專利名稱：利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)鳥苷的方法。
背景技術(shù)：
鳥苷又稱鳥嘌呤核苷，化學(xué)名稱為9_β-D-呋喃核糖基鳥嘌呤，英文名稱為 Guanosine,分子式CltlH13N5O5，分子量觀3. 24，鳥苷為白色結(jié)晶粉末、無(wú)嗅、無(wú)味；水溶液的紫外吸收高峰在256 μ m，克分子消光系數(shù)12. 2 X IO3 ； 18°C下1320ml水中溶解1克；沸水浴中，33ml水中溶解1克；可溶于酸堿，不溶于有機(jī)溶劑；熔點(diǎn)237-M0°C。鳥苷屬于核苷類小分子化合物，在工業(yè)上主要用于抗病毒、抗腫瘤藥物合成的關(guān)鍵中間體，以及用于大規(guī)模合成食品添加劑5’ -鳥苷酸(GMP)的原料。5’ -鳥苷酸是強(qiáng)烈呈味劑，其鮮味是味精(谷氨酸鈉)的160倍。少量的GMP與味精混合可以提高味精鮮味10倍以上。目前GMP已被各類食品廠家作為提升產(chǎn)品品質(zhì)和增進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味的首選添加劑，是特鮮醬油、雞精、雞粉、特鮮味精、品質(zhì)改良劑、風(fēng)味劑等高級(jí)調(diào)味品的主要呈味成分之一。5’ -鳥苷酸的另一大用途是作為健康食品和嬰兒配方乳粉的保健型添加劑。老年人和病人核酸制造能力下降，在膳食中適當(dāng)添加核苷酸，可以減緩衰老，增強(qiáng)體質(zhì)。目前市場(chǎng)上銷售的國(guó)產(chǎn)奶粉和進(jìn)口奶粉，幾乎都添加了一定量的各種核苷酸(GMP是其中的一個(gè)重要組分)，主要是針對(duì)早產(chǎn)嬰兒和低出生體重嬰兒從頭合成和補(bǔ)救合成核苷酸的不足，促進(jìn)嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育。1991年歐共體規(guī)定每420KJ嬰幼兒食品中核苷酸的添加上限為 CMP2. 5mg、UMP1. 75mg、AMP1. 5mg、GMPO. 5mg、IMP1. Omg。2005 年中國(guó)衛(wèi)生部 15 號(hào)公布推薦的嬰幼兒奶粉中的核苷酸總添加量為0. 2 0. 58g/kg。此外鳥苷本身也可用于生產(chǎn)抗寒食品、減肥食品等功能性食品，因此鳥苷在食品和保健品領(lǐng)域的需求量非常大。利用鳥苷可以合成利巴韋林(三氮唑核苷)和阿昔洛韋(無(wú)環(huán)鳥苷)等抗病毒藥物。三氮唑核苷對(duì)DNA病毒和RNA病毒有明顯的抑制作用，是一種廣譜核苷類抗病毒藥物。 無(wú)環(huán)鳥苷也是一種廣譜抗病毒藥物，對(duì)于體外和體內(nèi)的皰疹病毒包括單純皰疹病毒HSV-I 和HSV-2、水痘-帶狀皰疹病毒(VIV)、EB病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)等有抑制作用。因此鳥苷在醫(yī)藥領(lǐng)域作為藥物合成中間體具有廣闊的發(fā)展前途。發(fā)酵法生產(chǎn)鳥苷具有產(chǎn)量大、周期短、控制容易等優(yōu)點(diǎn)，因而被國(guó)內(nèi)外廣泛采用。 20世紀(jì)60年代日本首先采用枯草芽孢桿菌的核酸代謝突變株大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷。我國(guó)對(duì)鳥苷的發(fā)酵研究始于20世紀(jì)80年代，研究報(bào)道很多，但是一直進(jìn)展不大，與國(guó)外先進(jìn)水平相比仍有較大差距，使得鳥苷生產(chǎn)成本較高，已經(jīng)成為限制國(guó)內(nèi)呈味核苷酸工業(yè)與核苷酸類藥物發(fā)展的重要瓶頸。原因之一是國(guó)內(nèi)鳥苷菌種選育仍舊采用常規(guī)的物理化學(xué)誘變方法，使得菌種的原始產(chǎn)苷能力不高。而國(guó)外已在分子生物學(xué)平臺(tái)上，采用基因工程技術(shù)選育鳥苷高產(chǎn)菌株。 例如CN1046558A報(bào)道，日本武田藥品工業(yè)株式會(huì)社將芽孢桿菌屬微生物染色體DNA的IMP脫氫酶基因的啟動(dòng)子用一個(gè)不同的可表達(dá)啟動(dòng)子取代，使該酶的基因表達(dá)得到增強(qiáng)，得到的枯草芽孢桿菌NA6242菌株能搖瓶發(fā)酵積累鳥苷0克/升。又例如CN101563448A報(bào)道，日本味之素株式會(huì)社將嘌呤結(jié)構(gòu)類似物抗性基因yeaS引入產(chǎn)嘌呤核苷的解淀粉芽孢桿菌屬細(xì)胞內(nèi)，使修飾后的解淀粉芽孢桿菌AJ1991(pLF-YeaS)菌株的嘌呤核苷生物合成酶基因得到增強(qiáng)表達(dá)，提高了肌苷和鳥苷生產(chǎn)能力。原因之二是國(guó)內(nèi)鳥苷發(fā)酵生產(chǎn)工藝水平落后，僅僅局限于培養(yǎng)基配方調(diào)整和補(bǔ)料分批發(fā)酵等以最佳工藝控制點(diǎn)為依據(jù)的靜態(tài)操作法，忽略了發(fā)酵過程中細(xì)胞代謝流的時(shí)變性和代謝調(diào)控變化對(duì)發(fā)酵影響的重要性，使得發(fā)酵罐上的產(chǎn)苷水平不高，轉(zhuǎn)化率低。國(guó)內(nèi)僅有CN101487036A報(bào)道，采用保藏菌株枯草芽孢桿菌TA208-IMPD，在發(fā)酵過程中流加碎米水解糖液，發(fā)酵50-60小時(shí)，產(chǎn)苷達(dá)38克/升，但轉(zhuǎn)化率只有20%。另有CN101492484A介紹了一種鳥嘌呤核苷的綜合循環(huán)生產(chǎn)工藝，采用微濾膜、超濾膜和反滲透膜提取鳥苷結(jié)晶，將濕菌體作為飼料蛋白使用，將提取鳥苷后的母液作為溶晶水和透析水循環(huán)使用。目前國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道采用生物化工過程的多尺度理論和方法研究鳥苷的發(fā)酵工藝，通過發(fā)酵培養(yǎng)基中加入代謝調(diào)控劑，結(jié)合發(fā)酵參數(shù)的調(diào)整，抑制氨基酸、有機(jī)酸、銨離子的積累，阻止發(fā)酵后期鳥苷代謝流的遷移，讓更多的碳源流向產(chǎn)鳥苷途徑，提高鳥苷的發(fā)酵產(chǎn)率，但至今未見有關(guān)此方法的專利報(bào)道。隨著人們對(duì)高檔次食品調(diào)味劑的要求越來(lái)越高，由此對(duì)呈味核苷酸(I+G)等新型食品增鮮劑的市場(chǎng)需求量增加；此外，由鳥苷合成各種藥物及前體物、功能性食品的市場(chǎng)前景也相當(dāng)樂觀。因此迫切需要提升我國(guó)鳥苷的整體發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)水平，增強(qiáng)我國(guó)鳥苷的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，滿足社會(huì)日益增長(zhǎng)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高鳥苷的發(fā)酵產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率的利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷的方法，其特征是依次包括下列步驟⑴菌體活化將枯草芽孢桿菌CGMCC No. 4587(分類命名枯草芽孢桿菌，拉丁文學(xué)名 Bacillus subtilis，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年1月27日)劃線接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂試管斜面，然后劃線轉(zhuǎn)接于瓊脂茄子瓶斜面培養(yǎng)成熟，準(zhǔn)備移種；(2)種子培養(yǎng)將茄子瓶斜面上的成熟菌泥制備均勻的菌懸液，將菌懸液按1-10%的接種量接入種子罐進(jìn)行種子培養(yǎng)；或直接挑取一環(huán)活化后的試管斜面菌體，接種于三角瓶，搖瓶培養(yǎng)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)液接入三角瓶，搖瓶培養(yǎng)；或接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)；(4)鳥苷提取鳥苷發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、冷凍結(jié)晶得到鳥苷粗品。
鳥苷粗品經(jīng)精制得到鳥苷精品。步驟(1)中營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂試管斜面培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基和瓊脂茄子瓶斜面培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基均為葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂20g/L，pH 7. 0-7. 2，培養(yǎng)溫度均勻32°C，培養(yǎng)時(shí)間均為M-48小時(shí)。步驟(2)種子培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基為葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L ；氯化鈉2g/L、RNAO. 25g/L，pH 7. 0-7. 2 ；搖瓶培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)條件為往復(fù)式搖床、振幅7cm，頻率108轉(zhuǎn)/分、34°C、10-18小時(shí)；種子罐培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)條件為種子罐攪拌轉(zhuǎn)速 150-180轉(zhuǎn)/分、通氣量l-2m3/小時(shí)、溫度34°C、10-15小時(shí)。步驟C3)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基組成為葡萄糖100g/L、酵母膏4g/L、玉米漿4g/L、 K2HPO4 2g/L、MgSO4 0. 5g/L, MnCl2 0. 01g/L、FeSO4 0. 01g/L、KCl 2g/L、CaCO3 20g/L、NH4Cl 20g/L, pH7. 0-7. 2 ；搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為往復(fù)式搖床、振幅7cm，頻率108轉(zhuǎn)/分、36°C、 72小時(shí)；發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速100-150轉(zhuǎn)/分、通氣量l-2m3/小時(shí)、 36°C、60-72小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)加入生長(zhǎng)因子原料-RNA，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)RNA的添加量為一次性添加相當(dāng)于培養(yǎng)液總重量的0. 3%，發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)RNA的添加總量為相當(dāng)于培養(yǎng)液總重量的0. 3 %，發(fā)酵0小時(shí)添加0. 03 %，其余0. 27 %在設(shè)定K值后，按F (t) = F (0) X e(kt) 計(jì)算出每小時(shí)添加的量進(jìn)行添加，其中的第一次添加時(shí)間控制在整個(gè)發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng) OD660為最高數(shù)的1/5時(shí)添加，以后每小時(shí)添加一次，直至添加完畢；發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中加入起消泡作用的豆油或泡敵。枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis JSIM-G518是一株嘌呤核苷酸代謝突變株，對(duì)腺嘌呤等嘌呤核苷酸有特殊的營(yíng)養(yǎng)要求，必須在不明顯抑制菌體生長(zhǎng)的范圍內(nèi)，盡量降低發(fā)酵培養(yǎng)基中腺嘌呤的濃度。通過限制腺嘌呤的添加量，使細(xì)胞內(nèi)的主要控制因子腺嘌呤類核苷酸的濃度保持在不能引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，從而有利于鳥苷的積累。這個(gè)濃度是隨著培養(yǎng)時(shí)間而變化，細(xì)胞繁殖增多，添加物的濃度隨著變大。核酸RNA是細(xì)胞最易吸收利用的生長(zhǎng)因子原料。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明采用了一株枯草芽孢桿菌的嘌呤核苷酸代謝突變株Bacillus subtilis JSIM-G518進(jìn)行鳥苷的發(fā)酵生產(chǎn)。該菌株的遺傳性狀穩(wěn)定，關(guān)于鳥苷生物合成途徑的關(guān)鍵酶已被阻斷和加強(qiáng)，發(fā)酵產(chǎn)物單一，不積累其他核苷酸類物質(zhì)。本發(fā)明依據(jù)核酸生物合成途徑的代謝調(diào)控理論，針對(duì)Bacillussubtilis JSIM-G518的特殊營(yíng)養(yǎng)需求，在種子培養(yǎng)階段加入核酸RNA作為細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑，提高了種子培養(yǎng)的生物量，有利于后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)的產(chǎn)物積累。本發(fā)明依據(jù)代謝工程理論，在發(fā)酵培養(yǎng)階段以積累產(chǎn)物為主要目的，采用指數(shù)函數(shù)模型F(t) =F(O)exp (kt) (k興0)，{F(t) =F(0)Xe(kt)}進(jìn)行關(guān)鍵生長(zhǎng)因子核酸RNA的精細(xì)補(bǔ)料，這種補(bǔ)料方式是時(shí)變性的，在細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累之間維持著動(dòng)態(tài)平衡，從而最大限度地解除了鳥苷生物合成的代謝調(diào)控作用，顯著提高了鳥苷發(fā)酵產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。鳥苷發(fā)酵液中含有大量菌體和蛋白等物質(zhì)，會(huì)妨礙鳥苷的提取，影響鳥苷的純度、 色澤、結(jié)晶速度，降低提取收率。離心沉降法設(shè)備昂貴，且能耗很大；膜過濾是近年來(lái)發(fā)展很快的一項(xiàng)分離技術(shù)，菌體和蛋白去除率高，但是目前超濾膜和反滲透膜因?yàn)椴牧习嘿F、再生困難、過濾速率慢、易發(fā)生堵塞，而無(wú)法大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。陶瓷膜孔徑大于超濾膜和反滲
5透膜，操作簡(jiǎn)單，使用成本低廉、易于推廣。本發(fā)明將板框過濾除菌體、絮凝沉降除蛋白、陶瓷膜過濾除雜、減壓濃縮與冷凍結(jié)晶等分離提取技術(shù)結(jié)合起來(lái)，并通過工序的合理組合設(shè)計(jì)，從發(fā)酵液中高收率地提取出鳥苷精品。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明?？莶菅挎邨U菌CGMCC No. 4587 (分類命名枯草芽孢桿菌，拉丁文學(xué)名=Bacillus subtilis，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年1月27日)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 (1)菌體活化將枯草芽孢桿菌CGMCC No. 4587劃線接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂試管斜面，然后劃線轉(zhuǎn)接于瓊脂茄子瓶斜面培養(yǎng)成熟，準(zhǔn)備移種；營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂試管斜面培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基和瓊脂茄子瓶斜面培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基均為葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂20g/L, pH 7. 0-7. 2，培養(yǎng)溫度均勻32°C，培養(yǎng)時(shí)間均為24-48小時(shí)。(2)種子培養(yǎng)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis JSIM-G518的斜面冷藏菌種，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂試管斜面，斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂20g/L, pH 7.2, 32°C培養(yǎng)48小時(shí)，即為成熟。在無(wú)菌室的操凈臺(tái)上，挑取一環(huán)活化后的試管斜面菌體，接種于滅好菌的種子培養(yǎng)基內(nèi)(500ml三角瓶，裝液量30ml)。種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L、氯化鈉2g/L、RNAO. 25g/L, pH 7. 2，121°C、1公斤壓力、滅菌15分鐘。種子培養(yǎng)條件為往復(fù)式搖床、振幅7cm，頻率108轉(zhuǎn)/分、34°C、10小時(shí)。當(dāng)生長(zhǎng) OD66tl達(dá)到0.7時(shí)，即移種。(3)發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)液以體積比10% (或1%、5% )的接種量接入滅好菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中 (500ml三角瓶，裝液量20ml)。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖100g/L、酵母膏4g/L、玉米漿 4g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4 0. 5g/L、MnCl2 0. 01g/L、FeSO4 0. 01g/L、KCl 2g/L、CaCO3 20g/ L、NH4Cl 20g/L, pH 7. 2，121 °C、1公斤壓力、滅菌10分鐘；發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)加入生長(zhǎng)因子原料-RNA，RNA的添加量為一次性添加相當(dāng)于培養(yǎng)液總重量的0. 3%。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件為往復(fù)式搖床、振幅7cm，頻率108轉(zhuǎn)/分、36°C、72小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后，電泳法測(cè)定培養(yǎng)液中的鳥苷產(chǎn)量達(dá)20. 10g/L，轉(zhuǎn)化率20. 10%。實(shí)施例2 步驟(1)同實(shí)施例1。步驟⑵種子培養(yǎng)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis JSIM-G518的斜面冷藏菌種，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂試管斜面，斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂20g/L，pH 7.2，32°C培養(yǎng)48小時(shí)。然后劃線轉(zhuǎn)接于瓊脂茄子瓶斜面(培養(yǎng)基組成與試管斜面相同)，32°C培養(yǎng)48小時(shí)，即為成熟。準(zhǔn)備一個(gè)內(nèi)裝玻璃珠的無(wú)菌三角瓶，用無(wú)菌水將茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下來(lái)，裝入三角瓶，振蕩分散菌泥，獲得均勻的菌懸液；將菌懸液按10%的接種量接入100升種子罐，種子罐的裝量系數(shù)為70% (V/V)。種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、 蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L ；氯化鈉2g/L、RNA0. 25g/L，pH 7. 2，121°C、1公斤壓力、滅菌15分鐘。種子罐培養(yǎng)條件為攪拌轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分、通氣量ail3/小時(shí)、溫度34°C、15小時(shí)。 當(dāng)生長(zhǎng)OD66tl達(dá)到0.7時(shí)，即移種。(3)發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)液以體積比10%的接種量接入100立升發(fā)酵罐，發(fā)酵罐的裝量系數(shù)為 70% (V/V) ο發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為攪拌轉(zhuǎn)速100 150轉(zhuǎn)/分、通氣量1 2m3/小時(shí)、36°C、65 小時(shí)。發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中加入發(fā)酵液體積0.001 %的泡敵(V/V)。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖 100g/L、酵母膏 4g/L、玉米漿 4g/L、K2HPO4 2g/L、MgS04 0. 5g/L, MnCl2 0. 01g/L, FeSO4 0. 01g/L、KCl 2g/L、CaCO3 20g/L、NH4Cl 20g/L, pH 7. 2，121°C、1 公斤壓力、滅菌 10 分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)過程中RNA的添加總量為相當(dāng)于培養(yǎng)液總重量的0. 3%，發(fā)酵0小時(shí)添加 0. 03%,其余0. 27%在設(shè)定K值=0. 12后，按F(t) = F(O) Xe(kt)計(jì)算出每小時(shí)添加的量， 并列于下表1中。第一次添加時(shí)間為發(fā)酵8小時(shí)后添加，以后每小時(shí)按表1規(guī)定的量添加一次，直至添加完畢。表IK = 0. 12時(shí)的核酸RNA補(bǔ)料時(shí)間表
權(quán)利要求
1.一種利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷的方法，其特征是依次包括下列步驟(1)菌體活化將枯草芽孢桿菌CGMCC No. 4587劃線接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂試管斜面，然后劃線轉(zhuǎn)接于瓊脂茄子瓶斜面培養(yǎng)成熟，準(zhǔn)備移種；(2)種子培養(yǎng)將茄子瓶斜面上的成熟菌泥制備均勻的菌懸液，將菌懸液按1-10%的接種量接入種子罐進(jìn)行種子培養(yǎng)；或直接挑取一環(huán)活化后的試管斜面菌體，接種于三角瓶，搖瓶培養(yǎng)；(3)發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)液接入三角瓶，搖瓶培養(yǎng)；或接入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)；(4)鳥苷提取鳥苷發(fā)酵液經(jīng)過濾、濃縮、冷凍結(jié)晶得到鳥苷粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷的方法，其特征是鳥苷粗品經(jīng)精制得到鳥苷精品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷的方法，其特征是步驟(1) 中營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂試管斜面培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基和瓊脂茄子瓶斜面培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基均為葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂20g/L, pH 7. 0-7. 2，培養(yǎng)溫度均勻 32°C，培養(yǎng)時(shí)間均為M-48小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷的方法，其特征是步驟(2) 種子培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)基為葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5g/L、牛肉膏5g/L ；氯化鈉2g/ L、RNAO. 25g/L，pH 7. 0-7. 2 ；搖瓶培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)條件為往復(fù)式搖床、振幅7cm，頻率108轉(zhuǎn)/ 分、34°C、10-18小時(shí)；種子罐培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)條件為種子罐攪拌轉(zhuǎn)速150-180轉(zhuǎn)/分、通氣量l-2m3/小時(shí)、溫度34°C、10-15小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷的方法，其特征是步驟(3) 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基組成為葡萄糖100g/L、酵母膏4 g/L、玉米漿4 g/L、K2HPO4 2 g/L、 MgSO4 0.5 g/L、MnCl2 0. 01 g/L、FeSO4 0. 01 g/L、KCl 2 g/L、CaCO3 20 g/L、NH4Cl 20 g/ L，pH7.0- 7. 2 ；搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為往復(fù)式搖床、振幅7cm，頻率108轉(zhuǎn)/分、36°C、72小時(shí)；發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速100-150轉(zhuǎn)/分、通氣量l-2m3/小時(shí)、36°C、 60-72小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)加入生長(zhǎng)因子原料-RNA，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)RNA的添加量為一次性添加相當(dāng)于培養(yǎng)液總重量的0. 3%，發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)RNA的添加總量為相當(dāng)于培養(yǎng)液總重量的 0. 3%，發(fā)酵0小時(shí)添加0. 03%，其余0. 27%在設(shè)定K值后，按F (t) =F(O) Xe(kt)計(jì)算出每小時(shí)添加的量進(jìn)行添加，其中的第一次添加時(shí)間控制在整個(gè)發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)OD66tl為最高數(shù)的1/5時(shí)添加，以后每小時(shí)添加一次，直至添加完畢；發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中加入起消泡作用的豆油或泡敵。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鳥苷的方法，依次包括菌體活化、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、鳥苷提取精制等步驟。菌種采用枯草芽孢桿菌CGMCCNo.4587。本發(fā)明提高鳥苷的發(fā)酵產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。
文檔編號(hào)C12P19/40GK102250989SQ201110171900
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者何寅琛, 匡群, 華洵璐, 葉進(jìn), 孫梅, 張一平, 諸建國(guó), 鄭惠華 申請(qǐng)人:江蘇安惠生物科技有限公司, 江蘇省蘇微微生物研究有限公司