專利名稱：使用腈水解酶突變體生產(chǎn)3-羥基羧酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及具有改善的腈水解酶活性的突變的腈水解酶，所述腈水解酶用于將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸。
背景技術(shù)：
具有優(yōu)異性能、獨(dú)特性質(zhì)、改善的成本效率、品質(zhì)以及低生態(tài)影響的新聚合物正引起工業(yè)界的注意。特別是，需要具有支鏈、致密結(jié)構(gòu)以及末端帶反應(yīng)基的功能聚合物，因?yàn)榕c常規(guī)線型統(tǒng)計(jì)共聚物相比，它們具有更低的特性粘度和更高的活性。這樣優(yōu)異的聚合物可通過共聚高支化(hyperbranching)羥基羧酸共聚單體(高支化ABn型，其中A和B是具有羥基或羧基衍生的反應(yīng)基部分，η是2或更大)(Hult等， pp. 656-658 禾口 Voit 等，pp.658-659 inConcise Polymeric Materials Encyclopedia,^m 輯.J. C. Salomone, CRC Press, New York, 1999)和多種線型羥基羧酸共聚單體(線型AB 型)包括3-羥基戊酸(3-HVA)和3-羥基丁酸(3-HBA)得以制備。3-羥基羧酸用作為共聚單體用于制造線型聚酯。聚酯被用作為熱塑性、熱固性、半結(jié)晶、非晶形、剛性和彈性體材料。它們是纖維、薄膜、模制品和涂料的主要成分(Goodman， pp.793-799 in Concise Encyclopedia of Polymer Science and EnRineerinR, 編車t. J. I.Kroschwitz, John Wiley&Sons，New York,1990)。已在使用皺落假絲酵母(Candida rugosa)的發(fā)酵中通過戊酸的3_羥基化作用制備了 3-羥基戊酸(Hasegawa 等，J. Ferment. Technol. 59 :257-262(1981) JP 59053838B4)，并且通過使用惡臭假單胞菌(I^seudomonas putida)、產(chǎn)藍(lán)色素?zé)晒饧賳伟?Pseudomonas fluorescens)、氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)禾口 Arthrobacter crystallopietes，經(jīng)發(fā)酵的戊酸的3-羥基化作用，類似地制備了 3_羥基戊酸的單一對映體(U. S. 3，553，081)。這些用于戊酸發(fā)酵氧化的方法通常產(chǎn)生低產(chǎn)物濃度的3-羥基戊酸，并且從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離3-羥基戊酸需要精心設(shè)計(jì)且費(fèi)用昂貴。已通過化學(xué)降解 (Seekich 等，HeIv. CMm. Acta 77:2007-2034(1994))或聚(3-羥基丁酸酯/3-羥基戊酸酯)發(fā)酵自降解(W0 9929889)制備得到(R) _ (_) _3_羥基戊酸，但是羥基丁酸/羥基戊酸共聚物的降解同樣需要費(fèi)力地將3-羥基丁酸與副產(chǎn)物3-羥基戊酸分離。還已通過酶促還原 3-氧代戊酸(Bayer 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 42 :543-547 (1994))或不對稱氫化甲基3-氧代戊酸酯接著皂化(Burk等，Organometallics 9 :2653-2655(1990))制備得到(R)-(-)-3-羥基戊酸。通過多種化學(xué)方法，腈容易地轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸。這些方法需要強(qiáng)的酸性和堿性反應(yīng)條件和高反應(yīng)溫度，且通常產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物和/或作為不需要的廢棄物的大量無機(jī)鹽。用于化學(xué)水解額外具有羥基的腈的反應(yīng)條件，例如用于將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸的反應(yīng)條件，通常會導(dǎo)致不期望的伯、仲或叔羥基消除，產(chǎn)生碳-碳雙鍵。腈酶催化水解為相應(yīng)的羧酸是經(jīng)常優(yōu)選的化學(xué)方法，因?yàn)樵摲磻?yīng)通常在環(huán)境溫度下進(jìn)行，無需強(qiáng)的酸性或堿性反應(yīng)條件，并以高轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生高選擇性的所需產(chǎn)物。兩種酶——腈水合酶和酰胺酶的組合可用于在水溶液中將脂肪腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸。開始，通過腈水合酶將脂肪腈轉(zhuǎn)化為酰胺，接著，隨后通過酰胺酶將酰胺轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸。已知多種細(xì)菌菌屬具有不同的腈水合酶和酰胺酶活性譜(Sugai等，Biosci. Biotech. Biochem. 61 1419-1427(1997))，包括紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、產(chǎn)硫桿菌屬(Alcaligenes)、節(jié)核細(xì)菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、無芽孢桿菌屬(Bacteridium) lifM (Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)禾口微球菌屬(Micrococcus)。真菌節(jié)鐮孢(Fusarium merismoides) TG-I還已用作為催化劑用于水解脂肪腈和二腈(Asano 等，Agric. Biol. Chem. 44 =2497-2498 (1980)) 來自紅球菌 (Rhodococcus sp.)(來自Novo Industri的SP409)的固定化腈水合酶和酰胺酶被用于將 3-羥基丙腈、3-羥基庚腈和3-羥基壬腈水解為相應(yīng)的3-羥基羧酸，產(chǎn)率分別為63%、62% 和 83% (de Raadt 等，J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1，137-140 (1992))。使用 TLC 也觀察到了相應(yīng)的酰胺的形成。與此相反，蒼白芽孢桿菌(Bacillus pallidas)Dac521的純化的腈水合酶水解多種脂肪腈，但不水解3-羥基丙腈(Cramp等，Biochim. Biophys. Acta 1431 249-260(1999))。單種酶一腈水解酶在水溶液中也將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸和氨，但沒有酰胺中間體形成(方程式1和2)。
.O
Μ、 n晴水解酵 ^ //
⑴ R—⑶R—\ + ^
nOH
(2) R-CN+ NH3
H2O\ Η,Ο\3
NH2 -OH Kobayashi 等(Tetrahedron 46:5587—5590(1990)禾口 J. Bacteriologyl72
4807-4815(1990))已描述了一種分離自紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)K22 的
脂族腈水解酶，其催化多種脂肪腈水解為相應(yīng)的羧酸。業(yè)已分離了來自睪丸酮叢毛單胞
菌(Comamonas testosteroni)的腈水解酶，其能將一系列脂族α，ω-二腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的
ω-氰羧酸或二羧酸(CA 2，103,616 ;Levy-Schil 等，Gene 161 15-20 (1995))。還利用紫紅
紅球菌 NCIMB 11216 (Bengis-Garber 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 32 :11-16(1989)；
Gradley 等，Biotechnology Lett. 16 :41-46 (1994))、紫紅紅球菌 PA-34 (Bhalla 等，
Appl. Microbiol. Biotechnol. 37 :184-190(1992))、尖鐮孢(Fusarium oxysporum f. sp.
melonis) (Goldlust 等，Biotechnol. Appl. Biochem. 11 :581-601 (1989))、不動桿菌
(Acinetobacter sp. )AK 226 (Yamamoto φ, Agric. Biol. Chem. 55 1459-1473 (1991)) >獎產(chǎn)喊桿菌(Alcaligenes faecal is) ATCC 8750 (Yamamoto 等，J. Ferment. Bioeng. 73 425-430(1992))和敏捷食酸菌(Acidovorax facilis) 72W(Gavagan 等，J. Org. Chem. 63 4792-4801(1998))生產(chǎn)了脂族腈水解酶。業(yè)已克隆并重組表達(dá)了編碼敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的基因 ((WO 01/75077 ；相應(yīng)于 US 6, 870, 038)和 Chauhan 等，Appl Microbiol Biotechnol,61 118-122 (2003))。敏捷食酸菌72W腈水解酶以高產(chǎn)率將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸(US 6，562，60；3)。所產(chǎn)生的3-羥酸被用作為基質(zhì)用于制備包括高支化共聚多酯在內(nèi)的聚合物。兩種特別有用的3-羥基羧酸是3-羥基戊酸(3-HVA)和3-羥基丁酸(3-HBA)。用于以高達(dá)100%轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)率將3-羥基戊腈(3-BTVTST)或3-羥基丁腈(3-HBN)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸的，具有改善的腈水解酶活性的腈水解酶，對于減少工業(yè)生產(chǎn)成本應(yīng)當(dāng)是十分有用的。因此，所要解決的問題就是提供具有用于將3-羥基腈高產(chǎn)率地轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的羧酸的活性的腈水解酶。更具體地說，用于將3-羥基腈(如3-羥基戊腈或3-羥基丁腈) 轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸的，具有腈水解酶活性顯著改善的腈水解酶(相對于敏捷食酸菌 72W的腈水解酶活性)，應(yīng)當(dāng)能用于減少工業(yè)生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
當(dāng)將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥酸時(shí)，突變并篩選具有改善的的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶。相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶的活性，鑒定了具有改善的腈水解酶活性的幾個(gè)氨基酸取代。因此，提供了編碼相對于敏捷食酸菌72W腈水解酶具有改善的腈水解酶活性的多肽的分離的核酸分子，其中所述分離的核酸分子編碼如SEQ ID N0:4所示序列的至少一個(gè)氨基酸取代的序列，所述取代選自a)在第210位用丙氨酸、異亮氨酸或半胱氨酸取代；b)在第65位用半胱氨酸取代；c)在第168位用賴氨酸、纈氨酸或亮氨酸取代；和d)在第174位用異亮氨酸取代。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種編碼酶促活性的腈水解酶多肽的分離的核酸片段， 所述多肽具有選自SEQ ID N0:6、8、12、14、16和18的多肽序列；并且，當(dāng)在相同反應(yīng)條件下將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸時(shí)，具有與敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的腈水解酶活性相比至少高1. 8倍的腈水解酶活性。還包括在本發(fā)明之中的是一種分離的核酸片段，所述核酸片段選自SEQ ID NOs 5、7、11、13、15和17，其中所述分離的核酸片段編碼一種多肽，當(dāng)在相同的水溶液反應(yīng)條件下將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸時(shí)，所述多肽具有相對于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746) 腈水解酶的活性至少高1. 8倍的腈水解酶活性改善。本發(fā)明的另外施方案包括本發(fā)明核酸片段所編碼的多肽；包含可操作地連接到適合的調(diào)節(jié)序列的本發(fā)明分離的核酸片段的嵌合基因；包含本發(fā)明嵌合基因的表達(dá)盒；包含本發(fā)明嵌合基因的轉(zhuǎn)化的微生物；以及包含本發(fā)明表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化的微生物。另一個(gè)實(shí)施方案是一種用于將3-羥基腈水解為3-羥基羧酸的改良方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基腈與改良的腈水解酶催化劑接觸，所述改良的腈水解酶催化劑特征在于在相同的反應(yīng)條件下，與敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性相比具有至少1. 8倍改善，所述改良的腈水解酶催化劑為本發(fā)明分離的核酸片段所編碼；和(b)任選地分離步驟(a)中生產(chǎn)的3-羥基羧酸。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種用于將3-羥基戊腈水解為3-羥基戊酸的改良方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基戊腈與本發(fā)明分離的核酸片段所編碼的腈水解酶催化劑接觸，所述腈水解酶催化劑特征在于在相同的反應(yīng)條件下，相對于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性具有至少1. 8倍腈水解酶活性改善；和(b)任選地分離步驟(a)中生產(chǎn)的3-羥基戊酸。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是一種用于將3-羥基丁腈水解為3-羥基丁酸的改良方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基丁腈與具有SEQ ID NO :6的多肽序列的酶促活性的腈水解酶催化劑接觸，所述腈水解酶催化劑特征在于在相同的反應(yīng)條件下， 相對于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性具有至少1. 9倍腈水解酶活性改善； 和(b)任選地分離步驟(a)中生產(chǎn)的3-羥基丁酸。所提供序列簡述通過下列詳細(xì)說明和所附的序列表計(jì)算機(jī)可讀形式，其內(nèi)容引入作為本申請的一部分，可以更全面地理解本發(fā)明。以下序列符合37C. F. R. 1. 821-1. 825 ( “包含核苷酸序列和/或氨基酸序列披露的專利申請要求一序列細(xì)則”)，并且也符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST. 25(1998) 和EPC和PCT的序列表要求(細(xì)則5. 2和49. 5 (a-bis)，以及行政規(guī)程第208節(jié)和附錄C)。 用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式符合37C. F. R. § 1. 822的規(guī)定。SSEQ ID NO :1是用于易錯(cuò)PCR的引物的核酸序列，并用于擴(kuò)增敏捷食酸菌72W腈水解酶。SEQ ID NO :2是用于易錯(cuò)PCR的引物的核酸序列，并用于擴(kuò)增敏捷食酸菌72W腈水解酶。SEQ ID NO 3是在質(zhì)粒ρ匪18中用作為對照的敏捷食酸菌72W腈水解酶編碼序列的核酸序列。為了便于在大腸桿菌中表達(dá)，除起始密碼子由GTG變?yōu)锳TG之外，該序列與野生型敏捷食酸菌72W腈水解酶序列相同。SEQ ID NO :4是表達(dá)自質(zhì)粒ρ匪18的敏捷食酸菌72W腈水解酶的推斷的氨基酸序列。SEQ ID NO 5是質(zhì)粒ρ匪18/Β2和ρ匪18/Η9中突變的腈水解酶編碼序列的核酸序列。SEQ ID NO 6是表達(dá)自質(zhì)粒ρ匪18/Β2和ρ匪18/Η9的突變的腈水解酶的推斷的氨
基酸序列。SEQ ID NO 7是質(zhì)粒ρ匪18/Β4中突變的腈水解酶編碼序列的核酸序列。SEQ ID NO 8是表達(dá)自質(zhì)粒ρ匪18/Β4的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。SEQ ID NO 9是用于產(chǎn)生在敏捷食酸菌72W腈水解酶的第210位殘基處具有單個(gè)氨基酸取代(Thr210 —Met)的突變的腈水解酶的引物的核酸序列。SEQ ID NO 10是用于產(chǎn)生在敏捷食酸菌72W腈水解酶的第210位殘基處具有單個(gè)氨基酸取代(Thr210 —Met)的突變的腈水解酶的引物的核酸序列。
SEQ ID NO 11是突變的腈水解酶的核酸序列，所述核酸序列含有引起在敏捷食酸菌72W腈水解酶第210位殘基處單個(gè)氨基酸取代(Thr210 — Cys)的密碼子改變。SEQ ID NO 12是在敏捷食酸菌72W腈水解酶第210位殘基處含有單個(gè)氨基酸取代(Thr210 —Cys)的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。SEQ ID NO :13是突變的腈水解酶的核酸序列，所述核酸序列含有引起在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處單個(gè)氨基酸取代(Wiel68 — Lys)的密碼子改變。 SEQ ID NO 14是在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處含有單個(gè)氨基酸取代(W!el68 —Lys)的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。SEQ ID NO :15是突變的腈水解酶的核酸序列，所述核酸序列含有引起在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處單個(gè)氨基酸取代(Wie 168 — Val)的密碼子改變。SEQ ID NO 16是在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處含有單個(gè)氨基酸取代(Phel68 —Val)的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。SEQ ID NO :17是突變的腈水解酶的核酸序列，所述核酸序列含有引起在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處單個(gè)氨基酸取代(Wiel68 — Leu)的密碼子改變。SEQ ID NO 18是在敏捷食酸菌72W腈水解酶第168位殘基處含有單個(gè)氨基酸取代(W!el68 —Leu)的突變的腈水解酶的推斷的氨基酸序列。牛物保藏簡述申請人:業(yè)已按照布達(dá)佩斯條約條款的規(guī)定進(jìn)行了以下生物學(xué)保藏
保藏人識別參考_國際保藏指定編號_保藏曰
敏捷食酸菌72WATCC 557461996年3月8日
大腸桿菌 SS1001ATCC PTA-1177 2000 年 1 月 11 曰如本文使用的“ATCC”指美國典型培養(yǎng)物保藏中心，位于10801University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209U. S. Α.的國際保藏機(jī)構(gòu)?！皣H保藏名稱”是在ATCC 保藏的培養(yǎng)物的保藏號。所列出的保藏物應(yīng)當(dāng)在所指明的國際保藏機(jī)構(gòu)保藏至少三十(30)年，并且公眾在得到披露其的專利授權(quán)之后可以獲得。保藏物的可利用性并不構(gòu)成對實(shí)施本發(fā)明的許可，這種實(shí)施會破壞通過政府行為授予的專利權(quán)。
具體實(shí)施例方式提供了幾種腈水解酶，當(dāng)以高達(dá)100%轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)率將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸時(shí)，相對于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性，所述腈水解酶具有顯著改善的腈水解酶活性。還提供了使用本發(fā)明的腈水解酶用于生產(chǎn)3-羥基羧酸(3-HVA和3-HBA) 的方法。利用易錯(cuò)PCR和/或位點(diǎn)定向誘變突變敏捷食酸菌72W腈水解酶以產(chǎn)生一系列突變的腈水解酶，所述突變的腈水解酶具有改善的用于將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸的腈水解酶活性。如所附實(shí)施例所述，使用轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞(未固定化的和固定化的)，測定用于3-羥基羧酸生產(chǎn)的腈水解酶活性的改善。
具有將3-羥基腈的腈官能團(tuán)轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)羧酸能力的腈水解酶類提供了顯著的優(yōu)點(diǎn)。與化學(xué)或其他酶促方法相比，使用本發(fā)明腈水解酶的腈水解能用于由相對便宜和容易獲得的起始原料以高產(chǎn)率合成3-羧酸，具有十分少的副產(chǎn)物和污染產(chǎn)生。所要求保護(hù)的用于制備3-羥基戊酸或3-羥基丁酸的方法產(chǎn)生很少的污染或反應(yīng)副產(chǎn)物，且3-羥基羧酸易于從產(chǎn)物混合物中回收。先前已知的用于將3-羥基腈水解為 3-羥基羧酸的化學(xué)方法無法產(chǎn)生使用酶催化的腈水解所獲得的高產(chǎn)率和選擇性。非酶促腈水解反應(yīng)通常涉及在升溫下加熱腈溶液，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿存在下常常要好幾次，然而酶催化的反應(yīng)在環(huán)境溫度下于水溶液及中性PH中進(jìn)行，無需添加酸或堿。例如，業(yè)已使用氫氧化鋇來將3-氨基丙腈水解為3-丙氨酸，產(chǎn)率85-90% (Ford, J. H.，Org. Synth.，Coll. vol. Ill :34-36(1955)),以及將3-氰基丁酸水解為甲基丁二酸，產(chǎn)率72% (Brown, G. B.，Org Synth. Coll. vol. Ill :615-617(1955))；使用3-羥基戊腈重復(fù)這兩種方法的第一種，產(chǎn)生很少的或無法檢測的3-羥基戊酸(參見比較實(shí)施例)。通過本發(fā)明生產(chǎn)的3-羥基戊酸和3-羥基丁酸被用作為配料來制備聚酯(特別是多支聚酯和高支化羥基羧酸共聚單體)，以及在生物可降解的聚酯生產(chǎn)中被用作為共聚單體(US 6，562，603)。業(yè)已使用二羥甲基丙酸作為支化共聚單體和多種線型羥基羧酸和內(nèi)酯制備了幾類多支共聚多酯多元醇。這些聚合物的某些顯示了引人注意的特性。也已報(bào)道了具有相似的總成分(但具有不同的微結(jié)構(gòu))的相應(yīng)的嵌段共聚物(如Trollsas 等，Macromolecules，30 :8508(1997)禾口 Trollsas 等，J. Polym. ScL Part (A) =Polymer Chemistry 36:2793(1998)中描述的DMPA/ε -己內(nèi)酯嵌段共聚物)。當(dāng)在使用二羥甲基丙酸或三羥甲基乙酸的共聚反應(yīng)中，諸如3-羥基戊酸的3-羥基羧酸代替ε -己內(nèi)酯作為線型共聚單體時(shí)，也已報(bào)道了具有期望的、顯著增加的Tg的用于活性涂層的多支共聚多酯多元醇基質(zhì)(US 6，562，603)。更高的Tg明顯地?cái)U(kuò)大了支化共聚多酯可以使用的應(yīng)用范圍。在本說明書中使用了許多術(shù)語和縮寫。提供以下定義。飽和的“烴基”定義為任何全部由碳和氫組成的基團(tuán)，在此單鍵專門用于將碳原子連接在一起。因此，任何具有至少一個(gè)碳原子的穩(wěn)定的碳和氫原子排列包括在飽和的烴基范圍內(nèi)。術(shù)語“高支化的”、“多支的”和“樹枝狀大分子”(樹狀聚體)通?？杀幻枋鰹榫哂袠湫谓Y(jié)構(gòu)的三維的、多支的分子。樹狀聚體是高對稱的，而類似的稱為高支化或多支的大分子則可在一定程度上具有不對稱性，且還保持多支樹形結(jié)構(gòu)。樹狀聚體可以說是高支化大分子的單分散變體。高支化的、多支的和樹枝狀大分子通常由引發(fā)劑或具有一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)活性部位的核、多個(gè)周圍分支層以及任選的鏈終止分子層組成。所述層通常稱為段 (generations) 0在本文中“腈水解酶催化劑”指具有腈水解酶活性特性的酶催化劑。所述酶催化劑可以全微生物細(xì)胞、透化處理的微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞提取物的一種或多種細(xì)胞成分、 部分純化的酶或純化的酶的形式存在。術(shù)語“改良的腈水解酶”、“突變的腈水解酶”和“蛋白質(zhì)工程的腈水解酶”可交換地用于指在相同反應(yīng)條件下，對于將3-羥基腈(如3-羥基戊腈或3-羥基丁腈)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸，與敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性相比具有顯著改善的腈水解酶活性的現(xiàn)有腈水解酶。如本文使用的“相同的反應(yīng)條件” 應(yīng)指相同的和/或基本上相似的反應(yīng)條件，其中所測定的腈水解酶活性的差異歸因于現(xiàn)有腈水解酶的結(jié)構(gòu)差異，表現(xiàn)為本文所述的氨基酸取代。敏捷食酸菌72W腈水解酶如SEQ ID NO :3所示。除起始密碼子由GTG變?yōu)锳TG之外，其與野生型敏捷食酸菌72W腈水解酶相同 (導(dǎo)入以便于在大腸桿菌中表達(dá))。在本發(fā)明中，表達(dá)自P匪18的敏捷食酸菌72W腈水解酶 (SEQ ID NO 3)的編碼序列被認(rèn)為是適合的對照用于腈水解酶活性比較。在本發(fā)明中，“一單位酶活性”或“一單位活性”或“U”定義為在規(guī)定溫度下每分鐘產(chǎn)生1 μ mol規(guī)定的3-羥基羧酸產(chǎn)物所需要的酶活性量。在本發(fā)明中，例證生產(chǎn)的3-羥基羧酸是3-羥基戊酸和3-羥基丁酸。在本發(fā)明中，術(shù)語“腈水解酶活性”指每單位質(zhì)量(例如毫克)的蛋白質(zhì)、細(xì)胞干重或珠子重量的酶活性。測定的對照的腈水解酶活性與細(xì)胞干重或珠子重量成正比。由于如使用SDS-PAGE凝膠的激光光密度分析所定量的，無法區(qū)別在敏捷食酸菌72W對照(SEQ ID NO 4)和改良的突變體之間的腈水解酶表達(dá)水平，因此相對于細(xì)胞干重或珠子重量測定對照和報(bào)道的腈水解酶活性改善。如本文使用的術(shù)語“相對的腈水解酶活性”指表示為參考(對照)腈水解酶活性的多倍(或分?jǐn)?shù))的腈水解酶活性。在本發(fā)明中，相對的腈水解酶活性的“顯著改善”是在相同的反應(yīng)條件下，與對照的腈水解酶活性相比至少高1. 2倍的腈水解酶活性的改善。在另一個(gè)實(shí)施方案中中，所述改善是在相同的反應(yīng)條件下，與對照的腈水解酶活性相比至少高1. 8倍的腈水解酶活性的改善。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述改善是在相同的反應(yīng)條件下， 與對照的腈水解酶活性相比至少高5倍的腈水解酶活性的改善?！?-羥基腈”等同于“ β -羥基腈”。“3-羥基腈”包括但不限于，下列化合物3-羥基丙腈、3-羥基丁腈、3-羥基戊腈、3-羥基己腈、3-羥基庚腈、3-羥基壬腈、3-羥基-3-異丙基-4-甲基戊腈、3-羥基-3-苯基丙腈、2-丙基-3-羥基戊腈和3-羥基-3-甲基-η-戊腈。在本發(fā)明中優(yōu)選的3-羥基腈包括3-羥基戊腈和3-羥基丁腈?！?-羥基羧酸”等同于“ β -羥基羧酸”?！?-羥基羧酸”包括但不限于，下列化合物3-羥基丙酸、3-羥基丁酸、3-羥基戊酸、3-羥基己酸、3-羥基-3-異丙基-4-甲基戊酸、 3-羥基-3-苯基丙酸、2-丙基-3-羥基戊酸、3-羥基-2，2- 二甲基丙酸和3-羥基-3-甲基-η-戊酸。在本發(fā)明中生產(chǎn)的3-羥基羧酸包括3-羥基戊酸和3-羥基丁酸。所產(chǎn)生的 3-羥基羧酸可以酸或其相應(yīng)的銨鹽的形式存在?！?-羥基戊腈(34fydroxyvaleronitrile)，，也被稱為 3-羥基戊腈(3-4iydroxypentanenitrile) 和;HM?！?-羥基戊酸(3-Hydroxyvaleric acid)，，也被稱為 3_ 羥基戊酸(3_hydroxypentanoic acid)和 3-HVA?！?-羥基丁腈(3-Hydroxybutyronitrile)，，也被稱為 3_ 羥基丁腈(3-hydroxybutanenitrile) 禾口 3-HBN?！?-羥基丁酸(3-Hydroxybutyric acid)也被稱為 3_ 羥基丁酸(3-hydroxybutanoic acid)和 3-HBA。術(shù)語“宿主細(xì)胞”、“異源的宿主細(xì)胞”和“宿主生物”指能接受外源或異源基因、基因片段活DNA片段的細(xì)胞。術(shù)語“重組生物”、“轉(zhuǎn)化宿主”、“轉(zhuǎn)化體”、“轉(zhuǎn)基因生物”和“轉(zhuǎn)化的微生物宿主”指
已用異源或外源DNA轉(zhuǎn)化的宿主生物。本發(fā)明的重組生物表達(dá)編碼活性腈水解酶的外源編碼序列或基因?！稗D(zhuǎn)化”指DNA片段轉(zhuǎn)移入宿主生物中。所述轉(zhuǎn)移的DNA片段可以在染色體或染色體外摻入(即通過載體)宿主生物中的。“轉(zhuǎn)化盒”指含有一組便于準(zhǔn)備插入宿主細(xì)胞中的遺傳元件的DNA特定片段，通常作為質(zhì)粒的一部分?！氨磉_(dá)盒”指含有一組便于準(zhǔn)備插入宿主細(xì)胞中的遺傳元件的DNA特定片段，通常作為質(zhì)粒的一部分，還供在宿主中增強(qiáng)基因表達(dá)之用。術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”指通常攜帶不是宿主細(xì)胞主要新陳代謝的一部分的基因的染色體外元件，且通常以環(huán)狀雙鏈DNA分子形式存在。這樣的元件可以是來自任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀的單鏈或雙鏈DNA或 RNA，其中許多核苷酸序列業(yè)已被結(jié)合或重組入獨(dú)特的結(jié)構(gòu)中?！盎颉敝副磉_(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括位于編碼序列前面的調(diào)節(jié)序列(5'非編碼序列)和位于編碼序列后面的調(diào)節(jié)序列(3'非編碼序列)。“天然基因”指自然界中與它自身的調(diào)節(jié)序列一起出現(xiàn)的基因。“嵌合基因”指除了天然基因以外的任何基因，包括在自然狀態(tài)下不是一起出現(xiàn)的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含來自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或來自相同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，但是排列方式與天然排列方式不同?！皟?nèi)源基因”指處在天然生物的基因組中的天然位點(diǎn)上的天然基因?！巴庠椿颉敝刚Ｇ闆r下不存在于宿主生物中的基因，但是所述基因是通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物中的。外源基因可包含插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因。“轉(zhuǎn)基因”是已通過轉(zhuǎn)化操作導(dǎo)入基因組的基因。術(shù)語“核酸”指活細(xì)胞中存在的高分子量復(fù)合化合物，其基本單位是通過磷酸橋連接在一起的核苷酸。核酸分為兩種類型核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。當(dāng)在上下文的核酸中提及時(shí)，字母“A”、“G”、“T”和“C”分別指嘌呤堿基(腺嘌呤 (C5H5N5)和鳥嘌呤(C5H5N5O))以及嘧啶堿基(胸腺嘧啶(C5H6N2O2)和胞嘧啶(C4H5N3O))。術(shù)語“編碼序列，，或“編碼區(qū)”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。術(shù)語“0RF”、 “開放閱讀框”、“編碼序列”和“編碼區(qū)”可交換地用于指DNA序列的一部分，其翻譯為蛋白質(zhì)。在DNA序列翻譯為蛋白質(zhì)序列中，序列中的ORFs通常通過指示起始的三堿基對(起始密碼子)和指示終止的三堿基對(終止密碼子)來描繪。如本文使用的“分離的核酸分子”或“片段”是單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物， 任選地含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。一種以DNA聚合物形式存在的分離的核酸分子可由一個(gè)或多個(gè)cDNA、基因組DNA或合成的DNA的片斷組成。術(shù)語“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性內(nèi)切酶”指一種催化雙鏈DNA中的特定核苷酸序列水解切割的酶。術(shù)語“寡核苷酸”指要被檢測的引物、探針、寡聚物片段、標(biāo)記的復(fù)制封閉探針、以及寡聚體對照物，并且一般指多聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)以及任何是嘌呤或嘧啶堿基(核苷酸)或修飾的嘌呤或嘧啶堿基的 N-糖苷物的多核苷酸。還包括在“寡核苷酸”定義中的是核酸類似物(如肽核酸)和那些業(yè)已在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行修飾的(如硫代磷酸酯鍵)(也參見Hiuong等，Biochimie (1985) JuI-Aug 67(7-8) :673-684.)。在“核酸”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”的長度之間，沒有預(yù)期的差別。術(shù)語“引物”指一種寡核苷酸(合成的或天然存在的)，其作為核酸合成或當(dāng)置于互補(bǔ)鏈合成為聚合酶所催化的條件下時(shí)沿互補(bǔ)鏈復(fù)制的起始點(diǎn)。
“合適的調(diào)節(jié)序列”指影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工、RNA穩(wěn)定性或相關(guān)編碼序列翻譯且位于編碼序列上游(5'非編碼序列)、之中或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列?！皢幼印敝敢环N能控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。一般而言，編碼序列位于啟動子序列的3'。啟動子可以完全來自天然基因、或由來源于天然存在的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含合成的DNA片斷。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白的是不同的啟動子可在不同組織或細(xì)胞類型中、或在不同發(fā)育階段、或響應(yīng)不同的環(huán)境條件指導(dǎo)基因的表達(dá)。能使基因在大部分細(xì)胞類型中在大多數(shù)時(shí)間下或在大多數(shù)的環(huán)境條件下表達(dá)的啟動子，通常稱為“組成型啟動子”。能使基因僅在特定化合物或環(huán)境條件存在下表達(dá)的啟動子，通常稱為“誘導(dǎo)型啟動子”。由于在大多數(shù)情況下，調(diào)節(jié)序列的確切邊界還未完全確定， 因此不同長度的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。如本文使用的，術(shù)語“可操作地連接”指核酸序列在單一核酸片段上的締合，使得一個(gè)的功能受另一個(gè)影響。例如，當(dāng)啟動子能影響編碼序列表達(dá)時(shí)，其就是與編碼序列可操作地連接的(即所述編碼序列受所述啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)。編碼序列可沿有義或反義方向可操作地與調(diào)控序列連接?！?'非編碼序列”指位于編碼序列下游并包括多腺苷酸化識別序列(通常限于真核生物)和其他編碼能影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號的序列的DNA序列。多腺苷酸化信號(通常限于真核生物)通常特點(diǎn)在于影響多聚腺苷酸束添加到mRNA前體的3'末端上。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)充分意識到，在使用核苷酸密碼子以確定所給定的氨基酸中，特定宿主細(xì)胞具有“密碼子偏倚”。因此，當(dāng)合成用于改善在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的基因時(shí)，期望設(shè)計(jì)能使其密碼子使用反映優(yōu)選的宿主細(xì)胞密碼子偏倚的基因。對序列信息可獲得的來源于宿主細(xì)胞的基因的調(diào)查，可以確定其的密碼子偏倚。密碼子優(yōu)化是本領(lǐng)域眾所周知的，且業(yè)已被描述用于不同的系統(tǒng)，包括但不限于，酵母(Outchkourov等， Protein Expr Purif，24(1) :18-24(2002))和大腸桿菌(Feng 等，Biochemistry, 39 (50) 15399-15409(2000))ο術(shù)語“表達(dá)”指由編碼基因產(chǎn)物序列的基因轉(zhuǎn)錄并翻譯為所述基因產(chǎn)物，所述基因產(chǎn)物通常為蛋白質(zhì)。術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”可交換地用于指表達(dá)的基因產(chǎn)物?！懊艽a子簡并”指允許核苷酸序列改變而不影響所編碼多肽的氨基酸序列的遺傳密碼的趨異。例如，本領(lǐng)域眾所周知三聯(lián)密碼子CTT、CTC、CTA和CTG都編碼氨基酸亮氨酸。 本領(lǐng)域還眾所周知在給定位置產(chǎn)生化學(xué)等價(jià)的氨基酸(“保守改變”)，但不影響所編碼蛋白質(zhì)的功能特性的基因改變是常見的。因此，編碼氨基酸丙氨酸——一種疏水性氨基酸的密碼子，可為編碼另一種更低疏水性殘基(例如甘氨酸)或更高疏水性殘基(例如纈氨酸、 亮氨酸或異亮氨酸)的密碼子所取代，而不影響所編碼蛋白質(zhì)的功能特性。同樣地，用一個(gè)帶負(fù)電荷殘基取代另一個(gè)(例如用天冬氨酸取代谷氨酸)或用一個(gè)帶正電荷殘基取代另一個(gè)(例如用賴氨酸取代精氨酸)也可被認(rèn)為產(chǎn)生功能性等價(jià)產(chǎn)物。導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子N-末端和C-末端部分改變的核苷酸改變也不應(yīng)被認(rèn)為要改變所述蛋白質(zhì)活性。每個(gè)被提議的修飾都充分地落在本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)范圍內(nèi)，如確定所編碼產(chǎn)物的生物學(xué)活性是否保持。
敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶敏捷食酸菌72W腈水解酶(EC 3. 5. 5. 1)是一種用于由脂肪族或芳香族腈產(chǎn)生羧酸的穩(wěn)定催化劑(US 6，870，038和Chauhan等，(同上))。還已顯示能催化3-羥基腈轉(zhuǎn)化為 3-羥基羧酸(US 6，562，603)。所有已知的腈水解酶，包括敏捷食酸菌72W腈水解酶，在酶活性中心中都具有親核的半胱氨酸(Cowan等，Extremophiles，2 :207-216(1998) ；Pace,H.和Brenner，C，Genome Biology, 2(1) reviews 1-9(2001)；和 Chauhan 等，同上)且都易受硫醇試劑(l.OmM 濃度的氯化銅、硝酸銀、乙酸汞或氯化鐵，每一種都引起敏捷食酸菌72W腈水解酶酶活性大幅減少)影響而失活。半胱氨酸殘基也能被不可逆地氧化為亞磺酸，導(dǎo)致酶活性損失。盡管腈水解酶對多種失活機(jī)制敏感，但是固定化的敏捷食酸菌72W細(xì)胞是穩(wěn)定的，在多次重復(fù)利用反應(yīng)后能保持其大部分腈水解酶活性(US 6，870，038)。業(yè)已報(bào)道了敏捷食酸菌72W腈水解酶和其他細(xì)菌腈水解酶的序列比較(Chauhan 等，同上)。該72W腈水解酶具有幾個(gè)保守的特征結(jié)構(gòu)域，包括鄰近氨基末端的16-氨基酸區(qū)(SEQ ID NO :4的氨基酸殘基40-55)和含有必需的半胱氨酸殘基的催化區(qū)(SEQ ID NO 4的氨基酸殘基160-173)。該半胱氨酸殘基(SEQ ID NO 4的Cysl64)，連同保守的谷氨酸 (SEQ ID N0:4的Glu48)以及賴氨酸殘基(SEQ ID NO :4的Lysl30)，形成在所有腈水解酶中都存在的催化三聯(lián)基序(Pace，H.，和Brerme^C，同上)。盡管在報(bào)道的腈水解酶中存在某些結(jié)構(gòu)上類似的保守，但是這些酶的底物特異性變化很大(0' Reilly, C.和TUrner，P.， J Appl Microbiol,95 :1161-1174(2003)) 酶特性在指定條件下，測試具有改善的相對腈水解酶活性的突變的72W腈水解酶，所述腈水解酶活性能將3-羥基戊腈轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸或?qū)?-羥基丁腈轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酸。 使用測量3-HVN至3-HVA轉(zhuǎn)化的篩選方法來選擇那些具有改善的腈水解酶活性的腈水解酶突變體。通過與對照(敏捷食酸72W (ATCC 55746)腈水解酶)的腈水解酶活性比較測定腈水解酶活性的改善。通過將所測得的活性單位(U)除以催化劑重量計(jì)算腈水解酶活性。可根據(jù)純化的蛋白質(zhì)重量、細(xì)胞濕量、細(xì)胞干重或固定化的催化劑(GA/PEI-交聯(lián)的催化劑/ 藻酸鹽珠子)的重量測定催化劑重量。在本發(fā)明中，腈水解酶活性記錄為每克細(xì)胞干重的活性單位(U/g DCff)或每克催化劑珠子(固定化的催化劑對照)的活性單位?；诩?xì)胞干重作為單位催化劑重量的腈水解酶活性對照，應(yīng)當(dāng)考慮腈水解酶蛋白質(zhì)產(chǎn)生水平。測定不同轉(zhuǎn)化體和對照之間的表達(dá)水平，并觀察到是基本上相同的。因此。對于不同的突變體而言，所報(bào)道的腈水解酶活性的改善歸因于酶結(jié)構(gòu)上的修飾。在相同的載體(pTrcHiS2-T0P0)和宿主(大腸桿T0P10)或大腸桿菌FM5背景中表達(dá)本發(fā)明突變的腈水解酶(以及敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶對照；SEQ ID NO 4)的編碼序列。SDS-PAGE分析(如使用激光光密度分析法定量)證明了在每種突變體(和對照)中腈水解酶蛋白質(zhì)表達(dá)水平是基本上相同的(如由于使用相同的表達(dá)系統(tǒng)和宿主所預(yù)期的)。相對酶活性被記錄為對不同突變的催化劑所測定的腈水解酶活性對于在表達(dá)敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO 4)的大腸桿菌對照轉(zhuǎn)化株中所測定的腈水解酶活性的倍數(shù)增加。
對于未固定化的催化劑，通過測定每克細(xì)胞干重的0.5M的3-羥基腈溶液在 250C (pH 7.0)下轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸的轉(zhuǎn)化率，確定突變的腈水解酶的腈水解酶活性(U/g 細(xì)胞干重)。對于固定化的催化劑對照，通過在35°C (pH 7. 0)下測定0. 4M的3-HVN溶液轉(zhuǎn)化為3-HVA的轉(zhuǎn)化率確定具體的活性，并記錄為每克珠子的腈水解酶活性單位(U/g珠子)。 一單位的腈水解酶活性(U)相當(dāng)于在25°C (或35°C下，對于固定化的催化劑)下1微摩爾 3-羥基羧酸/分鐘的產(chǎn)生。在本發(fā)明中，在3-羥基戊酸或3-羥基丁酸產(chǎn)生的基礎(chǔ)上記錄腈水解酶活性單位。對于特定的突變的腈水解酶，使用下列格式之一，關(guān)于敏捷食酸菌72W氨基酸序列(SEQ ID NO :4)DNA編碼區(qū)中的點(diǎn)取代突變以及所得到的氨基酸改變得到詳細(xì)說明1.擴(kuò)展格式提供了 SEQ ID NO 4中野生型氨基酸(使用標(biāo)準(zhǔn)的3_字母縮寫) 和相應(yīng)的氨基酸殘基位置，之后是在相同的殘基位置處見于突變體中的新氨基酸，例如。 “Thr210改變?yōu)锳la”或“Thr210 — Ala”描述了一種在SEQ ID NO :4中氨基酸殘基第210 位處作為突變的結(jié)果——蘇氨酸被該改變?yōu)楸彼岬耐蛔儭?.簡寫形式野生型氨基酸(表示為標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫)之后是SEQ ID NO 4的氨基酸殘基位置，再后是突變的氨基酸(也表示為標(biāo)準(zhǔn)的單字母縮寫)。例如，“T210A”描述了一種在SEQ ID NO :4中氨基酸殘基第210位處作為突變的結(jié)果——蘇氨酸被該改變?yōu)楸彼岬耐蛔儭?-羥基腈水解為3-羥基羧酸:通過將3-羥基腈(例如3-羥基戊腈或3-羥基丁腈)與酶催化劑的水懸浮液混合進(jìn)行水解反應(yīng)。完整的重組微生物細(xì)胞(表達(dá)本發(fā)明突變的腈水解酶)可用作為酶催化劑，無需任何預(yù)處理?；蛘?，所述微生物細(xì)胞可固定在聚合物基質(zhì)(如藻酸鹽珠子或聚丙烯酰胺凝膠(PAG)顆粒)中或固定在不溶性載體(如硅藻土)上以便于所述酶催化劑的回收和再使用。純化的或部分純化的酶還可分離自所述全細(xì)胞，并且可被直接用作為催化劑，或者所述酶可固定在聚合物基質(zhì)中或固定在不溶性載體上。先前已報(bào)道了敏捷食酸菌72W腈水解酶的固定化(US 6，870，038)。業(yè)已廣泛地報(bào)道了用于細(xì)胞或分離的酶固定化的方法， 并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知(Methods in Biotechnology,Vol. 1 Jmmobilization of Enzymes and Cells ；Gordon F. Bickerstaff,編輯；Humana Press,Totowa,NJ,USA ；1997)。反應(yīng)混合物水溶液中酶催化劑的濃度取決于所述酶催化劑特定的催化活性，并被選擇以獲得所期望的反應(yīng)速率。在水解反應(yīng)中用作為催化劑的微生物細(xì)胞的細(xì)胞濕重通常在每毫升總反應(yīng)體積0. OOlg-O. 250g濕細(xì)胞之間，優(yōu)選為每毫升0. 002g-0. 050g濕細(xì)胞。選擇水解反應(yīng)溫度以優(yōu)化反應(yīng)速率和酶催化劑活性的穩(wěn)定性。反應(yīng)溫度可在僅高于反應(yīng)混合物凝固點(diǎn)(大約0°C)到65°C的范圍內(nèi)，優(yōu)選的反應(yīng)溫度在5°c-35°c。微生物細(xì)胞催化劑懸浮液可通過將細(xì)胞懸于蒸餾水中，或懸于保持5. 0-10. 0優(yōu)選6. 0-9. 0的反應(yīng)初始PH的緩沖水溶液中得到制備。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，由于來自相應(yīng)的腈官能團(tuán)的羧酸銨鹽的形成，可改變反應(yīng)混合物的PH。反應(yīng)可進(jìn)行直至將3-羥基戊腈或3-羥基丁腈完全轉(zhuǎn)化，不需要控制PH，或在整個(gè)反應(yīng)過程中可添加適合的酸或堿以維持所需的pH。在25°C下，發(fā)現(xiàn)3-羥基戊腈和3-羥基丁腈可以任何比例與水完全混溶。在選擇使得3-羥基腈的溶解性也取決于溶液溫度和/或水相中鹽濃度(緩沖液或產(chǎn)物3-羥基羧酸銨鹽)的反應(yīng)條件的情況下，反應(yīng)混合物可最初由兩相組成含有酶催化劑和溶解的3-羥基腈的水相以及有機(jī)相(不溶解的3-羥基腈)。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，3-羥基腈溶解在水相中，最后獲得單一相的產(chǎn)物混合物。反應(yīng)還可通過以大約等于酶促水解反應(yīng)速率的速率將3-羥基腈添加到反應(yīng)混合物中得以進(jìn)行，由此維持了單一相反應(yīng)混合物水溶液，并避免了潛在的在高原料濃度下酶底物抑制的問題。從產(chǎn)物混合物中分離3-羥基羧酸3-羥基戊酸或3-羥基丁酸可作為質(zhì)子化羧酸及其相應(yīng)的銨鹽的混合物(取決于所述產(chǎn)物混合物的PH)存在于產(chǎn)物混合物中，亦可作為羧酸鹽與任何可額外地存在于產(chǎn)物混合物中的緩沖液額外地存在。視所需，3-羥基羧酸產(chǎn)物可作為質(zhì)子化羧酸或作為羧酸鹽分離自反應(yīng)混合物。在3-羥基腈完全轉(zhuǎn)化下，產(chǎn)物混合物中3-羥基羧酸的終濃度可在0. 00IM至3-羥基羧酸產(chǎn)物溶解度極限的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，3-羥基戊酸的濃度應(yīng)在0. 10M-2. OM范圍內(nèi)。 通過使用濃鹽酸將反應(yīng)混合物的PH調(diào)節(jié)到1. 0-2. 5之間、用氯化鈉飽和所得到的溶液、并用諸如甲基叔丁醚、乙醚或二氯甲烷的適合的有機(jī)溶劑萃取3-羥基戊酸，可從反應(yīng)混合物 (在除去催化劑后)中分離3-羥基戊酸。然后將所混合的有機(jī)萃取物與合適的干燥劑(如硫酸鎂)一起混合、攪拌，過濾，并除去溶劑(如通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))，以高產(chǎn)率和高純度(通常為98-99%純的)產(chǎn)生所期望的產(chǎn)物。如果需要，所述產(chǎn)物可通過重結(jié)晶或蒸餾來進(jìn)一步純化。使用類似于那些上述用于3-羥基戊腈的方法(參見隨后的實(shí)施例)將3-羥基丁腈酶促水解為3-羥基丁酸，在高達(dá)100%的3-羥基丁腈轉(zhuǎn)化下，以100%產(chǎn)率產(chǎn)生3-羥基丁酸。使用3-羥基羧酸的聚合物合成先前業(yè)已報(bào)道了使用線型3-羥基羧酸或其酯合成多支共聚多酯(US 6，562，603)，其中至少兩個(gè)重復(fù)單位來源于至少一個(gè)結(jié)構(gòu)為R1O-CR4R5CR6R7C(O)OR1的線型 3-羥基羧酸或其酯，以及至少一個(gè)結(jié)構(gòu)為(R2O)n-R-[C (0)01^1的高支化羥基羧酸或其酯， 其中R是CV12烴基或具有n+m自由價(jià)的部分或完全取代的羥基，在此某些或所有的氫原子可被碳原子取代，R1是H、C1^12或羥基取代的CV12烴基，R3、R4、R5、R6、R7是H或C1^12烴基，R2 是H或(0) CR3, n+m是3或更多，且條件是η和m之一是1，這些重復(fù)單位還可來源于可形成聚酯的等價(jià)化合物，例如羥基羧酸酯。化合物(R2O)n-R_[C(O)OR1]m，由于具有三個(gè)或更多的官能團(tuán)，有時(shí)被稱為高支化單體。超過一個(gè)這樣的單體可以這樣聚合的形式存在。優(yōu)選 n+m是3或4。本領(lǐng)域眾所周知的常用酯化催化劑(例如，質(zhì)子酸、路易斯酸或堿性催化劑包括磺酸，磷酸或膦酸，醇鈦，二烷基錫氧化物，錫、鋅、錳、鈣、鎂或銻的氧化物、碳酸鹽和羧酸鹽)可與這些單體一起使用來形成聚酯。用于制備聚酯的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。3-羥基羧酸的分析適合于分析3-羥基羧酸產(chǎn)生的分析方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括但不限于 HPLC、CE、GC和MS。例如，HPLC分析被用于測定3-羥基戊酸產(chǎn)生的量，其使用了折光率檢測器和Supelco LC-18-DB柱(15cmx4. 6mm直徑)，用溶于IOmM乙酸/IOmM乙酸鈉水溶液中的 7. 5% (ν/ν)甲醇作為流動相(對于3-羥基戊腈反應(yīng))，或Bio-Rad ΗΡΧ-87Η柱(30cmx7. 8mm 直徑)和在50°C下0.001N硫酸作為流動相(對于3-羥基丁腈反應(yīng))。微生物表達(dá)
本發(fā)明的腈水解酶突變體可在異源宿主細(xì)胞中生產(chǎn)，優(yōu)選在微生物宿主中生產(chǎn)。在本發(fā)明中特別有用的是容易適用于大規(guī)模發(fā)酵方法的細(xì)胞。這樣的生物體是工業(yè)牛物工藝領(lǐng)域眾所周知的，其的例子可見于Recombinant Microbes for Industrial and ARricultural Applications, Murooka 等，編輯，Marcel Dekker, Inc. , New York, NY(1994)，并包括發(fā)酵細(xì)菌以及酵母和絲狀真菌。宿主細(xì)胞可包括但不限于叢毛單胞菌 (Comamonas sp.)、棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)、短桿菌(Brevibacterium sp·)、紅球菌、固氮菌(Azotobacter sp.)、梓檬酸桿菌(Citrobacter sp.)、腸桿菌(Enterobacter sp.)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium sp.)、克雷白氏桿菌(Klebsiella sp.)、沙門氏菌 (Salmonella sp.)、乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)、曲霄(Aspergillus sp·)、糖酵母 (Saccharomyces sp.)、接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)、畢赤氏酵母(Pichia sp.)、 克魯維氏酵母(Kluyveromyces sp.)、假絲酵母(Candida sp.)、漢森氏酵母(Hansenula sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、德巴利氏酵母(Debaryomyces sp.)、毛霉(Mucor sp.)、球擬酵母(Torulopsis sp.)、甲基桿菌(Methylobacteria sp·)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、 埃希氏桿菌(Escherichia sp. )、/[段單胞菌(Pseudomonas sp. )、f艮瘤菌(Rhizobium sp.) 和鏈霉菌(Sti^ptomyces sp.)。特別優(yōu)選的是大腸桿菌。其中突變的腈水解酶基因可被表達(dá)的適合的大腸桿菌宿主細(xì)胞的例子包括，但不限于在此列舉的宿主細(xì)胞和MG1655(ATCC 47076)、FM5(ATCC 53911)、W3110(ATCC 27325)、MC4100(ATCC 35695)、W1485(ATCC 12435) 及其衍生物。先前已報(bào)道了敏捷食酸菌72W腈水解酶的異源表達(dá)(Chauhan等，同上和US 6，870，038) Xhauhan等報(bào)道了一種表達(dá)活性敏捷食酸菌72W腈水解酶的大腸桿菌菌株(大腸桿菌SSlOOl (ATCC PTA-1177))0與野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO 3)相比，該重組表達(dá)的(大腸桿菌SS1001)腈水解酶的編碼序列含有兩個(gè)微小的序列改變。起始密碼子由GTG改變?yōu)锳TG以利于重組表達(dá)，且在克隆過程中導(dǎo)入引起鄰近C-末端的單個(gè)氨基酸改變的人工產(chǎn)物(Pro367[CCA] — kr[TCA])。本發(fā)明突變的腈水解酶，如SEQ ID NOs :5、7、11、13、15和17提供的編碼序列所示，在重組宿主(大腸桿菌)中表達(dá)。在工業(yè)上合適的宿主中進(jìn)行重組表達(dá)具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。 首先，與由大多數(shù)獲得目的基因的微生物得到的遺傳工具相比，對于大多數(shù)常用的生產(chǎn)宿主，其遺傳工具箱通常得到充分開發(fā)。與在天然宿主中表達(dá)相比，在這些宿主中重組表達(dá)一般更具成本效率。例如，業(yè)已顯示當(dāng)通過發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，敏捷食酸菌72W細(xì)胞得在甘油——一種相當(dāng)昂貴的碳底物上生長，而使用便宜的葡萄糖卻無法成功地生長。與此相反，與敏捷食酸菌72W細(xì)胞相比，在約一半時(shí)間內(nèi)，大腸桿菌轉(zhuǎn)化體就可在葡萄糖上生長至相同的細(xì)胞密度，顯著地降低了生物催化劑生產(chǎn)成本(US 6，870，038)。含有指導(dǎo)高水平外源蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。這些可用于構(gòu)建用來生產(chǎn)本發(fā)明突變的腈水解酶的基因產(chǎn)物的嵌合基因。然后，通過轉(zhuǎn)化可將這些嵌合基因?qū)脒m當(dāng)?shù)奈⑸镏?，以提供高水平的突變的腈水解酶表達(dá)。本發(fā)明的核苷酸被用來產(chǎn)生具有相對于天然的敏捷食酸菌72W腈水解酶 (P匪18對照；SEQ ID NO 4)增加的或改變的活性水平的基因產(chǎn)物。此外，在改變宿主細(xì)胞特性上嵌合基因應(yīng)當(dāng)是有效的。例如，在適當(dāng)?shù)膯幼涌刂葡拢瑢⒅辽僖粋€(gè)編碼本發(fā)明的腈水解酶的嵌合基因拷貝導(dǎo)入宿主細(xì)胞，賦予了該宿主細(xì)胞改善的將3-羥基戊腈或3-羥基丁腈分別轉(zhuǎn)化為3-羥基戊酸或3-羥基丁酸的能力。本發(fā)明的嵌合基因應(yīng)包含適合的用于驅(qū)動本發(fā)明突變的腈水解酶序列基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列可包括，但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。如果這些序列來源于宿主生物體，則是優(yōu)選的；但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到也可以使用異源調(diào)節(jié)序列。通過將嵌合基因克隆入適合的表達(dá)載體中，其可被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦?。可用于適合的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體或表達(dá)盒是本領(lǐng)域眾所周知的。一般而言，所述載體或表達(dá)盒含有指導(dǎo)有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、可選擇的標(biāo)記以及容許自主復(fù)制或染色體整合的序列。適合的載體包含具有轉(zhuǎn)錄起始控制的編碼序列的5'區(qū)和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段的 3'區(qū)。盡管這樣的控制區(qū)無需來源于選擇作為生產(chǎn)宿主的特定物種自身的基因，當(dāng)這兩個(gè)控制區(qū)都來源于與宿主細(xì)胞同源的基因時(shí)，則是最優(yōu)選。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)序列應(yīng)包括啟動子。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型的。誘導(dǎo)型啟動子一般響應(yīng)于特定的刺激(如IPTG誘導(dǎo)的Iac啟動子)。誘導(dǎo)型啟動子可以響應(yīng)于多種刺激，包括化學(xué)藥品、生長周期、溫度改變、PH改變和摩爾滲透壓濃度改變，僅舉了幾個(gè)例子。用于在期望的宿主細(xì)胞中驅(qū)動本發(fā)明突變的腈水解酶表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動子為數(shù)眾多，且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉，包括但不限于CYC1、HIS3、GALU GALlO, ADHU PGK、PH05、GAPDH、ADCl、TRPl、URA3、LEU2、ENO、TPI (用于在糖酵母屬中表達(dá))；AOXl (用于在畢赤氏酵母中表達(dá))；和lac、trp、lPL、lPK、T7、tac、Pbad, npr和trc (用于在大腸桿菌中表達(dá))。例子包括至少一種選自大腸桿菌的色氨酸操縱子啟動子Ptrp、大腸桿菌的乳糖操縱子啟動子Plac、大腸桿菌的Ptac啟動子、λ噬菌體右翼啟動子冊、λ噬菌體左翼啟動子PL、T7啟動子和來自甲醇酵母(Pichia pastoris)的GAP基因的啟動子的啟動子，或是至少一種強(qiáng)啟動子，選自由從毛單胞菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬、固氮菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷白氏桿菌屬、沙門氏菌屬、乳酸桿菌屬、曲霉屬、糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、接合酵母屬、克魯維氏酵母屬、假絲酵母屬、漢森氏酵母屬、杜氏藻屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、Methylobacteria、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和鏈霉菌屬組成的微生物。終止控制區(qū)還可來源于不同的優(yōu)選宿主自身的基因。任選地，終止位點(diǎn)可以是不需要的；但是，如果包括的話，則是最優(yōu)選的。此外，所插入的遺傳物質(zhì)可包括核糖體結(jié)合位點(diǎn)。所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)可來自 λ噬菌體CII基因或選自從毛單胞菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬、固氮菌屬、檸檬酸細(xì)菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬、克雷白氏桿菌屬、沙門氏菌屬、乳酸桿菌屬、曲霉屬、糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、接合酵母屬、克魯維氏酵母屬、假絲酵母屬、漢森氏酵母屬、杜氏藻屬、德巴利酵母屬、毛霉屬、球擬酵母屬、Methylobacteria、芽孢桿菌屬、埃希氏桿菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬和鏈霉菌屬基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。任選地，本發(fā)明的基因產(chǎn)物可優(yōu)選地為轉(zhuǎn)化的宿主的分泌產(chǎn)物。期望蛋白質(zhì)分泌到生長培養(yǎng)基中簡化了純化程序并降低了費(fèi)用。分泌信號序列通常用于促進(jìn)可表達(dá)的蛋白質(zhì)主動轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜?？赏ㄟ^將編碼分泌信號的DNA序列摻入宿主中產(chǎn)生能分泌的轉(zhuǎn)化的宿主。用于選擇適當(dāng)?shù)男盘栃蛄械姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域眾所周知的(參見例如ΕΡΜ6049 ；WO 9324631)。所述分泌信號DNA可位于表達(dá)控制DNA和本發(fā)明的編碼序列或編碼序列片段之間，以及位于帶有后者的閱讀框中。蛋白質(zhì)工稈通過誘變生產(chǎn)本發(fā)明突變的腈水解酶。預(yù)期本發(fā)明的核苷酸可用于生產(chǎn)具有進(jìn)一步增強(qiáng)的或改變的活性的基因產(chǎn)物。用于突變天然基因序列以產(chǎn)生具有改變的或增強(qiáng)的活性的基因產(chǎn)物的多種方法是公知的，包括但不限于1)隨機(jī)誘變，2)結(jié)構(gòu)域交換(使用鋅指結(jié)構(gòu)域或限制性內(nèi)切酶)，3)易錯(cuò) PCR(Melnikov 等，Nucleic Acids Research, 27 (4) 1056-1062(1999)) ；4)位點(diǎn)定向誘變(Coombs 等，Proteins (1998), pp259_311，l plate. Angeletti，Ruth Hogue，Ed. ,Academic San Diego,CA)；和 5) “基因改組”(US 5, 605, 793 ； US 5，811，238 ；US 5，830，721 ；和 US5, 837，458，在此并入作為參考)。通過錯(cuò)誤摻入核苷酸，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可用于擴(kuò)增帶有伴隨多個(gè)突變產(chǎn)生的DNA片段。這可通過改變PCR條件例如改變dNIPs比率或在反應(yīng)中添加不同數(shù)量的氯化錳而得以實(shí)現(xiàn)(Fromant 等，Anal Biochem, 224 (1) :347-53(1995) ；Lin-Goerke 等， Biotechniques, 23 (3) :409-12 (1997))。然后，可克隆突變的DNA片段庫以產(chǎn)生突變質(zhì)粒文庫，在諸如大腸桿菌的宿主中表達(dá)后，接著可對所述文庫進(jìn)行篩選。由于基因改組的方法容易實(shí)施且誘變率高并易于篩選，因此其是特別具有吸引力的?；蚋慕M的方法包括在具有與目的基因相似性和/或差異的額外幾群DNA區(qū)存在下， 用限制性內(nèi)切核酸酶將目的基因切割為特定大小的片段。然后，該片段庫應(yīng)變性并重退火以產(chǎn)生突變的基因。接著，篩選改變活性的所述突變的基因?？赏ㄟ^該方法突變本發(fā)明的微生物序列，并篩選改變或增強(qiáng)的活性。該序列應(yīng)當(dāng)是雙鏈的且可以具有從50bp到IOkB不同的長度。使用本領(lǐng)域眾所周知的限制性內(nèi)切核酸酶，該序列可以被隨機(jī)消化為約IObp到IOOObp的片段(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，Ε. F.和 Maniatis, Τ.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,M 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory : Co Id Spring Harbor, NY (1989)；在下文中 “Maniatis”)。除本發(fā)明的微生物序列之外，可以添加與微生物序列全部或部分能雜交的片段群。同樣地，也可以添加不能與本發(fā)明序列雜交的片段群。一般來說，與總的核酸相比，這些附加的片段群以約10-20倍過量添加。一般地，如果執(zhí)行該方法，則混合物中不同的特定核酸片段的數(shù)目會在約100至約 1000。對混合的隨機(jī)核酸片段群變性以形成單鏈酸片段，然后重退火。只有那些具有與其他單鏈核酸片段同源的區(qū)域的單鏈核酸片段會重退火。可通過加熱變性隨機(jī)核酸片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定完全變性雙鏈核酸所必需的條件。優(yōu)選溫度為約80°C-10(TC?？赏ㄟ^冷區(qū)重退火核酸片段。優(yōu)選溫度為約20°C-75°C?？赏ㄟ^添加聚乙二醇(“PEG”)或鹽加速復(fù)性。適合的鹽濃度可在0mM-200mM。然后在核酸聚合酶和dNIPs (即dATP、dCTP、dGTP 和dTTP)存在下溫育退火的核酸片段。所述核酸聚合酶可以是Klenow片段、Taq聚合酶或任何其他本領(lǐng)域公知的DNA聚合酶?？稍谕嘶鹣惹?、退火同時(shí)或退火后，添加所述聚合酶到隨機(jī)核酸片段。在聚合酶存在下，變性、復(fù)性和溫育循環(huán)重復(fù)期望的次數(shù)。優(yōu)選所述循環(huán)重復(fù)約2-50次，更優(yōu)選所述次序重復(fù)10-40次。所得到的核酸是一種約50bp至約IOOkB的較大的雙鏈多核苷酸，且通過標(biāo)準(zhǔn)的克隆和表達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對于表達(dá)和改變的活性可進(jìn)行篩選(Maniatis，同上)。此外，可通過使用基因改組(外顯子改組)方法融合功能域裝配雜合蛋白質(zhì) (Nixon等，PNAS，94 1069-1073 (1997))。本發(fā)明基因的功能域可與其他基因的功能域相結(jié)合以產(chǎn)生具有期望催化功能的新酶。可使用PCR重疊延伸方法構(gòu)建雜合酶并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)將其克隆入不同的表達(dá)載體中。3-羥基羧酸的工業(yè)牛產(chǎn)在期望使用本發(fā)明突變的腈水解酶基因商業(yè)性生產(chǎn)3-羥基羧酸之處，多種培養(yǎng)方法可應(yīng)用于生產(chǎn)腈水解酶催化劑。發(fā)酵，其可以分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)的模式進(jìn)行， 為本領(lǐng)域所常見禾口眾所周知的(Thomas D. Brock in Biotechnology :A Textbook of Industrial MicrobioloRY,第 2 版(1989)Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, (1989) ；Deshpande，Mukund V. , Appl.Biochem. Biotechnol. 36(3) :227-234(1992))。典型的分批培養(yǎng)方法是一種封閉系統(tǒng)，在其中培養(yǎng)基組合物在培養(yǎng)開始時(shí)就設(shè)定好的，在培養(yǎng)過程中不進(jìn)行人工改變。因此，在培養(yǎng)過程開始時(shí)，就將期望的生物體接種培養(yǎng)基，并且在不添加任何物質(zhì)到該系統(tǒng)中的情況下，讓其生長或進(jìn)行代謝活動。但是，一般來說，“分批”培養(yǎng)是針對碳源的添加而言的分批，并且通常試圖控制諸如PH和氧濃度的因素。在分批系統(tǒng)中，該系統(tǒng)的代謝物和生物量組成穩(wěn)定地改變著，直到培養(yǎng)結(jié)束。在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞通過靜止停滯期到高速生長對數(shù)期并最終到達(dá)穩(wěn)定期，其中，在穩(wěn)定期生長速度降低或停止。如果不進(jìn)行處理。處在靜止期的細(xì)胞最終會死亡。對數(shù)期的細(xì)胞通常決定最終產(chǎn)物或在某些系統(tǒng)中的中間產(chǎn)物的產(chǎn)量。靜止期或指數(shù)期后生產(chǎn)可以在其他系統(tǒng)中獲得。標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的變化形式是補(bǔ)料分批系統(tǒng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法同樣適用于本發(fā)明，并且包括典型的分批系統(tǒng)，所不同的是，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，以增量形式添加底物。當(dāng)代謝物抑制傾向于抑制細(xì)胞的代謝以及當(dāng)培養(yǎng)基中需要具有有限量的底物時(shí)，可以使用補(bǔ)料分批系統(tǒng)。要測定補(bǔ)料分批系統(tǒng)的實(shí)際底物濃度是困難的，因此，根據(jù)可測定因素，如PH，溶解氧，以及諸如(X)2的廢氣的分壓的變化進(jìn)行估算。分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法是常用的并且為本領(lǐng)域眾所周知，其例子可見于Brock (同上)和Deshpande (同上)。腈水解酶催化劑的商業(yè)性生產(chǎn)還可以通過連續(xù)培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)。連續(xù)培養(yǎng)是一種開放系統(tǒng)，其中，將規(guī)定的培養(yǎng)基連續(xù)地添加到生物反應(yīng)器中，并且同時(shí)將等量的條件培養(yǎng)基取出進(jìn)行加工。連續(xù)培養(yǎng)通常將細(xì)胞保持在恒定的高液相密度下，其中，細(xì)胞主要是在對數(shù)期生長?；蛘撸捎霉潭ɑ募?xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，其中連續(xù)添加碳和養(yǎng)分以及不斷地從細(xì)胞團(tuán)塊中將有價(jià)值的產(chǎn)物、副產(chǎn)物或廢棄產(chǎn)物取出?？墒褂枚喾N由天然和/或合成材料組成的載體進(jìn)行細(xì)胞固定化。連續(xù)或半連續(xù)培養(yǎng)可以調(diào)節(jié)能夠影響細(xì)胞生長或最終產(chǎn)物濃度的一種因素或任意數(shù)目的因素。例如，一種方法能保持限制養(yǎng)分，如讓碳源或氮含量處在固定比例上，并且允許所有其他參數(shù)處在適當(dāng)水平上。在其他系統(tǒng)中，可以連續(xù)地改變影響生長的多種因素， 同時(shí)保持通過培養(yǎng)基濁度測量的細(xì)胞濃度恒定。連續(xù)系統(tǒng)試圖保持穩(wěn)態(tài)生長條件，因此，通過取出培養(yǎng)基所導(dǎo)致的細(xì)胞減少，必須與培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長速度平衡。調(diào)節(jié)連續(xù)培養(yǎng)方法的養(yǎng)分和生長因子的方法，以及用于使產(chǎn)物形成速度最大化的方法在工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域中是眾所周知的，并且由Brock(同上)詳細(xì)披露了多種方法。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有適合的碳底物。適合的碳底物可以包括，但不限于諸如葡萄糖和果糖的單糖、諸如乳糖或蔗糖的二糖、諸如淀粉或纖維素或其混合物的多糖、 以及來自諸如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖漿和大麥芽的可再生原料的未純化的混合物。因此，預(yù)計(jì)用于本發(fā)明的碳源可包括多種含碳底物，并且僅受受限于所選擇的生物體。實(shí)施例適用于細(xì)菌培養(yǎng)物保持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。適用于下列實(shí)施例的技術(shù)可見于Manual of Methods for General BacterioloRY ;Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg 禾口 G. Briggs Phillips，編輯；American Society for Microbiology :ffashington,DC, (1994) 或Brock (同上)。PCR擴(kuò)增、通過核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶產(chǎn)生期望的末端用于DNA克隆的DNA 修飾、連接和細(xì)菌轉(zhuǎn)化需要的操作是本領(lǐng)域眾所周知的。在此使用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且由Maniatis (同上)和T. J. Silhavy等(in Experiments with Gene Fusions, (1984)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring,NY)；以及Ausubel 等(in Current Protocols in Molecular Biology (1994—1998) John Wiley&Sons, Inc. , New York)所描述。除非另作說明，所有用于細(xì)菌細(xì)胞生長和保持的試劑和原料都獲得自 Aldrich Chemicals(Milwaukee, WI) 、 DIFCO Laboratories (Detroit, MI) 、 GIBCO/ BRL(Gaithersburg, MD) Sigma Chemical Company (St. Louis， M0) 。 1^ ^^^ 鋁存在下將氰化氫與1，2-環(huán)氧丁烷反應(yīng)(FR 1446127)，以通過在二正丁基硼烷基三氟甲基磺酸鹽(di-n-butylboryl triflate)存在下乙腈與丙醛的反應(yīng)制備了 3-羥基戊腈 (Hamana等，Chem. Lett. 1401-1404(1982))。業(yè)已通過脂肪酶催化的2-氰基-1-甲基乙酸乙酯水解制備了旋光性的3-羥基戊腈(Itoh等，J. Org. Chem. 62 :9165-9172 (1997))。說明書中相應(yīng)于測量單位、技術(shù)、特性或化合物的縮寫如下“s”表示秒，“min”表示分鐘，“h”表示小時(shí)，“d”表示天，“ μ L”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mM”表示毫摩爾，“M”表示摩爾，“mmol”毫摩爾，“amp”表示氨芐青霉素，"kb"表示千堿基，“kd” 表示千道爾頓，“nm”表示納摩，和“wt “表示重量，“0RF”表示開放閱讀框，“PCR”表示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，“SSC”表示檸檬酸鈉鹽水緩沖液，“HPLC”表示高效液相色譜，“ca”表示大約， “rxn”表示反應(yīng)，“dcW”表示細(xì)胞干重，“0D”表示在指定波長下的光密度，“AU”表示吸光度單位，“rpm”表示每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，“slpm”表示每分鐘標(biāo)準(zhǔn)升數(shù)，“U”表示單位，“ IU”表示國際單位，以及“ IPTG”表示異丙基β -D-硫代半乳糖苷。實(shí)施例1ii丄寸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)構(gòu)津敏M IWf 72ff B青7k解秀變根據(jù)廠商使用說明，使用Puregene DNA分離試劑盒(Gentra Systems, MinneapoIis,MN)由敏捷食酸 72W(ATCC 55746)制備基因組DNA。根據(jù) GeneMorph PCR誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla, CA)提供的使用說明，對敏捷食酸菌72W腈水解酶基因(編碼序列；SEQ ID NO :；3)進(jìn)行易錯(cuò)PCR，使用標(biāo)識為 SEQ ID NO :1(5' -GCGCATATGGTTTCGTATA ACAGCAAGTTCC-3‘)和SEQ ID NO :2(5' -ATAGGATCCTTATGGCTACTTTGCTGGGACCG-3‘)的引物。使用的推薦產(chǎn)生低突變頻率(0-3次突變/1Λ)和中等突變頻率(3-7次突變/1Λ)的反應(yīng)條件。根據(jù)pTrcHis2 Τ0Ρ0 TA表達(dá)試劑盒anvitrogen，Carlskid，CA)提供的使用說明， 將10%的l.lkb PCR產(chǎn)物連接入表達(dá)載體pTrcHis2 Τ0Ρ0中。根據(jù)供應(yīng)廠商(Invitrogen) 的推薦，將一半的連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T0P10中。將1 %的轉(zhuǎn)化混合物涂布(plated)在補(bǔ)充有50mg/L氨芐青霉素的LB平板上。所得到的轉(zhuǎn)化體共計(jì)200-400個(gè)克隆，表明所產(chǎn)生的總PCR產(chǎn)物能產(chǎn)生400，000-800，000個(gè)克隆，遠(yuǎn)多于篩選改善的酶活性所需的。通過隨機(jī)選擇的克隆樣品的核苷酸序列分析證實(shí)了突變頻率。如所預(yù)計(jì)的，序列分析也證實(shí)了大約50%的插入物是以正向存在。SDS-PAGE分析證實(shí)了當(dāng)如推薦的進(jìn)行生長和誘導(dǎo)時(shí) anvitrogen)，基本上所有的克隆都具有表達(dá)41kD腈水解酶蛋白質(zhì)的正向插入物。此外，通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增了敏捷食酸菌72W腈水解酶基因，使用標(biāo)識為 SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的引物，并根據(jù)廠商推薦，將所得到的DNA產(chǎn)物克隆入 pTrcHis2-T0P0 (Invitrogen)中，以產(chǎn)生質(zhì)粒pNM18。用pNM18轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10產(chǎn)生的菌株用作為對照。除起始密碼子由GTG變?yōu)锳TG之外，ρ匪18中的敏捷食酸菌72W腈水解酶“對照”序列和野生型敏捷食酸菌72W的編碼序列相同，利于在大腸桿菌中表達(dá)。實(shí)施例2對敏捷食酸菌72W腈水解酶隨機(jī)誘變文庫篩詵增加的腈水解酶活件將來自每個(gè)易錯(cuò)PCR文庫的大約5，000個(gè)克隆涂布在補(bǔ)充有50mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂上。使用機(jī)器人技術(shù)在96-孔微量滴定板中進(jìn)行高通量篩選。在單個(gè)克隆于補(bǔ)充有50mg/L氨芐青霉素和ImMIPTG的液體LB中在37°C 200rpm搖動培養(yǎng)1 后，培養(yǎng)物在37°C下補(bǔ)充IOmM 3-羥基戊腈(3-HVN)，持續(xù)lh，80Hz線性振蕩。通過濾出細(xì)菌終止反應(yīng)，并將要被分析的上清液密封在微量滴定板中并貯藏在4°C直到分析。通過質(zhì)譜測定法 (APCI-MRM，流動相 95% MeOH/5% H2O, 5mL/min ；注射針洗滌 50% Me0H/50% H2O,每注射針 4mL/min)測定產(chǎn)生的3-羥基戊酸(3-HVA)。鑒定了顯示3-HVN轉(zhuǎn)化超過對照(大腸桿菌 ΤΟΡΙΟ/ρ匪18)大約5倍的三個(gè)克隆，并命名為大腸桿菌ΤΟΡΙΟ/ρ匪18/B4、大腸桿菌T0P10/ PNM18/B2 和大腸桿菌 T0P10/pNM18/H9。實(shí)施例3測定大腸桿菌TOP 10/p匪18(對照)、大腸桿菌TOP 10/p匪18/B4、大腸桿菌 T0P10/pNM18/B2和大腸桿菌Τ0Ρ10/ρΝΜ18/Η9腈水解酶活性通過將含有50mg/L氨芐青霉素的50mL的LB培養(yǎng)基添加到無菌的125mL燒瓶中， 然后刮取冷凍的細(xì)胞原液入燒瓶中并在37°C和200rpm下溫育所得到混合物12_16h，制備接種物。記錄所得到培養(yǎng)物的光密度，然后將80%甘油水溶液以15% (ν/ν)的終濃度添加， 并將所得到接種物的14. 3mL等分試樣添加到50-mL離心管中，在使用前冷凍貯藏在-80°C 下。向4-L無菌燒瓶中添加1. 80L的LB肉湯、0. 9mL氨芐青霉素水溶液(100mg/mL)以及 1. 8mL的IPTG水溶液(1. 0M)。然后，向該燒瓶中添加87. 5mL的大腸桿菌T0P10/p匪18 (對照)、大腸桿菌T0P10/pNM18/B4、大腸桿菌T0P10/pNM18/B2或大腸桿菌T0P10/pNM18/H9接種物，混合燒瓶的內(nèi)含物，并將所得到的混合物的250-mL等分試樣轉(zhuǎn)移到六個(gè)無菌I-L燒瓶的每一個(gè)中。培養(yǎng)物在37°C下以200rpm旋轉(zhuǎn)混合溫育8h，通過在4°C下離心收集來自每個(gè)燒瓶的細(xì)胞，并冷凍貯藏在_80°C下。向裝備有磁力攪拌條的4-mL玻璃管形瓶中添加1. OmL的1. OM 3_羥基戊腈水溶液，并再溫控水浴中將管形瓶及其內(nèi)含物平衡在25°C。一邊攪拌，一邊將預(yù)平衡至25°C的含有400mg濕細(xì)胞糊的1. OmL的0. 100M磷酸鉀緩沖液(pH 7. 0)添加到管形瓶中。在預(yù)定時(shí)間，取出樣品(0. IOOmL)并與由0. IOOmL水、0. 020mL的6. ON乙酸和0. 200mL的0. 20M 丁酸鈉水溶液(HPLC外標(biāo)物)組成的溶液混合。離心所得到的混合物，并通過HPLC對所得到的上清液分析3-羥基戊酸，使用Supelco LC-18-DB柱(15cmX4. 6mm)流動相10mM乙酸鈉 (NaOAc)水溶液、IOmM乙酸(AcOH)、7. 5% (ν/ν)甲醇。基于3-羥基戊酸的產(chǎn)生速率，測定中所使用的每一細(xì)胞糊的細(xì)胞干重(dew)被用于測定大腸桿菌Τ0Ρ10/ρΝΜ18(表1)、大腸桿菌 T0P10/pNM18/B4 (表 2)、大腸桿菌 T0P10/pNM18/B2 (表 3)和大腸桿菌 T0P10/pNM18/H9 (表 4)的腈水解酶活性。大腸桿菌ΤΟΡΙΟ/ρ匪18 (對照)、大腸桿菌ΤΟΡΙΟ/ρ匪18/B4、大腸桿菌 ΤΟΡΙΟ/ρ匪18/B2和大腸桿菌ΤΟΡΙΟ/ρ匪18/H9相對腈水解酶活性的比較列于表5中。表1大腸桿菌ΤΟΡΙΟ/ρ匪18腈水解酶活性(對照)
權(quán)利要求
1.如SEQID NO :7所示的分離的核酸分子。
2.一種包含可操作地連接有合適的調(diào)節(jié)序列的權(quán)利要求1的分離的核酸分子的嵌合基因。
3.一種包含權(quán)利要求2的嵌合基因的表達(dá)盒。
4.一種包含權(quán)利要求2的嵌合基因的轉(zhuǎn)化的微生物。
5.一種包含權(quán)利要求3的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化的微生物。
6.權(quán)利要求4的轉(zhuǎn)化的微生物，其中所述微生物選自叢毛單胞菌(Comamonassp.)、 棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)、fei|f菌(Brevibacterium sp·)、紅球菌(Rhodococcus sp·)、固氮菌(Azotobacter sp.)、梓樣酸桿菌(Citrobacter sp.)、腸桿菌(Enterobacter sp.)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium sp.)、克雷白氏桿菌(Klebsiella sp.)、沙門氏菌 (Salmonella sp.)、乳酸桿菌(Lactobacillus sp.)、曲霄(Aspergillus sp·)、糖酵母 (Saccharomyces sp.)、接合酵母(Zygosaccharomyces sp.)、畢赤氏酵母(Pichia sp.)、 克魯維氏酵母(Kluyveromyces sp.)、假絲酵母(Candida sp.)、漢森氏酵母(Hansenula sp.)、杜氏藻(Dunaliella sp.)、德巴利氏酵母(Debaryomyces sp.)、毛霉(Mucor sp.)、球擬酵母(Torulopsis sp.)、甲基桿菌(Methylobacteria sp·)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、 埃希氏桿菌(Escherichia sp. )、/[段單胞菌(Pseudomonas sp. )、f艮瘤菌(Rhizobium sp.) 禾口鏈霉菌(Streptomyces sp.)。
7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化的微生物，其中所述轉(zhuǎn)化的微生物是一種大腸桿菌菌株，選自保藏號為 ATCC 47076 的 MG1655、保藏號為 ATCC53911 的 FM5、保藏號為 ATCC 27325 的 W3110、 保藏號為ATCC35695的MC4100和保藏號為ATCC 12435的W1485。
8.一種用于將3-羥基腈水解為3-羥基羧酸的方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基腈與腈水解酶催化劑接觸，由此所述3-羥基腈被水解為相應(yīng)的3-羥基羧酸，所述腈水解酶催化劑為權(quán)利要求1的分離的核酸分子所編碼；和(b)任選地分離步驟 (a)中產(chǎn)生的3-羥基羧酸。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述3-羥基腈是3-羥基戊腈或3-羥基丁腈。
10.一種用于將3-羥基戊腈水解為3-羥基戊酸的方法，包括步驟(a)將反應(yīng)混合物水溶液中的3-羥基戊腈與權(quán)利要求1的分離的核酸分子編碼的腈水解酶催化劑接觸，由此所述3-羥基戊腈被水解為3-羥基戊酸；和(b)任選地分離步驟(a)中產(chǎn)生的3-羥基戊酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用腈水解酶突變體生產(chǎn)3-羥基羧酸。本發(fā)明涉及具有改善的用于將3-羥基腈轉(zhuǎn)化為3-羥基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶突變體。更具體地說，使用易錯(cuò)PCR和位點(diǎn)定向誘變突變敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶基因以產(chǎn)生具有改善的用于將3-羥基腈(如3-羥基丁腈或3-羥基戊腈)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的3-羥基羧酸的腈水解酶活性的腈水解酶。也提供了一種使用所述改善的突變體生產(chǎn)3-羥基羧酸的方法。
文檔編號C12N15/63GK102260695SQ201110195548
公開日2011年11月30日 申請日期2005年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月16日
發(fā)明者D·P·奧基夫, M·S·佩恩, R·迪科西莫 申請人:納幕爾杜邦公司