鐵離子在枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域，具體涉及鐵離子在枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ -聚谷氨酸中的應用。
【背景技術】
[0002]γ -聚谷氨酸(γ -PGA)是由谷氨酸單體通過γ -谷氨酰胺鍵聚合而成的一類均聚氨基酸。由于谷氨酸分子具有兩個羧基，因此其均聚物有兩種異構體。而至今發(fā)現(xiàn)的生物合成的聚谷氨酸均為γ-PGA，S卩谷氨酸單體之間通過γ-羧基和α-氨基形成的酰胺鍵連接而成。γ-PGA主要由芽孢桿菌屬分泌出的胞外多肽，是這些微生物的莢膜的主要成分。它能保護微生物并且降低受外界環(huán)境的影響。γ -PGA是一種線性的高分子，且具有許多羧基，在鏈內鏈間形成大量的氫鍵，使γ -PGA具有很高與水相溶性。γ -PGA是由谷氨酸通過肽鍵連接起來，易受環(huán)境中微生物和酶的作用，降解成無毒的短鏈多肽或谷氨酸單體。因此γ -PGA具有很好的生物相容性和生物可降解性，是一種綠色生物產(chǎn)品。γ -PGA在食品、醫(yī)藥、環(huán)境、農業(yè)、日化等行業(yè)都具有廣闊的應用前景。如在食品行業(yè)可用作防凍劑和鈣離子穩(wěn)定劑；醫(yī)藥方面可用作藥物載體和黏合劑；環(huán)境方面可作為絮凝劑和金屬吸附劑；農業(yè)方面可用作農林保水劑、肥料緩釋劑和肥料增效劑；日化方面可以制備為紙尿褲的吸水凝膠和作為化妝品的保水成分。
[0003]γ -PGA作為一種高聚物，分子量是其重要的結構參數(shù)之一。不同用途需要對所需求的γ-PGA的分子量都有所不同。而直接發(fā)酵所得的γ-PGA的分子量分布大于1000kD。在化妝品領域，醫(yī)學領域所需γ-PGA主要都是分子量小于500kD。因此生產(chǎn)低分子量γ-PGA很必要。目前主要利用酸/堿水解大分子量的γ-PGA，雖然在工業(yè)生產(chǎn)中最常用，但有數(shù)據(jù)表明酸水解后γ-PGA含量會明顯減少。如能通過調整和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，在微生物發(fā)酵階段直接降低產(chǎn)物分子量，開發(fā)一種高效低成本生產(chǎn)低分子量γ-PGA的新工藝，將具有較好的前景。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的第一個目的是提供鐵離子在枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ_聚谷氨酸中的應用。
[0005]本發(fā)明的鐵離子在枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸中的應用，其特征在于，鐵離子能夠提高低分子量γ -聚谷氨酸的產(chǎn)量，所述的鐵離子為二價鐵離子或三價鐵離子。
[0006]本發(fā)明的第二個目的是提供一種利用鐵離子提高低分子量γ -聚谷氨酸產(chǎn)量的液體發(fā)酵方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]將鐵離子加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中并混合，由此得到含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后將枯草芽孢桿菌接種到含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸；
[0008]或者，將枯草芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當發(fā)酵液中γ -聚谷氨酸含量達I8g/L以上時，加入鐵離子至發(fā)酵液中，混合后繼續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ -聚谷氨酸；
[0009]所述的鐵離子為二價鐵離子或三價鐵離子。
[0010]優(yōu)選，當鐵離子為二價鐵離子時，其在含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基或發(fā)酵液中的濃度為 2.81 ?14.lmmol/Lo
[0011]優(yōu)選，當鐵離子為三價鐵離子時，其在含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基或發(fā)酵液中的濃度為 2.96 ?29.6mmol/L0
[0012]優(yōu)選，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基每升含有:檸檬酸12g、甘油80g、L-谷氨酸20g、氯化銨7g、磷酸氫二鉀0.5g、七水硫酸鎂0.5g、二水氯化媽0.15g和一水硫酸猛0.104g，余量為水，pH 6.5o
[0013]優(yōu)選，所述的鐵離子是以氯化鐵、硫酸亞鐵或檸檬酸鐵的形式加入。
[0014]優(yōu)選，所述的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PGA-7，其保藏編號為:CCTCC NO:M206102o
[0015]所述的將枯草芽孢桿菌接種到含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)或者將枯草芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選，其種子液的接種量為1?10%，發(fā)酵溫度37°C，在往復式搖床振蕩培養(yǎng)72?120h，搖床轉速80?150r/min，沖程為65?75mm。
[0016]本發(fā)明提供了鐵離子在枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)低分子量γ -聚谷氨酸中的應用，將鐵離子應用于枯草芽孢桿菌的γ-聚谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，可以大大提高低分子量γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率，并且保持γ -聚谷氨酸的高產(chǎn)；利用本發(fā)明方法，使高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占總γ_聚谷氨酸的百分數(shù)從原來的66.16%下降到27.38%?4.01%，而低于100kD的γ -聚谷氨酸(低分子量γ -聚谷氨酸)的含量占總γ -聚谷氨酸的百分數(shù)從原來的4.59%上升至33.13%?81.03% ;同時γ -聚谷氨酸的產(chǎn)量維持20g/L以上。本發(fā)明的鐵離子提高低分子量γ_聚谷氨酸的產(chǎn)量的發(fā)酵方法簡單有效，是一種廉價高效生產(chǎn)低分子量γ-聚谷氨酸的方法，具有廣闊的應用前景。
【具體實施方式】
[0017]以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0018]以下實施例中的枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) PGA-7，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為:CCTCC NO:M206102，該菌公開于專利號:ZL 200610122640.5，發(fā)明名稱為:γ -聚谷氨酸產(chǎn)生菌及利用該菌株制備γ-聚谷氨酸的方法的專利中。
[0019]實施例1:
[0020]菌種的活化:將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)PGA-7菌種接種在固體培養(yǎng)基斜面上，37°C培養(yǎng)16?24h，得到活化的枯草芽孢桿菌菌種。所述的固體培養(yǎng)基的成分:蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂20g/L，余量為水，pH7.0?7.2 ;配制方法是將上述成分混合均勻后，調pH值，然后滅菌備用。
[0021]種子液的制備:取2環(huán)上述活化的枯草芽孢桿菌菌種，接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的300mL三角瓶中，37°C，lOOrprn振蕩培養(yǎng)18h，得到枯草芽孢桿菌種子液。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分:檸檬酸12g/L，甘油80g/L，L-谷氨酸20g/L，氯化銨7g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，二水氯化鈣0.15g/L，一水硫酸錳0.104g/L，余量為水，調pH為6.5 ;配制方法是將上述成分混合均勻后，調pH值，然后滅菌備用。
[0022]液體搖瓶發(fā)酵:按上述方法配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分數(shù)2.5%接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37°C，在往復式搖床振蕩培養(yǎng)72h，搖床轉速80r/min，沖程為75mm ;當發(fā)酵液中γ -聚谷氨酸達到18.2g/L時，加入無菌的三氯化鐵溶液，使發(fā)酵液中的三價鐵離子濃度達到14.8mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)48h0所述的無菌的三氯化鐵溶液是先配制0.2mol/L三氯化鐵溶液，然后經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾滅菌而得(下同)。發(fā)酵完畢，檢測γ_聚谷氨酸的產(chǎn)量為21.01g/L。分子量分布為高于245kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ -聚谷氨酸為4.45%，245-100kD的γ -聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為26.73%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占總γ_聚谷氨酸為68.82%ο
[0023]實施例2:
[0024]菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。
[0025]液體搖瓶發(fā)酵:在發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)中加入三氯化鐵，使三價鐵離子的終濃度為2.96mmol/L,配制成含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分數(shù)1 %的量接種至含有鐵尚子的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37°C，在往復式搖床振蕩培養(yǎng)72h，搖床轉速80r/min，沖程為75mm。發(fā)酵完畢，檢測γ -聚谷氨酸的產(chǎn)量為25.76g/L。分子量分布為高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為27.38%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為39.49%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占總γ -聚谷氨酸為33.13%。
[0026]實施例3:
[0027]菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。
[0028]液體搖瓶發(fā)酵:在發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)中加入三氯化鐵，使三價鐵離子的終濃度為7.4mmol/L,配制成含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分數(shù)5%的量接種至含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37°C，在往復式搖床振蕩培養(yǎng)96h，搖床轉速110r/min，沖程為75_。發(fā)酵完畢，檢測y -聚谷氨酸的產(chǎn)量為24.69g/Lo分子量分布為高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為9.29%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為32.35%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占總γ -聚谷氨酸為58.36%。
[0029]實施例4:
[0030]菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。
[0031]液體搖瓶發(fā)酵:在發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)中加入三氯化鐵，使三價鐵離子的終濃度為11.lmmol/L，配制成含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分數(shù)5%的量接種至含有鐵尚子的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37 °C，在往復式搖床振蕩培養(yǎng)96h，搖床轉速110r/min，沖程為75mm。發(fā)酵完畢，檢測γ -聚谷氨酸的產(chǎn)量為22.70g/L。分子量分布為高于245kD的γ -聚谷氨酸的含量占總γ-聚谷氨酸為5.37%，245-100kD的γ-聚谷氨酸的含量占總γ -聚谷氨酸為27.02%，低于100kD的的γ-聚谷氨酸的含量占總γ -聚谷氨酸為67.61 %。
[0032]實施例5:
[0033]菌種的活化和種子液的制備步驟與實施例1相同。
[0034]液體搖瓶發(fā)酵:在發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同實施例1的發(fā)酵培養(yǎng)基)中加入三氯化鐵，使三價鐵離子的終濃度為14.8mmol/L,配制成含有鐵離子的發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝50mL入300mL三角瓶，將枯草芽孢桿菌種子液按接種量為體積分數(shù)5%的量接種至含有鐵尚子的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37 °C，在往復式搖床振蕩培養(yǎng)96h，搖床轉速110r/min，沖程為75mm。發(fā)酵完畢，檢測γ -聚谷氨酸的產(chǎn)量為22.58g/L。