專利名稱：一種雞傳染性支氣管炎病毒的鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物技術，具體涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒的鑒定方法。
背景技術：
雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒anfectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一種急性、高度接觸傳染性、病毒性疾病。雞傳染性支氣管炎于1930年在美國北達科塔州首次發(fā)現(xiàn)，主要危害2日齡到3周齡雛雞的呼吸道，特征是喘息、精神倦怠，死亡率為40% -90%。根據(jù)IBV感染雞群后引起的臨床癥狀，分為呼吸型、腎型、腸型等多種病型，還有一些變異的中間型。隨著多種IB疫苗的廣泛使用和臨床混合感染的普遍發(fā)生，IBV感染雞群后日益缺乏典型的臨床癥狀和病理變化，必須通過實驗室診斷才能最終確診，從而采取科學、有效的防治措施。IBV的基因組為單股正鏈RNA，由于RNA基因組的高突變率以及其具有的獨特轉錄合成機制，導致了新基因型和血清型IBV毒株不斷出現(xiàn)，而不同血清型毒株間的交叉保護力很低甚至沒有，如果所用的疫苗毒株與當?shù)亓餍卸局甑难逍筒灰恢?，則不能產生有效的免疫保護。因此，對各地方流行病毒株的分離、鑒定和血清型劃分的研究一直是IBV的研究熱點，而如何快速、準確地鑒定IBV是現(xiàn)在亟需解決的問題。目前IB的實驗室診斷方法主要有病原分離鑒定、血清學技術以及近年來發(fā)展的分子生物學方法(核酸探針和RT-PCR技術等)。病原分離鑒定操作簡單，是當前應用最為廣泛的實驗室診斷技術，也是IB實驗室診斷的主要標準。但大多數(shù)IBV野毒不適于雞胚生長，需要至少2-4代盲傳(約12-16天)，才能使雞胚產生典型病變，因此，常常延誤最佳治療時機。而血清學方法由于IBV血清型繁多(據(jù)報道目前有30余種)導致鑒定程序繁瑣目前已很少應用。目前發(fā)展的分子生物學方法雖然能夠快速診斷IBV，但需要特殊的儀器設備，一般基層實驗室很難推廣。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中IBV分離鑒定存在的費時、缺乏客觀判定標準的問題，提供了一種利用IBV病毒能夠在雞胚中干擾雞新城疫病毒(NDV)的特性而研究的快速、準確的IBV鑒定方法，本方法主要采用將待檢樣品尿囊腔接種雞胚，之后接種雞新城疫病毒 (Newcastle disease virus, NDV)弱毒株LaSota并最終根據(jù)雞胚尿囊液血凝價的檢測結果來鑒定IBV是否存在，由于這種方法采用了間接測定的方式，較之現(xiàn)有技術有著檢測速度快，不需特殊培養(yǎng)的特點，且可以廣泛的用于雞傳染性支氣管炎的實驗室診斷、抗體檢測和IBV血清型鑒定，以進行IB疫苗免疫效果的評價、疫情監(jiān)測等，為制定科學的免疫程序并有效防控IB的發(fā)生提供理論依據(jù)。另外由于本方法無需特殊儀器設備，便于在一般基層實驗室推廣應用。本發(fā)明提供的具體技術方案是將待檢樣品尿囊腔接種SPF雞胚，同時設接種PBS 緩沖液的SPF雞胚做為對照，將兩組雞胚分別于37°C孵化M_30h后接種200-2000EID5Q的雞新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)弱毒株，之后再于37°C分別孵化48_72h后檢測雞胚尿囊液血凝價(HA)，根據(jù)血凝價(HA)判定結果當對照組雞胚尿囊液HA效價為 9-lllog2時，若接種待檢樣品的雞胚尿囊液HA效價為0-21og2，則為IBV陽性，若接種待檢樣品的雞胚尿囊液HA效價為9-lllog2，則為IBV陰性。由于NDV和IBV在9-11日齡SPF雞胚中生長良好，一般待檢樣品接種后需要 20-30h再接種NDV，所以綜合考慮，選用9-10日齡SPF雞胚進行接種。將上述接種后的SPF 雞胚在37°C孵化M-30h，時間過短，IBV在雞胚中尚未增殖，對NDV無干擾作用；時間過長， IBV含量過高，可能導致雞胚死亡，無法再接種NDV，孵化時間優(yōu)選Mh。為了生物安全，避免強毒對環(huán)境的污染，本發(fā)明選用弱毒株疫苗，例如C30或LaSota進行接種。作為國內最常用的弱毒疫苗株，優(yōu)選最具代表性的LaSota，上述的弱毒株疫苗均為市售疫苗。NDV的接種量在200-2000EID5(1都可以，因為本發(fā)明中和試驗中的病毒量為200EID5(1，為了易于試驗，本發(fā)明選用劑量為200EID5(1。接種NDV后，再在37°C孵化48_7池，優(yōu)選48h，使得雞胚尿囊液 HA效價最高，從而根據(jù)HA判定結果。由于對照組雞胚只接種PBS緩沖液，不含有IBV，所以不會對NDV的增殖造成干擾， 如果接種待檢樣品的雞胚尿囊液HA效價與對照組相同，則說明待檢樣品中沒有IBV，反之， 則待檢樣品中有IBV。本發(fā)明中，NDV和IBV接種的先后順序不能顛倒，否則IBV對NDV增殖無干擾作用， 無法檢測。本發(fā)明所采用的待檢樣品，其處理過程是當選用病變組織作為待檢樣品時，將病變組織用研磨器磨碎后，加入含青霉素2000IU/mL、鏈霉素ang/mL的0. OlMPBS pH為7. 4的緩沖液，混勻，-20°C反復凍融3次，SOOOrpm離心后取上清，4°C作用2_4h，即可用于雞胚接種；病變組織為臨床上懷疑感染IBV的病死雞的內臟器官，主要包括雞的氣管或肺臟或腎臟或輸卵管或腸道或肝臟或脾臟。當選用病雞喉氣管棉拭子樣品和泄殖腔棉拭子樣品作為待檢樣品時，在PBS緩沖液中加入青霉素10000IU/mL、鏈霉素10mg/mL、丁胺卡那霉素5000IU/mL、制霉菌素5000IU/ mL后進行上述制備。本發(fā)明所涉及的技術方案主要是針對IBV接種后雞胚孵化時間、NDV弱毒株的選擇及接種劑量、接種NDV后的雞胚孵化時間、NDV和IBV接種的先后順序等進行了條件優(yōu)化。 在此優(yōu)化條件下所獲得的雞胚尿囊液的HA效價在雞胚間的離散度最低，陽性樣品HA效價為0-21og2，陰性樣品HA效價為9-lllog2，兩者差異顯著(P < 0. 01)，從而使結果的判定更加準確。綜上所述，本發(fā)明的IBV鑒定方法與病毒分離、RT-PCR方法比較，本發(fā)明采用了間接測定的方式，較現(xiàn)有的技術有著檢測速度快，結果準確度高，不需特殊的儀器設備等特點，一般72h即可獲得檢測結果(見表1)，可以廣泛用于雞傳染性支氣管炎的實驗室診斷、 抗體檢測和IBV血清型鑒定，從而進行IB疫苗免疫效果的評價、疫情監(jiān)測等，為制定科學的免疫程序并有效防控IB的發(fā)生提供理論依據(jù)。表1本發(fā)明方法與病毒分離、RT-PCR方法比較
權利要求
1.一種雞傳染性支氣管炎病毒的鑒定方法，其特征在于步驟如下將待檢樣品尿囊腔接種SPF雞胚，同時設接種PBS緩沖液的SPF雞胚做為對照，將兩組雞胚分別于37°C孵化M_30h后接種200-2000EID5(1的雞新城疫病毒弱毒株，之后再于37°C 分別孵化48-7 后檢測雞胚尿囊液血凝價，根據(jù)血凝價判定結果當對照組雞胚尿囊液血凝價效價為9-lllog2時，若接種待檢樣品的雞胚尿囊液血凝價效價為0-21og2，則為IBV陽性；若接種待檢樣品的雞胚尿囊液血凝價效價為9-lllog2，則為IBV陰性。
2.根據(jù)權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的SPF雞胚為9-10日齡雞胚。
3.根據(jù)權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的接種待檢樣品或PBS緩沖液后雞胚的孵化時間為Mh。
4.根據(jù)權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的雞新城疫病毒弱毒株采用C30 或 LaSota,優(yōu)選 LaSota0
5.根據(jù)權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的雞新城疫病毒弱毒株的接種量為 200EID5Q。
6.根據(jù)權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的接種雞新城疫病毒后孵化的時間為48h。
7.根據(jù)權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于所述的待檢樣品處理過程是當選用病變組織作為待檢樣品時，將病變組織用研磨器磨碎后，加入含青霉素2000IU/ mL、鏈霉素2mg/mL的0. OlMPBS pH為7. 4的緩沖液，混勻，_20°C反復凍融3次，8000rpm離心后取上清，4°C作用2-4h，即可用于雞胚接種；當選用病雞喉氣管棉拭子樣品和泄殖腔棉拭子樣品作為待檢樣品時，在PBS緩沖液中加入青霉素10000IU/mL、鏈霉素10mg/mL、丁胺卡那霉素5000IU/mL、制霉菌素5000IU/mL后進行上述制備。
8.根據(jù)權利要求7所述的鑒定方法，其特征在于所述的病變組織為臨床上懷疑感染 IBV的病死雞的內臟器官，主要包括雞的氣管或肺臟或腎臟或輸卵管或腸道或肝臟或脾臟。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的鑒定方法，該方法是將待檢樣品尿囊腔接種SPF雞胚，同時設接種PBS緩沖液的SPF雞胚做為對照，將兩組雞胚分別于37℃孵化24-30h后接種200-2000倍雞胚半數(shù)感染量(EID50)的雞新城疫病毒弱毒株，之后再于37℃分別孵化48-72h后檢測雞胚尿囊液血凝價，根據(jù)血凝價判定結果。本方法利用了IBV病毒能夠在雞胚中干擾雞新城疫病毒(NDV)增殖的特性，可用于雞傳染性支氣管炎的實驗室診斷、抗體檢測和IBV血清型鑒定，以進行雞傳染性支氣管炎疫苗免疫效果的評價、疫情監(jiān)測等，為制定科學的免疫程序并有效防控該病的發(fā)生提供理論依據(jù)。
文檔編號C12Q1/70GK102286638SQ20111021245
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權日2011年7月27日
發(fā)明者任海松, 張琳, 張秀美, 楊少華, 胡北俠, 許傳田, 黃艷艷 申請人:山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所