一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法。以小麥麩皮、豆粕粉和玉米粉為主要原料制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。將配制好的培養(yǎng)基加水濕潤在28℃～30℃靜置培養(yǎng)7～8h，然后室溫下與二氧化氯消毒劑混合進(jìn)行殺菌。二氧化氯殺菌后的培養(yǎng)基接種解淀粉芽孢桿菌種子液進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，將固態(tài)發(fā)酵醪進(jìn)行熱風(fēng)干燥、粉碎，即獲得解淀粉芽孢桿菌菌劑，其芽孢數(shù)達(dá)到200～220億個/g，芽孢率達(dá)到97％～99％。本發(fā)明采用二氧化氯殺菌來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高溫蒸汽殺菌，時間短，效率高，大大降低多解淀粉芽孢桿菌菌劑的生產(chǎn)成本，減少了環(huán)境污染。
【專利說明】
一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上經(jīng)常會有農(nóng)作物病害發(fā)生，給人們造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。為了防治農(nóng)作物病害，通常使用化學(xué)農(nóng)藥?；瘜W(xué)農(nóng)藥具有成本低、見效快、省時省力等優(yōu)點，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥，不但對環(huán)境造成極大的污染，而且使得農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，甚至造成農(nóng)殘等有毒有害物質(zhì)超標(biāo)。生物農(nóng)藥是指利用生物活體或其代謝產(chǎn)物針對農(nóng)業(yè)有害生物進(jìn)行殺滅或抑制的制劑，具有安全、高效、無污染等特點。隨著人們和政府環(huán)保意識和保健意識的增強(qiáng)，研究開發(fā)生物農(nóng)藥來代替化學(xué)農(nóng)藥成為社會發(fā)展的必然趨勢。
[0003]微生物農(nóng)藥是生物農(nóng)藥中應(yīng)用最為廣泛的一類。微生物源農(nóng)藥的主要成分是微生物活體及其次生代謝產(chǎn)物如抗生素等。用作農(nóng)藥的生物類群主要有細(xì)菌、真菌和病毒等。微生物農(nóng)藥具有殺蟲、殺菌、除草以及植物生長調(diào)節(jié)作用。自然界中用于生防細(xì)菌的，主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬。微生物農(nóng)藥被認(rèn)為是無公害農(nóng)藥，防治對象不易產(chǎn)生抗藥性，不傷害天敵，繁殖快，能利用農(nóng)副產(chǎn)品甚至是工農(nóng)業(yè)廢水、廢棄物等進(jìn)行生產(chǎn)。
[0004]解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)屬于芽抱桿菌屬(Bacillus)的革蘭氏陽性細(xì)菌，是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細(xì)菌。該菌在自然界分布廣泛，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，生長速度快，能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，具有廣譜的抑制細(xì)菌和真菌活性，對植物的根腐病、枯萎病、黑痘病綠霉病等都有很好防治作用。解淀粉芽孢桿菌已被用于生產(chǎn)微生物農(nóng)藥、農(nóng)用微生物菌劑和生物有機(jī)肥。
[0005]目前解淀粉芽孢桿菌采用液體深層發(fā)酵技術(shù)，再經(jīng)噴霧干燥進(jìn)行生產(chǎn)，對設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜。相比液體深層發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵具有以下優(yōu)點:培養(yǎng)基原料來源廣泛且價格低;使用的設(shè)備相對簡單，能耗低，生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于液體深層發(fā)酵;發(fā)酵過程不排放廢水，環(huán)境污染較少。更重要的是，采用固態(tài)發(fā)酵可將菌體所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)完全保存下來，而采用液體深層發(fā)酵易使這些抗菌物質(zhì)隨廢水而排出。
[0006]二氧化氯消毒劑是一種強(qiáng)氧化劑，具有高效廣譜殺菌或抑菌作用，而且安全不污染環(huán)境，是被世界衛(wèi)生組織列為Al級的高效消毒劑。二氧化氯對細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等均具有良好的殺滅或抑制的作用，而且易降解、無殘留，在國內(nèi)外已經(jīng)廣泛應(yīng)用于飲用水處理、食品保鮮防腐、廢水處理、室內(nèi)環(huán)境消毒等領(lǐng)域。雖然二氧化氯還對各種桿菌的芽孢、霉菌的孢子具有較強(qiáng)的抑制作用，但不能完全殺死芽孢和孢子。
[0007]解淀粉芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法較少。例如，中國專利(公開號:CN104830711A)中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(45%醬油豆柏、15%米糠、0.12%硫酸鎂、0.12%硫酸錳)115?128°C高溫滅菌20?35min，冷卻后接種解淀粉芽孢桿菌種子液，37-42°C圓盤培養(yǎng)24-36h。中國專利(公開號:CN 104962492A)中以花生餅粉、麥麩、棉柏為主要原料組成述固態(tài)培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基120?125 °C滅菌兩次，每次滅菌30?45min。將解淀粉芽孢桿種子液與固體培養(yǎng)基的混合物在30 V條件下靜置培養(yǎng)5d。
[0008]以上專利技術(shù)方法存在的不足之處為:
[0009]①高溫殺菌需要消耗大量的熱能。這些熱能無論是由煤炭燃燒提供，還是由電能提供，均會大大增加生產(chǎn)成本，直接或間接造成環(huán)境污染。
[0010]②固態(tài)培養(yǎng)基的高溫滅菌及冷卻耗時長，生產(chǎn)效率較低。
[0011 ]③高溫滅菌會造成固態(tài)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的破壞，不利用菌體生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種低成本的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌方法。解淀粉芽孢桿菌的固態(tài)發(fā)酵過程中，使用二氧化氯消毒劑來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高溫殺菌來殺滅培養(yǎng)基中的細(xì)菌、酵母、霉菌等雜菌，從而大大降低了生產(chǎn)成本。所生產(chǎn)的解淀粉芽孢桿菌菌劑，其芽孢數(shù)達(dá)到200?220億個/g，芽孢率達(dá)到97?99 %。
[0013]發(fā)明所使用的菌株是一株高效拮抗多種植物病原菌、促進(jìn)植物生長的解淀粉芽孢桿菌((Bacillus amyloliquefaciens)B3。
[0014]本發(fā)明的原理:二氧化氯消毒劑可以殺死細(xì)菌、酵母、霉菌等微生物的細(xì)胞或菌絲，但不能殺死細(xì)菌的芽孢和霉菌的孢子。將固態(tài)培養(yǎng)基加入少量水制成豆腐渣狀的含水培養(yǎng)基，在28?30 V下培養(yǎng)一段時間，其目的是讓培養(yǎng)基中的細(xì)菌芽孢和霉菌孢子萌發(fā);然后用二氧化氯消毒劑對該培養(yǎng)基進(jìn)行消毒，殺死其中的細(xì)菌、酵母、霉菌等微生物，達(dá)到培養(yǎng)基基本無菌。在消毒后固態(tài)培養(yǎng)基中，接種解淀粉芽孢桿菌種子液進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。解淀粉芽孢桿菌本身能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)如抗菌肽、抗菌蛋白等，有較強(qiáng)的抗菌能力，而且生長速度快，因此，即便消毒后固態(tài)培養(yǎng)基中殘留有雜菌，這些雜菌也不能生長，從而保障整個發(fā)酵過程的順利進(jìn)行。發(fā)酵結(jié)束后，將固態(tài)發(fā)酵醪進(jìn)行熱風(fēng)干燥、粉碎，即獲得解淀粉芽孢桿菌菌劑。
[0015]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn):
[0016]—種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法，包括以下步驟:
[0017]a、種子培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入20?30g葡萄糖、10?20g蛋白胨、5?1g酵母粉、2?2.5硫酸錢、5.0?5.5g氯化鈉、4.0?4.5g磷酸二氫鉀、1.8?2.0g碳酸I丐，按照所述配比，將各種成分稱重后加入三角瓶中，室溫下攪拌均勻，制得種子培養(yǎng)基；用8層紗布密封后放入高壓滅菌鍋中，115°C?121°C滅菌15?20min，滅菌后把三角瓶冷卻至室溫；
[0018]b、種子液的制備:挑取斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌B3菌種2?3環(huán)，接種到步驟a中所述的種子培養(yǎng)基中，30°C、180?200rpm搖床振蕩培養(yǎng)12?14h;
[0019]c、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)處理:10g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由70?80g小麥麩皮、15?20g豆柏粉、5?1g玉米粉組成；按照上述重量配比，將小麥麩皮、豆柏粉、玉米粉混合均勻，SP為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；向100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入200?250mL自來水，混合均勻，使其呈濕潤狀態(tài)，放置于培養(yǎng)箱中28 0C?30 °(:靜置培養(yǎng)7?8h ；
[0020]d、二氧化氯消毒液的配制:將2?3片二氧化氯消毒泡騰片(lg/片，二氧化氯含量12% )加入到IL水中，待泡騰片完全溶解，并用0.2M鹽酸調(diào)整其pH值為6.0?6.2，即制成濃度為240?360mg/L 二氧化氯消毒液；
[0021]e、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的殺菌:向步驟c所述的100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入4?5g磷酸二氫鉀、氯化鉀2.5?3g、氯化鈉5.0?6g，混勻后轉(zhuǎn)移到帶有機(jī)械攪拌槳的臥式不銹鋼固態(tài)發(fā)酵罐中，再加入350?400mL步驟d所述的二氧化氯消毒液，室溫下攪拌均勻，靜置殺菌15?20min;
[0022]f、固態(tài)發(fā)酵:開動機(jī)械攪拌槳攪拌步驟e的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基8?lOmin，其目的是將培養(yǎng)基中殘存的二氧化氯釋放出來，以免在后續(xù)的培養(yǎng)中損傷解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞，然后，將步驟b所述解淀粉芽孢桿菌B3以4%?5%接種量接種到攪拌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度30?34 °C，每8h攪拌一次，每次攪拌8?1min，發(fā)酵96?10h，得固態(tài)發(fā)酵醪。
[0023]g、干燥:采用60 °C?70 °C熱風(fēng)將步驟f所述的固態(tài)發(fā)酵醪干燥含水量30 %以下。
[0024]h、粉碎:使用錘式粉碎機(jī)將步驟g所述的干燥后的固態(tài)發(fā)酵醪粉碎成60?70目的粉末，即獲得解淀粉芽孢桿菌B3菌劑，將解淀粉芽孢桿菌B3菌劑包裝后，存放在陰涼干燥處。
[0025]優(yōu)選的，所述步驟c中10g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由70g小麥麩皮、20g豆柏粉、1g玉米粉組成。
[0026]優(yōu)選的，所述步驟c中100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，加入200?250mL自來水，混合均勻，使其呈濕潤狀態(tài)，放置于30°C靜置培養(yǎng)7?8h。
[0027]優(yōu)選的，所述步驟d中氧化氯消毒液的pH值為6.0?6.2、二氧化氯濃度為300?360mg/Lo
[0028]優(yōu)選的，所述步驟e中100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基加入380?400mL二氧化氯消毒液，室溫下攪拌均勻，靜置殺菌18?20min。
[0029]優(yōu)選的，所述步驟h中所獲得的解淀粉芽孢桿菌菌劑的芽孢數(shù)達(dá)到200?220億個/g，芽孢率達(dá)到97%?99 %。
[0030]優(yōu)選的，a、種子培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入30g葡萄糖、20g蛋白胨、5g酵母粉、2硫酸銨、5.0g氯化鈉、4.0磷酸二氫鉀、2.0g碳酸鈣。按照所述配比，將各種成分稱重后加入三角瓶中，室溫下攪拌均勻，制得種子培養(yǎng)基；用8層紗布密封后放入高壓滅菌鍋中，115°C滅菌20min，滅菌后把三角瓶冷卻至室溫；
[0031]b、種子液的制備:挑取斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌B3菌種2?3環(huán)，接種到步驟a中所述的種子培養(yǎng)基中，30°C、200rpm搖床振蕩培養(yǎng)12h;
[0032]c、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)處理:10g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由70g小麥麩皮、20g豆柏粉、1g玉米粉組成。按照上述配比，將小麥麩皮、豆柏粉、玉米粉混合均勻，即為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。向100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入250mL自來水，混合均勻，使其呈濕潤狀態(tài)，放置于30°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7h ；
[0033]d、二氧化氯消毒液的配制:將3片二氧化氯消毒泡騰片(lg/片，二氧化氯含量12% )加入到IL水中，待泡騰片完全溶解，并用0.2M鹽酸調(diào)整其pH值為6.0?6.2，即制成濃度為360mg/L 二氧化氯消毒液；
[0034]e、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的殺菌:向步驟c所述的100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入4.0g磷酸二氫鉀、氯化鉀2.5g、氯化鈉5.0g，混勻后轉(zhuǎn)移到帶有機(jī)械攪拌槳的臥式不銹鋼固態(tài)發(fā)酵罐中，再加入400mL步驟d所述的二氧化氯消毒液，室溫下攪拌均勻，靜置殺菌15min;
[0035]f、固態(tài)發(fā)酵:開動機(jī)械攪拌槳攪拌步驟e的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基8?lOmin，其目的是將培養(yǎng)基中殘存的二氧化氯釋放出來，以免在后續(xù)的培養(yǎng)中損傷解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。然后，將步驟b所述解淀粉芽孢桿菌B3以5%接種量接種到攪拌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度34 V，每Sh攪拌一次，每次攪拌8?1min，發(fā)酵96h，得固態(tài)發(fā)酵醪；
[0036]g、干燥:采用60°C?70°C熱風(fēng)將步驟f所述的固態(tài)發(fā)酵醪干燥含水量30%以下；
[0037]h、粉碎:使用錘式粉碎機(jī)將步驟g所述的干燥后的固態(tài)發(fā)酵醪粉碎成60?70目的粉末，即獲得解淀粉芽孢桿菌B3菌劑，其芽孢數(shù)達(dá)到220億個/g，芽孢率達(dá)到99 %。菌劑包裝后，存放在陰涼干燥處。
[0038]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果為:
[0039]①使用二氧化氯消毒劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高溫殺菌來殺滅培養(yǎng)基中的細(xì)菌、酵母、霉菌等雜菌，極大地減少了熱能消耗，降低了生產(chǎn)成本低，而且不會造成境污染。
[0040]②固態(tài)培養(yǎng)基采用二氧化氯消毒劑進(jìn)行殺菌，時間短，生產(chǎn)效率高。
[0041]③二氧化氯消毒劑進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)基的消毒，不會造成營養(yǎng)物質(zhì)的破壞。
[0042]④二氧化氯消毒劑用量極低，100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基僅需84?144mg二氧化氯。
【具體實施方式】
[0043]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0044]實施例一:
[0045]a、種子培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入30g葡萄糖、20g蛋白胨、5g酵母粉、2硫酸銨、5.0g氯化鈉、4.0磷酸二氫鉀、2.0g碳酸鈣。按照所述配比，將各種成分稱重后加入三角瓶中，室溫下攪拌均勻，制得種子培養(yǎng)基；用8層紗布密封后放入高壓滅菌鍋中，115°C滅菌20min，滅菌后把三角瓶冷卻至室溫；
[0046]b、種子液的制備:挑取斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌B3菌種2?3環(huán)，接種到步驟a中所述的種子培養(yǎng)基中，30°C、200rpm搖床振蕩培養(yǎng)12h;
[0047]c、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)處理:10g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由70g小麥麩皮、20g豆柏粉、1g玉米粉組成。按照上述配比，將小麥麩皮、豆柏粉、玉米粉混合均勻，即為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。向100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入250mL自來水，混合均勻，使其呈濕潤狀態(tài)，放置于30°C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7h ；
[0048]d、二氧化氯消毒液的配制:將3片二氧化氯消毒泡騰片(lg/片，二氧化氯含量12% )加入到IL水中，待泡騰片完全溶解，并用0.2M鹽酸調(diào)整其pH值為6.0?6.2，即制成濃度為360mg/L 二氧化氯消毒液；
[0049]e、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的殺菌:向步驟c所述的100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入4.0g磷酸二氫鉀、氯化鉀2.5g、氯化鈉5.0g，混勻后轉(zhuǎn)移到帶有機(jī)械攪拌槳的臥式不銹鋼固態(tài)發(fā)酵罐中，再加入400mL步驟d所述的二氧化氯消毒液，室溫下攪拌均勻，靜置殺菌15min;
[0050]f、固態(tài)發(fā)酵:開動機(jī)械攪拌槳攪拌步驟e的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基8?lOmin，其目的是將培養(yǎng)基中殘存的二氧化氯釋放出來，以免在后續(xù)的培養(yǎng)中損傷解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。然后，將步驟b所述解淀粉芽孢桿菌B3以5%接種量接種到攪拌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度34°C，每Sh攪拌一次，每次攪拌8?lOmin，發(fā)酵96h，得固態(tài)發(fā)酵醪。
[0051 ] g、干燥:采用60°C?70°C熱風(fēng)將步驟f所述的固態(tài)發(fā)酵醪干燥含水量30%以下。
[0052]h、粉碎:使用錘式粉碎機(jī)將步驟g所述的干燥后的固態(tài)發(fā)酵醪粉碎成60?70目的粉末，即獲得解淀粉芽孢桿菌B3菌劑，其芽孢數(shù)達(dá)到220億個/g，芽孢率達(dá)到99 %。菌劑包裝后，存放在陰涼干燥處。
[0053]實施例二
[0054]a、種子培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入20g葡萄糖、20g蛋白胨、1g酵母粉、2.5硫酸銨、5.5g氯化鈉、4.5g磷酸二氫鉀、1.Sg碳酸鈣。按照所述配比，將各種成分稱重后加入三角瓶中，室溫下攪拌均勻，制得種子培養(yǎng)基；用8層紗布密封后放入高壓滅菌鍋中，121°C滅菌15min，滅菌后把三角瓶冷卻至室溫；
[0055]b、種子液的制備:挑取斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌B3菌種2?3環(huán)，接種到步驟a中所述的種子培養(yǎng)基中，30°C、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)14h;
[0056]c、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)處理:10g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由80g小麥麩皮、15g豆柏粉、5g玉米粉組成。按照上述配比，將小麥麩皮、豆柏粉、玉米粉混合均勻，即為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。向100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入200mL自來水，混合均勻，使其呈濕潤狀態(tài)，放置于培養(yǎng)箱中28 °C靜置培養(yǎng)8h ；
[0057]d、二氧化氯消毒液的配制:將2片二氧化氯消毒泡騰片(lg/片，二氧化氯含量12% )加入到IL水中，待泡騰片完全溶解，并用0.2M鹽酸調(diào)整其pH值為6.0?6.2，即制成濃度為240mg/L 二氧化氯消毒液；
[0058]e、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的殺菌:向步驟c所述的100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入5.0g磷酸二氫鉀、氯化鉀3.0g、氯化鈉6.0g，混勻后轉(zhuǎn)移到帶有機(jī)械攪拌槳的臥式不銹鋼固態(tài)發(fā)酵罐中，再加入350mL步驟d所述的二氧化氯消毒液，室溫下攪拌均勻，靜置殺菌20min;
[0059]f、固態(tài)發(fā)酵:開動機(jī)械攪拌槳攪拌步驟e的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基8?lOmin，其目的是將培養(yǎng)基中殘存的二氧化氯釋放出來，以免在后續(xù)的培養(yǎng)中損傷解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。然后，將步驟b所述解淀粉芽孢桿菌B3以4%接種量接種攪拌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度300C，每8h攪拌一次，每次攪拌8?1min，發(fā)酵10h，得固態(tài)發(fā)酵醪。
[0060]g、干燥:采用60°C?70°C熱風(fēng)將步驟f所述的固態(tài)發(fā)酵醪干燥含水量30 %以下。
[0061]h、粉碎:使用錘式粉碎機(jī)將步驟g所述的干燥后的固態(tài)發(fā)酵醪粉碎成60?70目的粉末，即獲得解淀粉芽孢桿菌B3菌劑，其芽孢數(shù)達(dá)到200億個/g，芽孢率達(dá)到97 %。菌劑包裝后，存放在陰涼干燥處。
[0062]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的數(shù)據(jù)范圍和原則之內(nèi)，所作的任何修改、同等替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法，其特征是包括以下步驟: a、種子培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入20?30g葡萄糖、10?20g蛋白胨、5?1g酵母粉、2?2.5硫酸錢、5.0?5.5g氯化鈉、4.0?4.5g磷酸二氫鉀、1.8?2.0g碳酸|丐，按照所述配比，將各種成分稱重后加入三角瓶中，室溫下攪拌均勻，制得種子培養(yǎng)基;用8層紗布密封后放入高壓滅菌鍋中，115°C?121°C滅菌15?20min，滅菌后把三角瓶冷卻至室溫； b、種子液的制備:挑取斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌B3菌種2?3環(huán)，接種到步驟a中所述的種子培養(yǎng)基中，30°C、180?200rpm搖床振蕩培養(yǎng)12?14h; C、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)處理:10g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由70?80g小麥麩皮、15?20g豆柏粉、5?1g玉米粉組成；按照上述重量配比，將小麥麩皮、豆柏粉、玉米粉混合均勻，即為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；向100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入200?250mL自來水，混合均勻，使其呈濕潤狀態(tài)，放置于培養(yǎng)箱中28 0C?30 0C靜置培養(yǎng)7?8h; d、二氧化氯消毒液的配制:將2?3片二氧化氯消毒泡騰片加入到IL水中，待泡騰片完全溶解，并用0.2M鹽酸調(diào)整其pH值為6.0?6.2，即制成濃度為240?360mg/L二氧化氯消毒液； e、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的殺菌:向步驟c所述的100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入4?5g磷酸二氫鉀、氯化鉀2.5?3g、氯化鈉5.0?6g，混勻后轉(zhuǎn)移到帶有機(jī)械攪拌槳的臥式不銹鋼固態(tài)發(fā)酵罐中，再加入350?400mL步驟d所述的二氧化氯消毒液，室溫下攪拌均勻，靜置殺菌15?20min； f、固態(tài)發(fā)酵:開動機(jī)械攪拌槳攪拌步驟e的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基8?lOmin，其目的是將培養(yǎng)基中殘存的二氧化氯釋放出來，以免在后續(xù)的培養(yǎng)中損傷解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞，然后，將步驟b所述解淀粉芽孢桿菌B3以4%?5%接種量接種到攪拌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度30?34 °C，每8h攪拌一次，每次攪拌8?1min，發(fā)酵96?10h，得固態(tài)發(fā)酵醪。 g、干燥:采用60°C?70°C熱風(fēng)將步驟f所述的固態(tài)發(fā)酵醪干燥含水量30%以下。 h、粉碎:使用錘式粉碎機(jī)將步驟g所述的干燥后的固態(tài)發(fā)酵醪粉碎成60?70目的粉末，即獲得解淀粉芽孢桿菌B3菌劑，將解淀粉芽孢桿菌B3菌劑包裝后，存放在陰涼干燥處。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法，其特征是:所述步驟c中10g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由70g小麥麩皮、20g豆柏粉、1g玉米粉組成。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法，其特征是:所述步驟c中100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，加入200?250mL自來水，混合均勻，使其呈濕潤狀態(tài)，放置于30°C靜置培養(yǎng)7?8h。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法，其特征是:所述步驟d中氧化氯消毒液的pH值為6.0?6.2、二氧化氯濃度為300?360mg/L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法，其特征是:所述步驟e中100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基加入380?400mL二氧化氯消毒液，室溫下攪拌均勻，靜置殺菌18?20mino6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法，其特征是，所述步驟h中所獲得的解淀粉芽孢桿菌菌劑的芽孢數(shù)達(dá)到200?220億個/g，芽孢率達(dá)到97%?99%。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)解淀粉芽孢桿菌菌劑的方法，其特征是包括以下具體步驟: a、種子培養(yǎng)基的配制及滅菌:于IL水中，加入30g葡萄糖、20g蛋白胨、5g酵母粉、2硫酸銨、5.0g氯化鈉、4.0磷酸二氫鉀、2.0g碳酸鈣。按照所述配比，將各種成分稱重后加入三角瓶中，室溫下攪拌均勻，制得種子培養(yǎng)基；用8層紗布密封后放入高壓滅菌鍋中，115°C滅菌20min，滅菌后把三角瓶冷卻至室溫； b、種子液的制備:挑取斜面保藏的解淀粉芽孢桿菌B3菌種2?3環(huán)，接種到步驟a中所述的種子培養(yǎng)基中，30°C、200rpm搖床振蕩培養(yǎng)12h; c、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)處理:10g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由70g小麥麩皮、20g豆柏粉、1g玉米粉組成。按照上述配比，將小麥麩皮、豆柏粉、玉米粉混合均勻，即為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。向I OOOg固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入250mL自來水，混合均勻，使其呈濕潤狀態(tài)，放置于30 °C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7h; d、二氧化氯消毒液的配制:將3片二氧化氯消毒泡騰片(lg/片，二氧化氯含量12%)加入到IL水中，待泡騰片完全溶解，并用0.2M鹽酸調(diào)整其pH值為6.0?6.2，即制成濃度為360mg/L 二氧化氯消毒液； e、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的殺菌:向步驟c所述的100g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入4.0g磷酸二氫鉀、氯化鉀2.5g、氯化鈉5.0g，混勻后轉(zhuǎn)移到帶有機(jī)械攪拌槳的臥式不銹鋼固態(tài)發(fā)酵罐中，再加入400mL步驟d所述的二氧化氯消毒液，室溫下攪拌均勻，靜置殺菌15min; f、固態(tài)發(fā)酵:開動機(jī)械攪拌槳攪拌步驟e的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基8?lOmin，其目的是將培養(yǎng)基中殘存的二氧化氯釋放出來，以免在后續(xù)的培養(yǎng)中損傷解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。然后，將步驟b所述解淀粉芽孢桿菌B3以5 %接種量接種到攪拌后的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度340C，每8h攪拌一次，每次攪拌8?1min，發(fā)酵96h，得固態(tài)發(fā)酵醪； g、干燥:采用60°C?70°C熱風(fēng)將步驟f所述的固態(tài)發(fā)酵醪干燥含水量30%以下； h、粉碎:使用錘式粉碎機(jī)將步驟g所述的干燥后的固態(tài)發(fā)酵醪粉碎成60?70目的粉末，即獲得解淀粉芽孢桿菌B3菌劑，其芽孢數(shù)達(dá)到220億個/g，芽孢率達(dá)到99%。菌劑包裝后，存放在陰涼干燥處。
【文檔編號】C12N1/20GK105886430SQ201610268604
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】盧麥田, 趙國群, 盧士康
【申請人】石家莊大眾肥業(yè)有限公司