專利名稱：使用腈水解酶突變體生產(chǎn)3-羥基羧酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學和微生物學領域。更具體地說，本發(fā)明涉及具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶，所述腈水解酶用于將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸。
背景技術：
具有優(yōu)異性能、獨特性質(zhì)、改善的成本效率、品質(zhì)以及低生態(tài)影響的新聚合物正引起工業(yè)界的注意。特別是，需要具有支鏈、致密結構以及末端帶反應基的功能聚合物，因為與常規(guī)線型統(tǒng)計共聚物相比，它們具有更低的特性粘度和更高的活性。這樣優(yōu)異的聚合物可通過共聚高支化(hyperbranching)羥基羧酸共聚單體(高支化ABn型，其中A和B是具有羥基或羧基衍生的反應基部分，η是2或更大)(Hult等， pp. 656-658 禾口 Voit 等，pp.658-659 in Concise Polymeric Materials Encyclopedia, ^m 輯.J. C. Salomone, CRC Press, New York, 1999)和多種線型羥基羧酸共聚單體(線型AB 型)包括3-羥基戊酸(3-HVA)和3-羥基丁酸(3-HBA)得以制備。3-羥基羧酸用作為共聚單體用于制造線型聚酯。聚酯被用作為熱塑性、熱固性、半結晶、非晶形、剛性和彈性體材料。它們是纖維、薄膜、模制品和涂料的主要成分(Goodman， pp.793-799 in Concise Encyclopedia of Polymer Science and EnRineerinR, 編車t. J. I.Kroschwitz, John Wiley&Sons，New York,1990)。已在使用皺落假絲酵母(Candida rugosa)的發(fā)酵中通過戊酸的3_羥基化作用制備了 3-羥基戊酸(Hasegawa 等，J. Ferment. Technol. 59 :257-262(1981) JP 59053838B4)，并且通過使用惡臭假單胞菌(I^seudomonas putida)、產(chǎn)藍色素熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)禾口 Arthrobacter crystallopietes，經(jīng)發(fā)酵的戊酸的3-羥基化作用，類似地制備了 3_羥基戊酸的單一對映體(U. S. 3，553，081)。這些用于戊酸發(fā)酵氧化的方法通常產(chǎn)生低產(chǎn)物濃度的3-羥基戊酸，并且從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離3-羥基戊酸需要精心設計且費用昂貴。已通過化學降解 (Seekich 等，HeIv. CMm. Acta 77:2007-2034(1994))或聚(3-羥基丁酸酯/3-羥基戊酸酯)發(fā)酵自降解(W0 9929889)制備得到(R) _ (_) _3_羥基戊酸，但是羥基丁酸/羥基戊酸共聚物的降解同樣需要費力地將3-羥基丁酸與副產(chǎn)物3-羥基戊酸分離。還已通過酶促還原 3-氧代戊酸(Bayer 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 42 :543-547 (1994))或不對稱氫化甲基3-氧代戊酸酯接著皂化(Burk等，Organometallics 9 :2653-2655(1990))制備得到(R)-(-)-3-羥基戊酸。通過多種化學方法，腈容易地轉(zhuǎn)化為相應的羧酸。這些方法需要強的酸性和堿性反應條件和高反應溫度，且通常產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物和/或作為不需要的廢棄物的大量無機鹽。用于化學水解額外具有羥基的腈的反應條件，例如用于將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸的反應條件，通常會導致不期望的伯、仲或叔羥基消除，產(chǎn)生碳-碳雙鍵。腈酶催化水解為相應的羧酸是經(jīng)常優(yōu)選的化學方法，因為該反應通常在環(huán)境溫度下進行，無需強的酸性或堿性反應條件，并以高轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生高選擇性的所需產(chǎn)物。兩種酶——腈水合酶和酰胺酶的組合可用于在水溶液中將脂肪腈轉(zhuǎn)化為相應的羧酸。開始，通過腈水合酶將脂肪腈轉(zhuǎn)化為酰胺，接著，隨后通過酰胺酶將酰胺轉(zhuǎn)化為相應的羧酸。已知多種細菌菌屬具有不同的腈水合酶和酰胺酶活性譜(Sugai等，Biosci. Biotech. Biochem. 61 1419-1427(1997))，包括紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)硫桿菌屬(Alcaligenes)、節(jié)核細菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、無芽孢桿菌屬(Bacteridium) lifM (Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)禾口微球菌屬(Micrococcus)。真菌節(jié)鐮孢(Fusarium merismoides) TG-I還已用作為催化劑用于水解脂肪腈和二腈(Asano 等，Agric. Biol. Chem. 44 =2497-2498 (1980)) 來自紅球菌 (Rhodococcus sp.)(來自Novo Industri的SP409)的固定化腈水合酶和酰胺酶被用于將 3-羥基丙腈、3-羥基庚腈和3-羥基壬腈水解為相應的3-羥基羧酸，產(chǎn)率分別為63%、62% 和 83% (de Raadt 等，J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1，137-140 (1992))。使用 TLC 也觀察到了相應的酰胺的形成。與此相反，蒼白芽孢桿菌(Bacillus pallidas)Dac521的純化的腈水合酶水解多種脂肪腈，但不水解3-羥基丙腈(Cramp等，Biochim. Biophys. Acta 1431 249-260(1999))。單種酶一腈水解酶在水溶液中也將腈轉(zhuǎn)化為相應的羧酸和氨，但沒有酰胺中間體形成(方程式1和2)。
權利要求
1.如SEQID NO :11所示的分離的核酸分子。
2.一種包含可操作地連接有合適的調(diào)節(jié)序列的權利要求1的分離的核酸分子的嵌合基因。
3.一種包含權利要求2的嵌合基因的表達盒。
4.一種包含權利要求2的嵌合基因的轉(zhuǎn)化的微生物。
5.一種包含權利要求3的表達盒的轉(zhuǎn)化的微生物。
6.權利要求4的轉(zhuǎn)化的微生物，其中所述微生物選自叢毛單胞菌(Comamonassp.)、 棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)、fei|f菌(Brevibacterium sp·)、紅球菌(Rhodococcus sp·)、固氮菌(Azotobactersp.)、梓樣酸桿菌(Citrobacter sp·)、腸桿菌(Enterobacter sp.)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium sp.)、克雷白氏桿菌(Klebsiella sp.)、沙門氏菌 (Salmonella sp.)、乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)、曲霄(Aspergillus sp·)、糖酵母 (Saccharomyces sp.)、接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)、畢赤氏酵母(Pichia sp.)、 克魯維氏酵母(Kluyveromyces sp.)、假絲酵母(Candida sp.)、漢森氏酵母(Hansenula sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、德巴利氏酵母(Debaryomyces sp.)、毛霉(Mucor sp.)、球擬酵母(Torulopsis sp.)、甲基桿菌(Methylobacteria sp·)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、 埃希氏桿菌(Escherichia sp. )、/[段單胞菌(Pseudomonas sp. )、f艮瘤菌(Rhizobium sp.) 禾口鏈霉菌(Streptomyces sp.)。
7.權利要求6的轉(zhuǎn)化的微生物，其中所述轉(zhuǎn)化的微生物是一種大腸桿菌菌株，選自保藏號為 ATCC 47076 的 MG1655、保藏號為 ATCC53911 的 FM5、保藏號為 ATCC 27325 的 W3110、 保藏號為ATCC35695的MC4100和保藏號為ATCC 12435的W1485。
8.一種用于將3-羥基腈水解為3-羥基羧酸的方法，包括步驟(a)將反應混合物水溶液中的3-羥基腈與腈水解酶催化劑接觸，由此所述3-羥基腈被水解為相應的3-羥基羧酸，所述腈水解酶催化劑為權利要求1的分離的核酸分子所編碼；和(b)任選地分離步驟 (a)中產(chǎn)生的3-羥基羧酸。
9.權利要求8的方法，其中所述3-羥基腈是3-羥基戊腈或3-羥基丁腈。
10.一種用于將3-羥基戊腈水解為3-羥基戊酸的方法，包括步驟(a)將反應混合物水溶液中的3-羥基戊腈與權利要求1的分離的核酸分子編碼的腈水解酶催化劑接觸，由此所述3-羥基戊腈被水解為3-羥基戊酸；和(b)任選地分離步驟(a)中產(chǎn)生的3-羥基戊酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用腈水解酶突變體生產(chǎn)3-羥基羧酸。本發(fā)明涉及具有改善的用于將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶突變體。更具體地說，使用易錯PCR和位點定向誘變突變敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶基因以產(chǎn)生具有改善的用于將3-羥基腈(如3-羥基丁腈或3-羥基戊腈)轉(zhuǎn)化為相應的3-羥基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶。也提供了一種使用所述改善的突變體生產(chǎn)3-羥基羧酸的方法。
文檔編號C12R1/13GK102260693SQ20111019553
公開日2011年11月30日 申請日期2005年8月16日 優(yōu)先權日2004年8月16日
發(fā)明者D·P·奧基夫, M·S·佩恩, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司