氣的滾動干燥器中干燥，并估算殘留的脂肪量。這可以由幾種方法完成。普通方法是在Soxhlet提取裝置中用石油醚提取布，蒸發(fā)掉溶劑并通過稱重確定殘余的脂肪物質(zhì)占布上起初量脂肪部分的百分比。
按第二種，更靈敏的方法，用溴化了的橄欖油弄臟試驗布(Richards，S.，Morris，M.A.and Arklay，T.H.(1868)，Textile Research Journal 38，105-107)。然后將每一件試驗布在100ml聚苯乙烯瓶的30ml洗滌液中溫育。在充滿中的洗衣機(jī)中并用常規(guī)的30℃主要洗滌步驟攪拌一系列瓶子。主要洗滌后，在5秒鐘內(nèi)，用冷水仔細(xì)漂洗試驗品布。漂洗后即刻將試驗布放在帶冷空氣的干燥機(jī)中干燥。干燥后，用X射線熒光光譜測定法，通過測量布的溴含量來確定殘余的脂肪量?？蓪⒅厩宄看_定為在布上開始存在的量的百分比，如下
%污跡去除量＝ (溴bw-溴aw)/(溴bw) ＊100%其中溴bw是指洗滌前布上的百分比溴，溴aw是洗滌后布上的百分比溴。
評估酶活性的另一種方法是按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量在460nm的反射度。
在本發(fā)明上下文中，修飾的、突變的或突變體酶或酶變異體是指經(jīng)表達(dá)突變基因的突變生物生產(chǎn)的酶。突變基因(而不是僅含無癥狀突變的突變基因)是指編碼一種酶的基因，該酶具有直接或間接得自相應(yīng)母體酶序列，與相應(yīng)的母體酶序列有一個或多個位置不同的氨基酸序列。母體酶指相應(yīng)的未改變基因的基因產(chǎn)物?；蛑械臒o癥狀突變是指(歸因于密碼子-氨基酸關(guān)系中多余度的)不會改變由該基因編碼的酶的氨基酸序列的基因多核苷酸序列中產(chǎn)生的改變或差異。
突變體或突變的微生物是指一種母體微生物經(jīng)受涉及其酶基因突變的微生物或者由經(jīng)受涉及其酶基因突變的母體微生物轉(zhuǎn)變而來的微生物?？赏ㄟ^(a)突變已存在于母體微生物中的相應(yīng)基因(母本基因)，或(b)轉(zhuǎn)移(導(dǎo)入)直接或間接從其它來源得到的相應(yīng)基因，并然后導(dǎo)入(包括基因的突變)到該微生物中使其變成突變微生物。宿主微生物是一種突變基因或其它來源的轉(zhuǎn)移基因構(gòu)成其一部分的微生物。一般，它可以是與母本微生物相同或不同菌株或種源或血緣的。
特別是，本發(fā)明提供WO-A-90/09446(Plant Genetics Systems)中公開的茄病鐮孢角質(zhì)酶，Colletotrichumcapsici，盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea角質(zhì)酶的突變形式。通過rDNA修飾的含經(jīng)rDNA技術(shù)得到或加工的基因的微生物，可以生產(chǎn)這些角質(zhì)酶變異體。
一旦鑒定了位于由載體確定的分子部分的氨基酸殘基，所述載體最小面積覆蓋Fusarium solanipisi角質(zhì)酶殘基116到120的全部Ca-原子，或不同角質(zhì)酶相應(yīng)的Ca-原子，并水平垂直于所述載體且含有殘基117的Cα-原子，或不同角質(zhì)酶相應(yīng)的Cα-原子，人們就可以通過在一個或多個鑒定的位置導(dǎo)入適宜的氨基酸從而修飾氨基酸序列，例如突變N712K涉及茄病鐮孢角質(zhì)酶或其同源物的序列。
上述修飾將會影響角質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)，這對于專業(yè)人員是顯而易見的。顯然，優(yōu)選的修飾是對活性位點周圍的靜電荷不會影響太多。本發(fā)明人已經(jīng)研究了了解酶構(gòu)象的必然扭曲與提高酶活性益處間平衡的必需水平，這樣可以預(yù)測并生產(chǎn)具有高成功率的成功的角質(zhì)酶。
在下列表Ⅳ和本說明書的其它部分，用下列一個字母和三個字母的縮寫表示肽中的氨基酸和氨基酸殘基
表ⅣA=Ala=丙氨酸 V=Val=纈氨酸L=Leu=亮氨酸 I=ILe=異亮氨酸P=Pro=脯氨酸 F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸 M=Met=甲硫氨酸G=Gly=甘氨酸 S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸 C=Cys=半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸 N=Asn=天冬酰胺Q=Gln=谷氨酰胺 D=Asp=天冬氨酸E=Glu=谷氨酸 K=Lys=賴氨酸R=Arg=精氨酸 H=His=組氨酸在本說明書中，突變存在于蛋白質(zhì)的氨基酸序列，因此，可以以下列簡化的方式通過突變位置和突變性質(zhì)描述突變體蛋白質(zhì)本身通過鑒定由突變影響的原氨基酸殘基;突變位點(序列號);通過鑒定代替原氨基酸殘基的取代氨基酸殘基。如果將一個額外的氨基酸插入到序列中，則用一個或多個腳注字母標(biāo)明其位置，所述腳注字母附于標(biāo)準(zhǔn)序列或參考序列最后一個在前成員的序號上。
例如，將其特征在于172位由賴氨酸取代天冬酰胺的突變體表示為Asn172Lys或N172K。將在天冬酰胺后(假設(shè))插入的一個附加的氨基酸殘基如脯氨酸表示為Asn172Asn Pro或N172NP，另一種表示為為＊172aP，插入的殘基表示為位置號172a。將在相同位置天冬酰胺的(假設(shè))缺失表示為Asn172＊功N172＊。星號表示在所標(biāo)明位置缺失或丟失的氨基酸殘基，或者將其看成由實際缺失或僅與在該位置有一個殘基的另一個或參考序列比較引起的丟失或與之同源。
由加號將多突變分開，如，N172K+S541+A128F表示一種帶有3個取代突變的突變體蛋白質(zhì)，標(biāo)明在氨基酸序列分別在這三個所提及的位置上的取代。如果需要，可將下列表中所給的突變結(jié)合起來。
下面所給的表Ⅴ表示根據(jù)本發(fā)明特定有用的角質(zhì)酶變異體的實例，是以茄病鐮孢角質(zhì)酶的序列為基礎(chǔ)的。
表Ⅴ茄病鐮孢角質(zhì)酶的變異體T19V、G41A、T45K、T45P、*149a、S54l、N58R、G75R、A76P、G82A、D83S、A85F、A85V、S92R、A93V、L99K、G100R、A127L、A128F、N172K、T173I、T179F、I183F、V184I、A185L、L189F、A190L、D194R、G197V、E201K。
按照本發(fā)明，優(yōu)選的變異體是茄病鐮孢角質(zhì)酶的A85F，N172K和E201K，以及其它角質(zhì)酶相應(yīng)的變異體。上述相應(yīng)角質(zhì)酶變異體的實例是來自盤長孢狀毛盤孢角質(zhì)酶的變異體Asp172Lys或D172K。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供生產(chǎn)本發(fā)明角質(zhì)酶變異體的方法。產(chǎn)生天然角質(zhì)酶的微生物一般是植物病原體，并且這些微生物不太適合作為修飾角質(zhì)酶基因的宿主細(xì)胞。因此，將編碼修飾的(前)角質(zhì)酶的基因整合到rDNA載體中。可將該載體轉(zhuǎn)移到對于rDNA技術(shù)優(yōu)選的宿主微生物中。為了達(dá)到這一目的，可以使用與WO-A-90/09446中描述的rDNA載體基本相似的rDNA載體。
產(chǎn)生天然角質(zhì)酶的微生物不太適合發(fā)酵方法。為了提高發(fā)酵過程的產(chǎn)率，應(yīng)將編碼改進(jìn)的角質(zhì)酶的基因轉(zhuǎn)移到可在廉價的培養(yǎng)基上快速生長并能合成和分泌大量角質(zhì)酶的微生物中。根據(jù)本發(fā)明，上述適宜的rDNA修飾的宿主微生物是細(xì)胞，連同其它一道的，芽孢菌、棒狀桿菌、葡萄球菌和鏈霉菌，或低等真核生物，如啤酒酵母及有關(guān)的種，馬克斯克魯維氏酵母和相關(guān)的種，多形漢遜氏酵母和有關(guān)的種，以及曲霉菌屬的種。優(yōu)選的宿主微生物是低等真核生物，由于這些微生物在發(fā)酵過程中能夠很好地生產(chǎn)并分泌酶并能夠使角質(zhì)酶分子糖基化。糖基化作用可以影響角質(zhì)酶在洗滌劑系統(tǒng)中的穩(wěn)定性。
本發(fā)明也提供通過將修飾的真核角質(zhì)酶基因(如來自茄病鐮孢的基因)導(dǎo)入克隆的rDNA載體而得到的遺傳工程物質(zhì)，以及它們轉(zhuǎn)化新宿主細(xì)胞并在新宿主細(xì)胞中表達(dá)角質(zhì)酶變異體基因的用途。
本發(fā)明也提供用rDNA技術(shù)生產(chǎn)或修飾的多核苷酸(它編碼上述的角質(zhì)酶變異體)，含所述多核苷酸的rDNA載體，以及含所述多核苷酸和/或所述rDNA載體的rDNA修飾的微生物。本發(fā)明也提供編碼修飾的真核角質(zhì)酶的相應(yīng)多核苷酸，例如，一種具有編碼成熟角質(zhì)酶變異體的堿基序列的多核苷酸，在多核苷酸中，在最后的轉(zhuǎn)譯密碼子后接著終止密碼子，并且可選擇地直接在編碼成熟角質(zhì)酶變異體的核苷酸序列上游，有編碼該角質(zhì)酶變異體前原-或前-序列的核苷酸序列。
在上述多核苷酸中，可以修飾得自原生物的編碼角質(zhì)酶的核苷酸序列，以便將至少一個密碼子，且最好是盡可能多的密碼子加工成“無癥狀”突變的主體以形成編碼相同氨基酸殘基的密碼子，并作為新宿主優(yōu)選的密碼子，由此提供在上述宿主細(xì)胞中使用的，用于改善穩(wěn)定性的導(dǎo)入基因的信使-RNA。
在編碼前-或成熟角質(zhì)酶的核苷酸序列的上游，可安放一種編碼適用于所選宿主的信號或分泌序列的核苷酸序列。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及將編碼角質(zhì)酶變異體或其前體的核苷酸序列插入于其中的rDNA載體。
核苷酸序列可以得自例如(a)一種天然產(chǎn)生的核苷酸序列(如，編碼由茄病鐮孢產(chǎn)生的前原-或前-角質(zhì)酶的原氨基酸序列);
(b)化學(xué)合成的核苷酸序列(由對于新宿主優(yōu)選的密碼子組子)，和導(dǎo)致新宿主中穩(wěn)定的信使RNA的核苷酸序列，還編碼原氨基酸序列;
(c)得自前面段落a或b中提到的，編碼茄病鐮孢角質(zhì)酶的核苷酸序列之一的遺傳工程方法加工的核苷酸序列，它具有不同的氨基酸序列但在洗滌劑系統(tǒng)中有更好的穩(wěn)定性和/或活性。
總之，在優(yōu)選的宿主之一中，能直接表達(dá)編碼上述角質(zhì)酶基因的核苷酸序列的rDNA載體最好含有下列組分(a)編碼成熟角質(zhì)酶或前角質(zhì)酶或相應(yīng)的前角質(zhì)酶的雙鏈(ds)DNA，其中至少已將部分前序列直接從分泌信號(對于所選的宿主細(xì)胞是優(yōu)選的)的下游除去。如果應(yīng)被轉(zhuǎn)譯的基因部分未從密碼子ATG開始，則應(yīng)把ATG密碼子放在前面。轉(zhuǎn)譯部分的基因應(yīng)總是由適當(dāng)?shù)慕K止密碼子來結(jié)束;
(b)一個表達(dá)調(diào)節(jié)子(適用于所選的宿主物)，位于編碼角質(zhì)酶(組分(a))的dsDNA正鏈上游;
(c)一個終止序列(適用于所選的宿主生物)，位于編碼角質(zhì)碼(組分(a))的dsDNA的正鏈上游;
(d1)有利于整合到所選宿主基因組中的dsDNA的核苷酸序列或，(d2)適用于所選宿主的復(fù)制原點;
(e1)選擇性地(營養(yǎng)缺陷型)選擇標(biāo)記。營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記可以由營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的編碼區(qū)和缺損啟動子組成;
(e2)可選擇地，編碼蛋白質(zhì)的dsDNA序列，所述蛋白質(zhì)涉及在所選的宿主中，角質(zhì)酶前體形式之一的成熟和/或分泌。
上述rDNA載體還可攜帶(如前定義的多核苷酸的上游和/或下游)其它可促進(jìn)角質(zhì)酶功能表達(dá)的序列。營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記可以由營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的編碼區(qū)和缺損啟動子區(qū)組成。
本發(fā)明的另一實施方案是發(fā)酵生產(chǎn)上述各種角質(zhì)酶變異體中的一種。所述發(fā)酵可以是一般的間接發(fā)酵，分批加料發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。所用的方法的選擇取決于宿主菌株和優(yōu)選的下游加工方法(已知的本身)。因此，本發(fā)明也提供用于生產(chǎn)本文所說明的角質(zhì)酶變異體的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)一種rDNA修飾的微生物的步驟，該微生物含rDNA技術(shù)加工的基因，該基因攜帶至少一個影響角質(zhì)酶氨基酸序列的突變，由于使該角質(zhì)酶具有與相應(yīng)母體酶相比改善的活性，通過從發(fā)酵液中分離由微生物生產(chǎn)的角質(zhì)酶，或從發(fā)酵液中分離微生物細(xì)胞來制備角質(zhì)酶變異體，破碎分離的細(xì)胞，用物理或化學(xué)濃縮或純化方法從所述發(fā)酵液或所述細(xì)胞中濃縮或純化角質(zhì)酶變異體。選擇優(yōu)選的條件以便由微生物將角質(zhì)酶變異體分泌到發(fā)酵液中，用過濾或離心除去細(xì)胞后，從發(fā)酵液中回收酶?？蛇x擇地，然后可將角質(zhì)酶變異體濃縮并純化至所需的程度。除微生物的特殊性質(zhì)外，這些發(fā)酵方法本身可以是以已知的發(fā)酵技術(shù)和常規(guī)使用的發(fā)酵和下游加工設(shè)備為基礎(chǔ)的。
本發(fā)明也提供用rDNA技術(shù)生產(chǎn)改變過的微生物的方法，該微生物能夠生產(chǎn)角質(zhì)酶變異體，其特征在于將導(dǎo)入微生物的編碼角質(zhì)酶變異體的基因連接在其5′-末端以得到一個編碼(修飾的)前序列功能的基因片段作為宿主生物的信號-或-分泌序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供rDNA修飾的含角質(zhì)酶變異體基因并能生產(chǎn)由所述基因編碼角質(zhì)酶變異體的微生物，在rDNA修飾的微生物中，最好除去(如，由另一個結(jié)構(gòu)基因代替)編碼天然角質(zhì)酶的基因(如果原來存在)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供含有本發(fā)明角質(zhì)酶變異體的酶洗滌劑組合物。上述組合物由角質(zhì)酶變異體和在洗滌劑系統(tǒng)中常用的其它組分(包括用于洗滌劑組合物和全配方洗滌劑和清洗組合物的附加成分，如已知本身種類和如在EP-A-258，068中描述的)。特別是，它們可含有5-60，最好是20-50%重的脫垢助洗劑和0.1-50%重的活性系統(tǒng)，依次含有0-95%重的一種或多各陰離子表面活性劑和5-100%重的一種或多種非離子表面活性劑。
上述洗滌劑組合物的其它組分可以是任何已知種類的，如GB-A-1，372，034(Unilever);US-A-3，950，277;US-A-4，011，169;EP-A-179，533(Procter & Gamble);EP-A-205，208和EP-A-206，390(Unilever);JP-A-63-078000(1988)和1988.6月的Research Diclosure 29056，中所描述的，及本文提及的幾個說明書中的每一種(所有文獻(xiàn)均引入本文作為參考)。
可以以任何穩(wěn)定的形式，即顆粒組合物酶溶液或淤漿，或與載體物質(zhì)(如EP-A-258，068和Novo Nordisk Savinase(TM)和Lipolase(TM)產(chǎn)品中的)形式，將本發(fā)明的角質(zhì)酶變異體可有效地加到洗滌劑組合物中。
可以在很寬的范圍內(nèi)選擇角質(zhì)酶變異體的加入量，如每克10-20，000LU，且最好是每克洗滌劑組合物50-2，000LU。
在本說明書中，LU或脂酶單位按它們在EP-A-258，068(Novo Nordisk)中所定義的。
在其它酶也可以是現(xiàn)存的情況下，在細(xì)節(jié)上已作必要修正時，相似考慮可以應(yīng)用。同樣參見歐洲專利申請EP-A-407，225。
在蛋白酶與角質(zhì)酶一起存在的上述洗滌劑組合物中，可得到更多的益處，從pl低于10的蛋白酶中選擇上述蛋白酶。EP-A-271，154(Unilever)描述了大量這樣的蛋白酶。在特定環(huán)境下，與角質(zhì)酶一起使用的蛋白酶可包括文獻(xiàn)中所公開的如BPN′型或許多類型的枯草桿菌蛋白酶，其中一部分已用于洗滌劑用途，如EP-A-130，756或EP-A-251，446(兩者均屬Genetech);US-A-4，760，025(Genencor);EP-A-214，435(Henkel);WO-A-87/04661(Amgen);WO-A-87/05050(Genex);Thomas等人(1986/5)Nature 316，375-376和(1987)J.Mol.Biol.193，803-813;Russel等人(1987)Nature 328，496-500中描述的突變體蛋白酶。
現(xiàn)在用下列實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，除另外說明外，基本上按Sambrook等人(1989)的描述完成用于操作和分析核酸物質(zhì)的所有技術(shù)。
附圖圖1A合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因盒1與構(gòu)成的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中標(biāo)明了寡核苷酸堿基轉(zhuǎn)換。小寫字母表示開放閱讀框架外的核苷酸位置。
圖1B合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因盒2和構(gòu)成的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中標(biāo)明了寡核苷酸的堿基轉(zhuǎn)換。
圖1C合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因盒3和構(gòu)成的寡核苷酸的核苷酸序列。在盒序列中標(biāo)明了寡核苷酸的堿基轉(zhuǎn)換圖1D編碼茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶的合成的角質(zhì)酶基因的核苷酸序列。標(biāo)明了角質(zhì)酶的前-序列，原-序列和成熟序列。也標(biāo)明了用于克隆和寡核苷酸堿基轉(zhuǎn)換的位點，小寫字母指開放閱讀框架外的核苷酸位置。
圖2合成的DNA片段的核苷酸序列，用于連接茄病鐮孢原-角質(zhì)酶編碼序列與編碼大腸桿菌phoA前-序列衍生物的序列。標(biāo)明了核糖體結(jié)合位點(RBS)和用克隆的限制酶位點。用一個字母密碼也標(biāo)明可被編碼的phoA信號序列的氨基酸序列和部分角質(zhì)酶基因。
圖3盒8的核苷酸序列，SacⅠ-BclⅠ片段編碼有關(guān)蔗糖酶前-序列編碼序列和成熟茄病鐮孢角質(zhì)酶的融合點。
圖4通過從pUR2740缺失一個0.2kb SalⅠ-NruⅠ得到的質(zhì)粒pUR2741是一個大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，含有部分pBR322，從2μm質(zhì)粒得到的酵母細(xì)胞中的復(fù)制原點，一個酵母leu 2D基因及在酵母ga17啟動子控制下的酵母蔗糖酶信號序列編碼區(qū)與植物α-半乳糖苷酶基因的融合。
圖5質(zhì)粒pUR7219是大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，含有部分pBR322，從2μm質(zhì)粒中得到的酵母細(xì)胞中的復(fù)制原點，一個酵母Leu2D基因及在酵母ga17啟動子控制下的酵母蔗糖酶信號序列編碼區(qū)與編碼成熟茄病鐮孢角質(zhì)酶的區(qū)域的融合。
圖6質(zhì)粒pUR2740是一種大腸桿菌-啤酒酵母穿梭載體，含有部分pBR322，從2μm質(zhì)粒得到的酵母細(xì)胞中的復(fù)制原點，一個酵母Leu2D基因及在酵母ga17啟動子控制下的酵母蔗糖酶信號序列編碼區(qū)與植物α-半乳糖苷酶基因的融合。
圖7盒5，6和7核苷酸序列，含有ex1A前一序列和成熟茄病鐮孢角質(zhì)酶編碼序列的不同類型的接頭。
圖8通過在pUC19的SalⅠ位點插入黑色曲霉awamori變種基因組DNA的5.3kbSalⅠ片段得到的質(zhì)粒pAW14B。
圖9通過用BspHⅠ-AflⅡ片段代替含有ex1A開放閱讀框架的BspHⅠ-AflⅡ片段得到的質(zhì)粒pUR7280，含有茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶編碼序列。因此，質(zhì)粒pUR7280含有在黑色曲霉awamori變種啟動子和終止子控制下的茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶基因。
圖10通過將黑色曲霉amds和黑色曲霉awamori變種pyrG選擇標(biāo)記導(dǎo)入pUR7280而得到的質(zhì)粒pUR7281。
圖11Fusarium solani pisi角質(zhì)酶分子的示意12Fusarium solani pisi Colletotrichum capsici盤長孢狀毛盤孢和Magnaporthe grisea角質(zhì)酶的部分氨基酸序列，表明了在3-D結(jié)構(gòu)中，殘基的位置。
圖13茄病鐮孢角質(zhì)酶和角質(zhì)酶變異體N172K的洗滌用效果。
圖14茄病鐮孢角質(zhì)酶和角質(zhì)酶變異體E201K的洗滌用效果。
圖15茄病鐮孢角質(zhì)酶和角質(zhì)酶咳A85F的洗滌用效果。
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R6和R7各自獨立地代表氫，或任意取代的烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烷氧基羰基、芳基或芳烷基;
所述方法包括a)適宜時，在稀釋劑和反應(yīng)助劑存在下，將式(Ⅱ)的1H-三唑啉酮
(Ⅱ)(其中R1、R2和X的定義同前)，與式(Ⅲ)的鹵代苯衍生物反應(yīng)，
(Ⅲ)(其中R3、R4和R5的定義同前，Hal代表鹵素);或b)適宜時，在稀釋劑和反應(yīng)助劑存在下，將式(Ⅰa)的取代的三唑啉酮
(Ⅰa)(其中R1、R2、R3、R5和X的定義同前，R8代表鹵素)，與式(Ⅳ)的親核試劑反應(yīng)，R9-Z-H(Ⅳ)其中Z代表氧、硫或基團(tuán)-N(R7)-，
實施例1;
構(gòu)建編碼茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶的合成基因。
基本上按EP-A-407225(Unilever)中的描述構(gòu)建編碼茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶的合成基因。以公開的茄病鐮孢基的核苷酸序列(Soliday等人，(1984)和WO-A90/09446，Plant Genetic Systems)為基礎(chǔ)，設(shè)計一個完全的合成DNA片段，它含有編碼茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶多肽的區(qū)域。與原始的茄病鐮孢基因序列相比，通過該基因內(nèi)適當(dāng)?shù)奈恢脤?dǎo)入限制酶識別位點而不影響被編碼的氨基酸序列，該合成的角質(zhì)酶基因含有幾個核苷酸的變化。在圖1D中展現(xiàn)了完整合成角質(zhì)酶基因的核苷酸序列。
從合成的DNA寡核苷酸開始，通過組合三個單獨的盒，完成合成角質(zhì)酶基因的構(gòu)建。將每個合成DNA盒在起始端加上一個EcoRⅠ位點，在末端加一個HindⅢ位點。用Applied Biosystems 380A DNA合成儀合成寡核苷酸并用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。為了構(gòu)建每個盒，接著用下列概述的方法。將構(gòu)成一個所給定盒的等摩爾量(50pmol)寡核苷酸混合，在其5′-末端磷酸化，退火并按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接。用EcoRⅠ和HindⅢ切割所得的雙鏈DNA混合物，用瓊脂糖凝膠電泳按大小分級分離，并用電洗脫從凝膠中回收。將所得的合成DNA盒與PUC9的2.7kbEcoRⅠ-HindⅢ片段連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用適宜的寡核苷酸引物以兩個方向?qū)Υ罅靠寺〉腅coRⅠ-HindⅢ插入物作完全定序以確定合成盒的序列。用這種方法，構(gòu)建pUR7207(合盒1，圖1A)，pUR7208(合盒2，圖1B)和pUR7209(含盒3，圖1C)。最后，通過將pUR7207的2.9kbEcoRⅠ-ApaⅠ片段與pUR7208的0.2kbApaⅠ-NheⅠ片段和pUR7209的0.3kbNheⅠ-HindⅢ片段結(jié)合在一起產(chǎn)生pUR7210，組成合成角質(zhì)酶基因。該質(zhì)粒含有一個編碼完整茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶的開放閱讀框架(圖1D)。
實施例2在大腸桿菌中表達(dá)茄病鐮孢(原)角質(zhì)酶用合成的角質(zhì)酶基因構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體，其與WO-A-90/09446(Plant Genetic Systems)中描述的一種功能上相似。設(shè)計一個構(gòu)建體，其中適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌表達(dá)信號在編碼茄病鐮孢原-角質(zhì)酶的合成基因部分之前，這些信號即，(ⅰ)一個可誘導(dǎo)的啟動子，(ⅱ)一個核糖體結(jié)合位點和(ⅲ)一個信號序列，該序列提供轉(zhuǎn)譯起始信密碼子并提供將原-角質(zhì)酶運出胞質(zhì)膜所需的信息。
設(shè)計一個合成連接子(見圖2)以便將大腸桿菌phoA信號序列(Michaelis等人，1983)的衍生物與合成角質(zhì)酶基因的原序列融合。為了使信號肽的斷裂及原-角質(zhì)酶的分泌達(dá)到最佳水平，所述接頭的核苷酸序列便于將該連接子核苷酸序列phoA信號序列的3個C-末端氨基酸殘基(Thr-Lys-Ala)變成Ala-Asn-Ala并將角質(zhì)酶原序列的N-末端氨基酸殘基(Leu1，見圖1D)變成Ala。該構(gòu)建確保將角質(zhì)酶分泌到外周胞質(zhì)空間(參見WO-A90/09446，Plant Genetic Systems)。
為了得到上述構(gòu)建體，從pUR7210中除去含角質(zhì)酶前-序列和部分原-序列的69bpEcoRⅠ-SpeⅠ片段并用合成的DNA連接子序列(EcoRⅠ-SpeⅠ片段)代替，該連接子序列提供大腸桿菌phoA前序列的衍生物以及角質(zhì)酶原-序列的改變的N-末端氨基酸殘基(圖2)。將所得的質(zhì)粒命名為pUR7250并將其用于0.7kbBamHⅠ-HindⅢ片段的分離，該片段含一個核糖體結(jié)合位點和與phoA信號序列編碼區(qū)融合的原-角質(zhì)酶編碼區(qū)。將該片段與pMMB67EH(Fürste等人，1986)的8.9kb BamHⅠ-HindⅢ片段連接以得到pUR7220。在該質(zhì)粒中將編碼原-角質(zhì)酶的合成基因與phoA信號序列的改變的變體融合，并置于可誘導(dǎo)的tac-啟動子的控制下。
在2升含0.5升ⅨTB培養(yǎng)基(Tartof和Hobbs，1988)的搖瓶中生長含pUR7220的大腸桿菌菌株WK6，ⅨTB培養(yǎng)基由下列組成0.017MKH2PO40.017MK2HPO412g/1Bacto-胰蛋白胨24g/1Bacto-酵母提取物0.4%甘油(V/V)在劇烈的振蕩(150rpm)下，在存在100μg/ml氨芐青霉素的情況下，使培養(yǎng)物于25℃-30℃生長過夜至610nm處OD值為10-12。然后，將IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)加到10μm的終濃度，并繼續(xù)溫育另一個12-16小時。當(dāng)可觀察到生產(chǎn)的脂解活性量沒有進(jìn)一步顯著增加(通過分析從培養(yǎng)物取出的樣品來判斷)時，通過離心收集細(xì)胞，并于0℃將其再懸于原培養(yǎng)體積的含20%蔗糖的緩沖液中。通過離心收集細(xì)胞，并將其再懸于原培養(yǎng)體積的冰冷水中，通過滲透休克溶解細(xì)胞。通過離心除去細(xì)胞碎片，用乙酸將無細(xì)胞提取物酸化至PH4.8，于4℃過夜，除去所得的沉淀。通過超濾及冷凍干燥無細(xì)胞提取物，在該步可得到基本上沒有外源脂酶，純度大于75%的角質(zhì)酶制品。另外，通過將酸化的細(xì)胞游離提取物負(fù)載到SP-sephadex，用PH8.0的緩沖液洗脫酶，濃縮堿溶液通過一個適宜的DEAE-纖維素(Whatman DE-52)柱并直接使DEAE流到Q-sepharose HP(Pharmacia)柱，可將角質(zhì)酶純化到勻質(zhì)(即，純度大于95%)。用鹽梯度洗脫得到一般總產(chǎn)率大于75%的勻質(zhì)角質(zhì)酶制品。
實施例3構(gòu)建編碼茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體的基因用實施例1中描述的茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶的合成基因，構(gòu)建被編碼的氨基酸序列中有改變的變異體基因。為了完成該構(gòu)建，使用與實施例1中描述的基本相同的方法構(gòu)建組成完全合成角質(zhì)酶基因的三個盒。例如，用與實施例1中描述的相同的寡核苷酸(除覆蓋被誘變位置(即，Asn 172)的編碼三聯(lián)體的兩個寡核苷酸不同外)，通過裝配一種新型的盒3來構(gòu)建編碼茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體N172K的基因。而使用兩個含突變序列的新的合成寡核苷酸，但在其它方面與它們?nèi)〈脑押塑账嵯嗤?。特別是，通過摻入CUT13DMH變異體(含AAG代替AAT)和CUT13KMH變異體(含CTT代替ATT)代替CUT13DMH和CUT13KMH(見圖1C)，裝配含突變N172K的新盒3?；旧习磳嵤?所述克隆并定序新盒3，并將含突變的0.3kb NheⅠ-HindⅢ DNA片段換成pUR7210中的相應(yīng)片段，得到pUR7257(N172K)。用來自該質(zhì)粒的0.6KSpeⅠ-HindⅢ片段代替pUR7220中相應(yīng)片段，得到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pUR7224(N172K)。用該大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株WK6。按實施例2中的描述使轉(zhuǎn)化體生長，并基本按實施例2中的描述回收并純化變異體原-角質(zhì)酶。
以類似的方法，通過摻入CUT13FMH變異體(含AAG代替GAG)和CUT13MMH變異體(含CTT代替CTC)代替CUT13FMH和CUT13MMH(見圖1C)組建一種新的盒3，從而構(gòu)建編碼茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體E201K的基因。
以類似的方法，通過摻入CUT12CMH變異體(含TTC代替GCT)和CUT121MH變異體(含GAA代替AGC)代替CUT12CMH和CUT121MH(見圖1B)組建新的盒2，從而構(gòu)建編碼茄病鐮孢，角質(zhì)酶變異體A85F的基因。
實施例4在啤酒酵母中表達(dá)茄病鐮孢角質(zhì)酶為了在啤酒酵母中表達(dá)合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因，構(gòu)建一個表達(dá)載體，其中啤酒酵母蔗糖酶(Taussig和Carlsson，1983)的前序列和強(qiáng)的，可誘導(dǎo)ga17啟動子(Nogi和Fukasawa，1983)在編碼成熟角質(zhì)酶的合成基因之前。為了制備有關(guān)上述融合的合成角質(zhì)酶基因，合成一個銜接頭片段，其中將有關(guān)蔗糖酶前序列的編碼區(qū)與編碼成熟角質(zhì)酶N-末端的序列融合。基本上按實施例1中的描述(盒8，見圖3)，將該片段在pUC9中組合成EcoRⅠ-HindⅢ盒，得到pUR7217。將質(zhì)粒pUR7210和pUR7217轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM110(一種沒有母本甲基酶活性的菌株)中，并將pUR7217的2.8kbBclⅠ-HindⅢ片段與pUR7210的0.6kbBclⅠ-HindⅢ片段連接，產(chǎn)生pUR7218，其中將編碼成熟酶肽的核苷酸序列與部分啤酒酵母蔗糖酶前序列編碼區(qū)融合。
通過分離pUR2740的8.9kb NruⅠ-SalⅠ片段，用klenow聚合酶填平SalⅠ延伸的末端，并使片段再環(huán)化，從而從pUR2740(Verbakel，1991，見圖6)制得表達(dá)載體pUR2741(見圖4)。將pUR2741的7.3kbSacⅠ-HindⅢ片段與pUR7218的0.7kbSacⅠ-HindⅢ片段連接，得到pUR7219(見圖5)?？蛇x擇地，將啤酒酵母polⅡ終止子放在角質(zhì)酶基因后，HindⅢ位點中，證明它對于角質(zhì)酶基因的有效表達(dá)不是必需的。大腸桿菌-啤酒酵母穿梭質(zhì)粒PUR7219含有于攜帶2μ質(zhì)粒的啤酒酵母菌株(Cir+菌株)中起作用的復(fù)制原點，使得可選擇啤酒酵母leu2-菌株中高拷貝量轉(zhuǎn)化體的啟動子-缺陷性的啤酒酵母leu2基因，在強(qiáng)的，可誘導(dǎo)啤酒酵母ga17啟動子調(diào)控下的與啤酒酵母蔗糖酶前-序列相連的編碼成熟部分茄病鐮孢角質(zhì)酶的合成基因。
用有關(guān)酵母細(xì)胞電穿孔的標(biāo)準(zhǔn)方法，用2μ啤酒酵母質(zhì)粒和pUR7219的等摩爾混合物共轉(zhuǎn)化與菌株YT6-2-1L(Erhart和Hollenberg，1981)相同的啤酒酵母菌株SU50(a，cir，Leu2，his4，can1)。篩選亮氨酸原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體，并從許多轉(zhuǎn)化體中分離總DNA。所有轉(zhuǎn)化體似乎均含2μ質(zhì)粒和pUR7219，例證為，由于同時存在2μ酵母質(zhì)粒，所以若存在高拷貝數(shù)時，pUR7219所含的啟動子-缺陷型Leu2基因可僅能從功能補(bǔ)充Leu2缺陷型菌株。通過在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)40代，接著在選擇和完全固體培養(yǎng)基上影印培養(yǎng)，得到啤酒酵母菌株SU51(a，Cir+，leu2，his4，can1)。而一個轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定地含有pUR7219質(zhì)粒。
使含pUR7219的啤酒酵母菌株SU51在含0.2升MM培養(yǎng)基的1升搖瓶中生長，MM培養(yǎng)基由下列組成-沒有氨基酸的酵母氮成分(YNB) 6.7g/l-組氨酸 20mg/l-葡萄糖 20g/l使培養(yǎng)物在劇烈振蕩(150rpm)下。于30℃生長過夜到610nm的OD值為2-4。離心收集細(xì)胞并將其再懸于2升搖瓶中的1升YPGAL培養(yǎng)基，YPGAL培養(yǎng)基有下列組成-酵母提取物 10g/l-細(xì)菌用蛋白胨 20g/l-半乳糖 50g/l并繼續(xù)再培養(yǎng)12-16小時。以有規(guī)律時間間隔從培養(yǎng)中取出樣品并離心以除去生物質(zhì)。用橄欖油作為底物，通過效價滴定檢測，分析上清液的角質(zhì)酶活性。對于每個樣品，將100到200μl間的濾液加到5.0ml脂酶底物(Sigma，含作為脂酶底物的橄欖油)和25.0ml緩沖液(5mM Tris-HCl pH9.0，40mM NaCl，20mM CaCl2)的攪拌混合物中。在30℃完成檢測，并使用Mettler DL25滴定儀，通過用0.05M NaOH自動滴定到pH9.0，來測量脂肪酸的釋放。得到對時間的滴定劑量曲線。從曲線的最大斜率計算樣品中所含的脂酶量。將1個單位的酶活性定義為在上述定義的條件下，1分鐘內(nèi)從橄欖油釋放1μmol脂肪酸的酶量。上述測定法是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。
當(dāng)角質(zhì)酶活性不再提高時，通過離心除去細(xì)胞，用乙酸將無細(xì)胞提取物酸化至pH4.8，并按實施例1描述回收角質(zhì)酶。
實施例5在啤酒酵母中表達(dá)茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體以下列方式，在啤酒酵母中表達(dá)茄病鐮孢角質(zhì)酶的變異體N176k。用pUR7257(N172K)的0.5kb ApaⅠ-HindⅢ片段代替pUR7218的類似片段，得到pUR7228(N172K)，其中將含突變的該基因與編碼啤酒酵母信號序列的序列進(jìn)行可操作的融合，將pUR2741的7.0kbSacⅠ-HindⅢ片段與pUR7228(N172K)的0.7kbSacⅠ-HindⅢ片段連接，得到pUR7234(N172K)。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株SU51。按實施例4中的描述培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，并按實施例4和1中的描述，從培養(yǎng)液中回收生產(chǎn)的變異體酶。
按實施例3中的描述，用編碼角質(zhì)酶變異體E201K的茄病鐮孢基因變異體以相同的方式在啤酒酵母中生產(chǎn)茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體E201K。
按實施例3中的描述，用編碼角質(zhì)酶變異體A85F的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因變異體以相同的方式，在啤酒酵母中生產(chǎn)茄病鐮孢pisi角質(zhì)酶變異體A85F。
實施例6在曲霉菌中表達(dá)茄病鐮孢角質(zhì)酶為了在黑色曲霉awamori變種中表達(dá)合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因，構(gòu)建一個表達(dá)形體，其中將編碼茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶的合成基因置于黑色曲霉awamori變種強(qiáng)的，可誘導(dǎo)exlA啟動子(Maat等人，1992，de Graaff等人，1992)的控制下。
從質(zhì)粒pAW14B開始構(gòu)建前-原-角質(zhì)酶表達(dá)質(zhì)粒(pUR7280)，pAW14B于1990.5.31保藏在大腸桿菌菌株JM109中，寄存于Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn，The Netherland，保藏號為No CBS237.90，該質(zhì)粒含有在其上定位了一個0.7kb內(nèi)切木聚糖酶Ⅱ(exlA)基因的約5.3kbSaLⅠ片段，及2.5kb的5′-側(cè)序列和2.3kb的3′-側(cè)序列(圖8)。在pAW14B中，用前-原角質(zhì)酶編碼區(qū)代替exlA編碼區(qū)。含有ex1A基因第一密碼子(ATG)的BspHⅠ位點(5′-TCATGA-3′)和含有ex1A基因終止密碼子(TAA)的AflⅡ位點(5′-CTTAAG-3′)有利于pUR7280的構(gòu)建。
按如下完成構(gòu)建用BspHⅠ部分切割pAW14B(7.9kb)并從瓊脂糖凝膠中分離線性化的質(zhì)粒(7.9kb)。隨后，用BsmⅠ切割分離的7.9kb片段，切割所需BspHⅠ位點下游的少數(shù)核苷酸，以除去在其它BspHⅠ位點線性化的質(zhì)粒，在瓊脂糖凝膠上分離開片段，并分離7.9kbBspHⅠ-BsmⅠ片段。用AflⅡ部分切割該片段，并分離得到的7.2kbBspHⅠ-AflⅡ片段。
將含有編碼茄病鐮孢前-原-角質(zhì)酶的完整開放閱讀框架的pUR7310的0.7kb BspHⅠ-AflⅡ片段與pAW14B的7.2kbBspHⅠ-AflⅡ片段連接，得到pUR7280。隨后，可將構(gòu)建的載體(pUR7280)用常規(guī)的共轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)移到霉菌(如黑色曲霉，黑色曲霉awamori變種，等)中，并然后經(jīng)內(nèi)切木聚糖酶啟動子的誘導(dǎo)而表達(dá)前-原-角質(zhì)酶基因。也可以經(jīng)構(gòu)建的rDNA載體提供常規(guī)的選擇標(biāo)記(如amds或pyrG，潮霉素，等)并用所得的rDNA載體轉(zhuǎn)化霉菌以生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)。作為一個實施例，將amds和pyrG選擇標(biāo)記導(dǎo)入表達(dá)載體，得到pUR7281(圖10)。為了達(dá)到該目的，用合成的寡核苷酸(5′-AATTGCGGCCGC-3′)通過將EcoRⅠ位點(存在于前-原-角質(zhì)酶基因ATG密碼子上游的1.2kb)變成NotⅠ位點，產(chǎn)生NotⅠ位點，得到pUR7282。給含有完整構(gòu)巢曲霉amds基因和黑色曲霉awamori變種pyrG基因以及它們各自的啟動子和終止子的適當(dāng)DNA片段提供位于側(cè)面的NotⅠ位點，并將其導(dǎo)入pUR7282的NotⅠ位點，得到pUR7281(圖10)。
作為在黑色曲霉awamori變種中表達(dá)合成的茄病鐮孢角質(zhì)酶基因的另一種方法，構(gòu)建表達(dá)載體，其中不是成熟角質(zhì)酶自己的前-原-序列而是黑色曲霉awamori變種exlA的前-序列，在編碼成熟角質(zhì)酶的合成基因之前。
為了制備上述融合體的合成角質(zhì)酶基因，合成幾個銜接子片段，其中，以不同的方式，將exlA前-序列的編碼序列與編碼成熟角質(zhì)酶N-末端的序列相連。在盒5中，這種連接是通過將exlA前-序列與角質(zhì)酶的前-序列融合而完成的。在盒6中，將exlA前-序列與成熟角質(zhì)酶的N-末端殘基融合。盒7與盒6相同，但為了更好地滿足裂解信號肽的需要，將被編碼的成熟角質(zhì)酶多肽的N-末端殘基從原來的甘氨酸變成絲氨酸?；景磳嵤├?中的描述從合成的寡核苷酸組合盒5、6和7(見圖7)。用盒5代替pUR7210的0.1kb EcoRⅠ-SpeⅠ片段，得到pUR7287。分別用盒6和7代替pUR7210的0.1kbEcoRⅠ-BclⅠ片段，得到pUR7288和pUR7289，分別將0.7kb BspHⅠ-AflⅡ片段與pAW14B的7.2kb BspHⅠ-AflⅡ片段連接，得到pUR7290，pUR7291，pUR7292。
隨后，用常規(guī)的共轉(zhuǎn)化技術(shù)，將構(gòu)建的rDNA載體轉(zhuǎn)移到霉菌(黑色曲霉，黑色曲霉awamori變種)中并通過誘導(dǎo)內(nèi)切木聚糖酶Ⅱ啟動子表達(dá)前-(原)-角質(zhì)酶基因。也可給構(gòu)建的rDNA載體提供常規(guī)的選擇標(biāo)記(如amds或pyrG，潮霉素)并可用所得的rDNA載體轉(zhuǎn)化霉菌以生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)，如在有關(guān)pUR7280(見上文)的實施例中說明的那樣。
使用表達(dá)載體pUR7280，pUR7281，pUR7290，pUR7291，pUR7292的任一個(含有在黑色曲霉awamori變種exlA啟動子和終止子控制下的帶有或不帶相應(yīng)的原-序列的茄病鐮孢成熟角質(zhì)酶編碼區(qū)及或者角質(zhì)酶信號序列或者exlA信號序列)轉(zhuǎn)化的曲霉菌株在下列條件下生長用孢子(終濃度10E6/ml)接種多個含400ml合成培養(yǎng)基(pH6.5)的1升搖瓶。該培養(yǎng)有下列組合物(AW培養(yǎng)基)
蔗糖 10g/lNaNO36.0g/lKCl 0.52g/lKH2PO41.52g/lMgSO4·7H2O 0.49g/l酵母提取物 1.0g/lZnSO4·7H2O 22mg/lH3BO311mg/lMnCl2·4H2O 5mg/lFeSO4·4H2O 5mg/lCaCl2·6H2O 1.7mg/lCuSO4·5H2O 1.6mg/lNaH2MoO4·2H2O 1.5mg/lNa2EDTA 50mg/l在MK X恒溫箱振蕩器中，于30℃，以200rpm溫育24小時。生長后，過濾(0.45μm濾器)收集細(xì)胞，用沒有蔗糖和酵母提取物的AW培養(yǎng)基(鹽溶液)洗滌兩次，再懸于50ml鹽溶液并轉(zhuǎn)移至含50ml鹽溶液的300ml搖瓶中，向該鹽溶液中加入木糖至10g/l的終濃度(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。按與上述相同的條件繼續(xù)培養(yǎng)過夜。通過miracloth過濾所得的培養(yǎng)物以除去生物質(zhì)并基本按實施例2中的描述回收角質(zhì)酶。
實施例7在曲霉菌中表達(dá)茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體。
基本上按照實施例6中描述的途徑，但現(xiàn)在用pUR7257(N172K)代替pUR7210構(gòu)建真菌表達(dá)載體，在黑色曲霉awamori變種中生產(chǎn)含有突變N172K的茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體。
實施例8鑒別并分離與茄病鐮孢角質(zhì)酶基因有關(guān)的基因從不同的真菌中分離編碼角質(zhì)酶的基因，所述角質(zhì)酶與茄病鐮孢角質(zhì)酶有不同程度的同源性。使真菌培養(yǎng)物在500ml搖瓶中生長，該搖瓶含Hankin和Kolattukudy(1968)描述的，用0.25%葡萄糖補(bǔ)充的培養(yǎng)基，并在MKX恒溫器振蕩器(100rpm)中于28℃培養(yǎng)4天。此時，葡萄糖已被消耗掉，并基本按Ettinger等人的描述(1987)，通過加入角質(zhì)素水解產(chǎn)物誘導(dǎo)角質(zhì)酶生產(chǎn)。從培養(yǎng)物中以有規(guī)律的間隔取出樣品，并按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析脂解活性的存在(見實施例4)。正常地，誘導(dǎo)后約兩天后，可以證明脂解活性，此時，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)過濾收集細(xì)胞。洗滌菌絲體，將其冷凍在液氮中，并按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)凍干?；景碨ambrook等人的描述(1989)用硫氰酸胍法分離總細(xì)胞RNA制品，并用氯化銫密度梯度離心純化。用PolyAT束mRNA分離盒(Promga)分離polyA(+)mRNA部分。按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用茄病鐮孢角質(zhì)酶基因的cDNA片段作探針，將polyA(+)mRNA部分用于Northern雜交分析以確定角質(zhì)酶-有關(guān)的基因的表達(dá)。按供應(yīng)商的說明用ZAP cDNA合成盒(Stratagene，La Jolla)對含有能與探針雜交的物質(zhì)的mRNA制品作cDNA分析，產(chǎn)生的cDNA片段帶有位于poly-A區(qū)側(cè)面的XhoⅠ粘性末端并在另一末端有一個EcoRⅠ接頭。通過在λZAPⅡ載體(Stratagene，La Jolla)中以意義方法直接克隆，用獲得的cDNA片段構(gòu)建表達(dá)文庫，使得表達(dá)β-半乳糖苷酶融合蛋白(Huse等人，1988)。用抗茄病鐮孢角質(zhì)酶抗血清篩選這些文庫。
另外，用角質(zhì)酶特異的引物(見表2)，使合成的cDNA部分經(jīng)PCR-篩選。這些引物得自數(shù)種真菌角質(zhì)酶基因(Ettinger等人，1987)的氨基酸序列的比較。選擇對每套引物最佳的PCR反應(yīng)條件，用茄病鐮孢角質(zhì)酶作對照。在相同的條件下，可以用與由茄病鐮孢角質(zhì)酶的cDNA產(chǎn)生的PCR片段長度相似的(或遠(yuǎn)大于之)的長度，生產(chǎn)具有特異PCR片段的cDNA的這些制品，用凝膠電泳純化PCR片段并從凝膠上分離。
作為另一種方法，也可將使用角質(zhì)酶特異性引物的PCR篩選技術(shù)直接用于一些真菌菌株的基因組DNA，用茄病鐮孢的基因組DNA作正對照。在相同條件下，可以用與由茄病鐮孢角質(zhì)酶的cDNA產(chǎn)生的PCR長度相似的(或遠(yuǎn)大于之的)長度，生產(chǎn)具有特異PCR片段的cDNA的這些制品，用凝膠電泳法純化PCR片段并從凝膠上分離。
對于在表達(dá)文庫法或PCR篩選法(用cDNA或基因組DNA)中標(biāo)為陽性的菌株以及大量其它菌株，分離高分子量的基因組DNA?；景碋ttinger等人的描述(1987)使菌株生長，并按Graaff等人的描述(1988)分離基因組DNA。用各種限制酶消化基因組DNA，用類似的cDNA插入片段(表達(dá)文庫法)或PCR片段(PCR篩選法)或茄病鐮孢角質(zhì)酶基因(其它菌株)作探針，用Southern雜交分析，并構(gòu)建角質(zhì)酶基因的物理圖譜。經(jīng)凝膠電泳將適當(dāng)消化的基因組DNA按大小分級分離，并從凝膠上分離適當(dāng)大小的片段，并亞克隆在pUC19中。用相應(yīng)的cDNA插入片段(表達(dá)文庫)或PCR片段(PCR篩選法)篩選這些基因組文庫，得到含有角質(zhì)酶基因的基因組拷貝的克隆。將這些基因以兩個方向定序。通過測定相應(yīng)的cDNA序列或與其它角質(zhì)酶序列(Ettinger等人，1987)比較，鑒別內(nèi)含子。也可從上述比較推測成熟角質(zhì)酶多肽的N-末端。用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)，除去內(nèi)含子，立即用遺傳工程方法將HindⅢ位點加到開放閱讀框架的下游，并將啤酒酵母蔗糖酶基因(SacⅠ位點在其之前，比較盒8，圖3)前序列的編碼序列與編碼成熟角質(zhì)酶N-末端的序列融合。將得到的含有(與編碼啤酒酵母蔗糖酶前-序列的序列可操作相連的)角質(zhì)酶基因的SacⅠ-HindⅢ片段與pUR7241的7.3kb SacⅠ-HindⅢ片段(見圖4)相連并轉(zhuǎn)化啤酒酵母菌株SU51。基本按實施例4中的描述，表達(dá)真菌角質(zhì)酶并從將其從培養(yǎng)液中回收。
實施例9茄病鐮孢角質(zhì)酶變異體N172K的洗滌用活性將角質(zhì)酶變異體N172K的除脂肪效果與野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶的作比較。在檢測中，用經(jīng)溴化了的橄欖油弄臟的聚酯檢測布作為檢驗物。用X射線熒光光譜測定法，通過測量檢測布上的溴量，確定檢測布上的脂肪量。
在以下幾種實驗條件下，以3LU/ml的劑量確定野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶(WT)和N172K變異體的酶促去除污垢量
洗滌劑產(chǎn)品A-C的組分(以%重量計)如下產(chǎn)品A
產(chǎn)品B
產(chǎn)品C
在各種洗滌條件下，有關(guān)野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶洗滌用性能(清除油污)的增強(qiáng)是明顯的。圖13表示用2g/l洗滌劑產(chǎn)品C在30℃，27°FH，洗滌30分鐘后，各種酶濃度的洗滌用性能。
為了比較，也用Lipolase(TM)完成相同的實驗。在所有情況下，角質(zhì)酶變異體N172K是最好的。
實施例12茄病鐮孢變異體E201K的洗滌用活性。
用2g/l洗滌劑產(chǎn)品C(見實施例11)在30℃，27°FH，洗滌30分鐘后，將各種酶濃度角質(zhì)酶變異體E201K的脂肪清除效果與野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶的效果作比較。在檢測中，用由溴化了的橄欖油弄臟的聚酯檢測布作檢驗物。用X射線熒光光譜測定法通過測量檢測布上的溴量，確定檢測布上的脂肪量(見上文描述)。
所得的結(jié)果列于圖14。有關(guān)野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶洗滌用性能(油污清除)的增強(qiáng)是明顯的。為了比較，用Lipolase(TM)完成相同的實驗。發(fā)現(xiàn)E201K角質(zhì)酶變異體的性能明顯地好。
實施例13茄病鐮孢變異體A85F的洗滌用活性。
用2g/l洗滌劑產(chǎn)品C(見實施例11)，在30℃，27°FH洗滌30分鐘后，將各種酶濃度角質(zhì)酶變異體A85F的脂肪清除效果與野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶的比較。在檢測中，用由溴化了的橄欖油弄臟的聚酯檢測衣服作檢測物。用X射線熒光光譜測定法，通過測量檢測布上的溴量，確定檢測布上的脂肪量(如上文所述)。
結(jié)果列于圖15。有關(guān)野生型茄病鐮孢角質(zhì)酶洗滌用性能(油污清除)的增強(qiáng)是明顯的。為了比較，同樣用Lipolase(TM)完成相同的實驗。發(fā)現(xiàn)A85F角質(zhì)酶變異體的性能明顯好。
權(quán)利要求
1.一種母本角質(zhì)酶的角質(zhì)酶變異體，其中氨基酸序列已經(jīng)以提高酶表面的疏水性方法進(jìn)行修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的角質(zhì)酶變異體，其中已提高了與脂接觸區(qū)相鄰的酶表面的疏水性以便形成擴(kuò)大的脂接觸區(qū)。
3.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，通過用選自纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸的氨基酸殘基取代一個或多個氨基酸殘基，提高了疏水性。
4.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，氨基酸序列已經(jīng)以除提高表面的疏水性外，還導(dǎo)入了一個或多個正電荷的方式進(jìn)行修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的角質(zhì)酶變異體，其中通過導(dǎo)入一個或多個賴氨酸或精氨酸殘基導(dǎo)入正電荷。
6.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，被取代的氨基酸殘基有短側(cè)鏈，且最好選自丙氨酸、絲氨酸或甘氨酸。
7.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，母本 角質(zhì)酶是真核的角質(zhì)酶。
8.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，母本酶是與抗茄病鐮孢角質(zhì)酶產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的角質(zhì)酶。
9.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，母本酶是來自茄病鐮孢的角質(zhì)酶。
10.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，由此，修飾的殘基位于由載體限定的分子部分，(所述載體至少包含茄病鐮孢角質(zhì)酶殘基116到120的全部Ca-原子，或者不同角質(zhì)酶的相應(yīng)Ca-原子)以及定位于與所述載體垂直平面并含有殘基117的Ca-原子，或者不同角質(zhì)酶相應(yīng)的Ca-原子。
11.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，被修飾的殘基位于與載體垂直的第一平面(所述載體至少包括離殘基117 Ca-原子15
距離的茄病鐮孢角質(zhì)酶殘基116到120Ca-原子)和與所述第一平面平行的第二平面之間的分子部分且含有殘基117的Ca-原子。
12.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，被修飾的殘基位于茄病鐮孢角質(zhì)酶氨基酸序列的一個或多個下列位置，或不同角質(zhì)酶的相應(yīng)位置17、18、19、40、42-46、50、53、54、58、74、75、76、78、80-88、91、92、93、95、96、97、99、100、119、150-156、158、160、168、169、170、172、173、174、176、179、180-190、192、193、194、196、197、198、201。
13.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，被修飾的殘基位于茄病鐮孢角質(zhì)酶氨基酸序列的一個或多個下列位置，或不同角質(zhì)酶中的相應(yīng)位置19、41、45、49、54、58、75、76、82、85、92、93、99、100、127、128、172、173、179、183、184、185、189、190、194、197、201。
14.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，在茄病鐮孢角質(zhì)酶的氨基酸序列中，或不同角質(zhì)酶中的相應(yīng)位置產(chǎn)生一個或多個下列修飾T19V、G41A、T45K、T45P、＊l49a、S54l、N58R、G75R、A76P、G82AD83S、A85F、A85V、S92R、A93V、L99K、G100R、A127L、A128F、N172K、T173I、T179F、I183F、V184I、A185L、L189F、A190L、D194R、G197V、E201K。
15.根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體，其中，在茄病鐮孢角質(zhì)酶的氨基酸序列中，或不同角質(zhì)酶中的相應(yīng)位置產(chǎn)生一個或多個下列修飾A85F，N172K，E201K。
16.一種生產(chǎn)根據(jù)前面任一權(quán)利要求的角質(zhì)酶變異體的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)rDNA改進(jìn)的微生物，該微生物含用rDNA技術(shù)加工的編碼角質(zhì)酶基因的變異體，通過從發(fā)酵液分離由所述微生物生產(chǎn)的角質(zhì)酶變異體，或通過從發(fā)酵液中分離所述微生物的細(xì)胞，破碎分離的細(xì)胞，用物理或化學(xué)濃縮或純化方法，濃縮或部分純化來自所述發(fā)酵液或所述細(xì)胞的角質(zhì)酶，從而完成角質(zhì)酶變異體的制備。
17.一種用rDNA載體轉(zhuǎn)化的并由此能表達(dá)所述角質(zhì)酶變異體的rDNA改進(jìn)的微生物，所述載體攜帶編碼根據(jù)權(quán)利要求1到15的任一角質(zhì)酶變異體的基因。
18.根據(jù)權(quán)利要求17一種攜帶編碼角質(zhì)酶變異體的基因的rDNA改進(jìn)的微生物，通過在所述基因的5′-末端與編碼具有作為宿主生物信號或分泌序列功能的(改進(jìn)的)前序列的基因片段融合，而將所述基因?qū)朐撐⑸铩?br> 19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的任一rDNA改進(jìn)的微生物，其中，宿主生物是真核生物，如酵母屬或克魯維氏酵母屬或漢遜氏酵母屬，或曲霉屬的真菌。
20.根據(jù)權(quán)利要求17到19的任一rDNA改進(jìn)的微生物，攜帶編碼權(quán)利要求1到15的角質(zhì)酶變異體的重組DNA載體，在所述微生物的一個前代細(xì)胞中，已通過編碼營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的基因進(jìn)行基因取代而將該微生物加工成營養(yǎng)缺陷型突變體。
21.一種具有編碼根據(jù)權(quán)利要求1-15任一成熟角質(zhì)酶變異體的堿基序列的多核苷酸或其功能等同物或突變體，其中，多核苷酸最好的被轉(zhuǎn)譯密碼子后接著終止密碼子，且可選擇地含有直接位于編碼該成熟酶的核苷酸序列上游的，編碼該角質(zhì)酶前-序列的核苷酸序列。
22.一種具有編碼根據(jù)權(quán)利要求1-15任一角質(zhì)酶變異體的堿基序列的多核苷酸，其中，多核苷酸最后的被轉(zhuǎn)譯密碼子后接著終止密碼子，且可選擇地含有直接位于編碼該成熟酶的核苷酸序列上游的，編碼至少部分相應(yīng)前序列的核苷酸序列，和/或適用于所選擇的宿主生物的信號-或分泌-序列。
23.一種具有編碼根據(jù)權(quán)利要求1-15任一成熟角質(zhì)酶變異體的堿基序列的多核苷酸，或其功能等同物或突變體，其中，已經(jīng)修飾了得自源生物的角質(zhì)酶-變異體編碼核苷酸序列，以便至少一個密碼子，且最好是盡可能多的密碼子被加工成“無癥狀”突變的主體，從而形成編碼等同氨基酸殘基的密碼子并且是權(quán)利要求17到20中特定的新宿主優(yōu)選的密碼子，由此，在使用時在上述宿主細(xì)胞內(nèi)提供用于改進(jìn)穩(wěn)定性的導(dǎo)入基因的信使RNA。
24.權(quán)利要求21到23任一多核苷酸，其中，在編碼原-或成熟角質(zhì)酶變異體的核苷酸序列上游，有一個編碼適用于權(quán)利要求17到20中限定的任一宿主的信號或分泌序列的核苷酸序。
25.一種能直接表達(dá)編碼角質(zhì)酶變異體基因的核苷酸序列的重組DNA載體，含有下有成分(a)編碼成熟角質(zhì)酶變異體或前角質(zhì)酶或相應(yīng)的前角質(zhì)酶的雙鏈(ds)DNA，其中已將至少部分前序列直接從分泌信號(對于所選的宿主細(xì)胞是優(yōu)選的)的下游除去，提供應(yīng)被轉(zhuǎn)譯的部分基因不從密碼子ATG開始，一個ATG應(yīng)被放在前面，且被轉(zhuǎn)譯的部分基因用一個適當(dāng)?shù)慕K止密碼子終止或加入上述密碼子;(b)位于編碼角質(zhì)酶變異體的dsDNA(成分a)的正鏈上游的表達(dá)調(diào)節(jié)子(適用于所選的宿主生物)，(c)位于編碼角質(zhì)酶變異體的dsDNA(組分a)正鏈下游的終止子序列(適用于所選的宿主生物);(d1)適用于所選宿主的復(fù)制原點;(e1)選擇性地含有一個(營養(yǎng)缺陷型)選擇標(biāo)記;(e2)選擇性含有一個編碼蛋白質(zhì)的dsDNA序列。所述蛋白質(zhì)涉及所選宿主中角質(zhì)酶前體形式之一的成熟和/或分泌。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的重組DNA載體，也攜帶在較早限定的核苷酸的上游和/或下游，促進(jìn)角質(zhì)酶功能表達(dá)的其它序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求25-26的任一重組DNA載體，攜帶由營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的編碼區(qū)和缺陷啟動子區(qū)組成的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。
28.一種酶洗滌劑組合物含有權(quán)利要求1-15的任一角質(zhì)酶變異體。
全文摘要
提供具有改善的脂解活性的真核角質(zhì)酶變異體，其中修飾氨基酸序列以便提高酶表面的疏水性。特別是提供茄病鐮孢的變異體。
文檔編號C12R1/78GK1090328SQ9311991
公開日1994年8月3日 申請日期1993年12月18日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月18日
發(fā)明者M·R·艾格蒙德, H·T·W·M·范德希登, W·穆斯特斯, H·彼得斯, C·T·韋里斯, J·迪弗力格 申請人:尤尼利弗公司