專利名稱：藤黃微球菌及其催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)腈水解酶的微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，以及篩選獲得的具有腈水解酶活性的菌株。
背景技術(shù)：
亞氨基二乙酸(IDA)是一種比較重要的化工原料，具有很強(qiáng)的絡(luò)合能力能和多種金屬離子絡(luò)合而形成螯合物，和銅離子可以形成藍(lán)色的鰲合物，常用作絡(luò)合劑和表面活性劑，常用于有機(jī)合成，也是草甘膦(Glyphosate)生產(chǎn)的重要中間體。由于其分子中含有亞氨基和羧基，化學(xué)性質(zhì)很活潑，廣泛應(yīng)用于電鍍、染料、醫(yī)藥、電子等領(lǐng)域。是一種重要的化工中間體。目前制備亞氨基二乙酸一般采用化學(xué)方法，根據(jù)原料的不同主要有氯乙酸法、氮川三乙酸法、氨代氯乙酸法、氫氰酸法、一乙醇胺法、二乙醇胺法等。傳統(tǒng)的化學(xué)方法存在產(chǎn)生成本高、污染嚴(yán)重、對設(shè)備要求高，或者使用劇毒的氫氰酸等弱點(diǎn)。利用生物催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸與化學(xué)水解法相比，其優(yōu)勢在于(1)反應(yīng)條件溫和?；瘜W(xué)水解法需要在10(TC左右進(jìn)行，必須配備加熱和溫控裝置，反應(yīng)條件苛刻，能耗高而且對設(shè)備要求高。而生物催化法一般都是在常溫下進(jìn)行，反應(yīng)條件溫和，設(shè)備成本相對較低。( 原料消耗大幅度減少，基本不產(chǎn)生可溶性鹽。利用腈水解酶一步水解生成亞氨基二乙酸，省去了堿解和酸化工藝，避免了 NaOH和濃鹽酸的大量使用。生物法中利用NH4OH調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化體系的pH 值，在產(chǎn)物回收中采用再生技術(shù)，可以有效減少可溶性鹽的排放。( 廢水排放少。按照目前的化學(xué)水解工藝，生產(chǎn)每噸亞氨基二乙酸將至少產(chǎn)生廢水8噸。采用生物法后，以腈水解酶酶活力10萬單位計(jì)算(回用5次)，生產(chǎn)每噸亞氨基二乙酸的廢水量可控制在2噸以下， 且廢水中不存在鹽類等難處理雜質(zhì)，可生化性強(qiáng)。利用腈轉(zhuǎn)化酶生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸，可以克服化學(xué)法生產(chǎn)亞氨基二乙酸的缺陷。生物催化是迄今為止人類所知道的最高效、最具選擇性的催化體系，可以提供許多傳統(tǒng)化學(xué)方法不能或者不易合成得到的手性化合物的合成方法，顯示出優(yōu)良的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性。而且，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)產(chǎn)物純度高、容易分離和純化，在農(nóng)藥中間體的生產(chǎn)中，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是微生物產(chǎn)酶培養(yǎng)得到腈水解酶催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸的制備方法。本發(fā)明所另一目的是提供篩選得到的產(chǎn)腈水解酶的微生物。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是藤黃微球菌(Micrococcus luteus) ZJB09131，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCC No =M 209051，保藏日期2009年3 月18日。上述菌株由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所從土壤中分離獲得。
本發(fā)明還涉及利用前述菌株微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法， 所述的方法是利用產(chǎn)腈水解酶的菌株，經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)得到腈水解酶，以該酶為生物催化劑催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸。生物催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸的過程如下
NH(CH2CN)2 月青細(xì)_ > NH(CH2COOH)2(IDA)本發(fā)明所述的制備亞氨基二乙酸的方法具體如下(A)將所述藤黃微球菌CCTCC No =M 209051接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑a于 100 200r/min、20 35°C條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)2 5d ；所述誘導(dǎo)劑a為正丁腈、異丁腈或己內(nèi)酰胺；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成為甘油8g/L，酵母膏6g/L，NaCl lg/L，K2HPO4 5g/ L，MgSO4 0. 2g/L，溶劑為水，pH值7. 0 ；所述誘導(dǎo)劑a的終濃度為5g/L ；(B)取亞氨基二乙腈配制成質(zhì)量濃度0. 5% 6%的水溶液，調(diào)初始pH為7. 0 7. 5，作為酶催化反應(yīng)底物溶液；以步驟(A)發(fā)酵獲得的濕菌體、細(xì)胞破碎獲得的粗酶液或經(jīng)固定化得到的固定化細(xì)胞作為酶源，酶源加入量以濕菌體計(jì)為0. 1 IOg濕菌體/IOmL 底物溶液；控制反應(yīng)溫度為30°C、反應(yīng)pH為6. 0 9. 0，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 16h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到亞氨基二乙酸。上述步驟(A)所述的發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)選在30°C條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)3d ；步驟(B)所述的控制反應(yīng)溫度優(yōu)選為30°C，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)10h。本發(fā)明所述的產(chǎn)腈水解酶的微生物由如下方法篩選獲得，所述方法包括初篩和復(fù)篩(1)初篩將待篩選菌株接種至初篩培養(yǎng)基，25 37°C培養(yǎng)1 4d，挑取菌落中產(chǎn)生黃色變色圈的菌株，接種到LB斜面培養(yǎng)基，25 30°C培養(yǎng)2 5d后取菌株進(jìn)行復(fù)篩；所述初篩培養(yǎng)基終濃度組成如下亞胺基二乙腈5g/L，酵母膏6g/L，NaCl lg/L,K2HPO4 lg/L, MgSO4 lg/L，溴鉀酚紫lg/L，瓊脂粉20g/L，溶劑為水，pH 7. 0 ；即所述初篩培養(yǎng)基每IL按如下組成配制亞胺基二乙腈5g，酵母膏6g，NaCl lg,K2HP04 IgjMgSO4 lg，溴鉀酚紫0. lg，瓊脂粉20g，溶劑為水，pH 7.0；優(yōu)選步驟⑴初篩所述的培養(yǎng)溫度洲 30°C，培養(yǎng)3 4d。(2)復(fù)篩將初篩獲得的菌株接種至復(fù)篩培養(yǎng)基，100 200r/min、25 35°C下培養(yǎng)2 7d，收集菌體測定亞氨基二乙酸的生成量，收集生成亞氨基二乙酸含量大于10%的微生物；所述復(fù)篩培養(yǎng)基終濃度組成如下甘油8g/L、酵母膏6g/L、NaCl lg/L、K2HPO4 5g/ L、MgSO4 0.2g/L，正丁腈5g，溶劑為水，pH 7. 0，即所述復(fù)篩培養(yǎng)基每IL按如下組成配制 甘油 8g、酵母膏 6g、NaCl lg、K2HPO4 5g、MgSO4 0. 2g，誘導(dǎo)劑 b 5g，溶劑為水，pH 7.0。優(yōu)選步驟O)復(fù)篩所述的培養(yǎng)溫度為30 32°C。本發(fā)明所述的誘導(dǎo)劑a與誘導(dǎo)劑b所表示的都是微生物培養(yǎng)過程中的誘導(dǎo)劑，這里a和b只是用以區(qū)分誘導(dǎo)劑出現(xiàn)在不同步驟。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種利用產(chǎn)腈水解酶的菌株經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)， 得到腈水解酶，以該酶為生物催化劑催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸的方法，可高效生產(chǎn)亞氨基二乙酸，本發(fā)明還提供了可產(chǎn)腈水解酶的微生物的篩選方法，并獲得了多種產(chǎn)腈水解酶的菌株，為采用生物催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸提供了基礎(chǔ)，具有重要應(yīng)用前景。 具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 產(chǎn)腈水解酶菌種的初篩初篩培養(yǎng)基每IL按如下組成配制酵母膏6g，NaCl IgjK2HPO4 IgjMgSO4 lg，瓊脂粉20g，pH 7.0水補(bǔ)足至IOOOmL,滅菌后冷卻到50°C加入5g亞氨基二乙腈和Ig溴甲酚紫， 混勻到平板。收集細(xì)菌進(jìn)行篩選，涂布于平板上，在溫度觀 30°C，培養(yǎng)3 4d，挑取菌落中產(chǎn)生黃色變色圈的菌株，接種到LB斜面培養(yǎng)(25 )；黃色變色圈的微生物菌株有邊緣假單胞菌ZJB09121 O^seudomonas marginal is ZJB09121)、惡臭假單胞菌 ZJB09134 (Pseudomonas putia ZJB09134)、惡臭假單胞菌 ZJB09129 (Pseudomonas putia ZJB09129) > ^fiIfi^ ZJB09135 (Pseudomonas putia ZJB09135)、熒光假單胞菌 ZJB09137 (Pseudomonas f luorescens ZJB09137)、產(chǎn)酸克雷伯氏菌 ZJB09123 (Kelbsiella ocytoca ZJB09123)、弗氏紅球菌 ZJB09124(Rhodococcus wratislaviensis ZJB09124)、嗜吡啶紅球菌 ZJB09126(Rhodococcus pyridinivorans ZJB09126)、紫紅紅球菌 ZJB09125 (Rhodococcus rhodochrous ZJB09125)、赤紅球菌 ZJB09127(Rhodococcus rubber ZJB09127)、藤黃微球菌 ZJB09131(Micrococcus luteus ZJB09131)(即 CCTCC No :M 209051)、耐鹽短桿菌 ZJB09132 (Brevibacterium halotoerans ZJB09132)、敏捷食酸菌 ZJB09122 (Acidovorax facilis ZJB09122)、 糞產(chǎn)堿桿菌 ZJB09138 (Alcaligenes faecalis ZJB09138)、節(jié)桿菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99。實(shí)施例2 產(chǎn)腈水解酶菌種的復(fù)篩將實(shí)施例1中有篩選到的可產(chǎn)生變色反應(yīng)且黃色變色圈大的菌株，接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，30 32°C，100 200r/min，500mL三角瓶裝液量150mL，發(fā)酵培養(yǎng)3d，發(fā)酵液離心得到粗酶液或濕菌體。各取Ig濕菌體，置于500ml三角瓶中，加入50ml 2% (w/w)的反應(yīng)底物亞氨基二乙腈水溶液，30°C搖床150r/min條件下反應(yīng)60min，離心去除菌體，測定亞氨基二乙酸的生成量，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表1。復(fù)篩培養(yǎng)基每IL按如下組成配制甘油8g，酵母膏6g，NaCl lg, K2HPO4 5g，MgSO4 0. 2g，正丁腈5g，pH值7. 0，水補(bǔ)足至IOOOmL ；誘導(dǎo)劑正丁腈也可以異丁腈或己內(nèi)酰胺代替。表1 產(chǎn)腈水解酶菌種的復(fù)篩結(jié)果
權(quán)利要求
1.藤黃微球菌(Micrococcusluteus) ZJB09131，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCC No =M 209051，保藏日期2009年3月 18日。
2.一種利用權(quán)利要求1所述藤黃微球菌CCTCC No =M 209051催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，所述方法如下(A)將所述藤黃微球菌CCTCCNo =M 209051接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)劑a于100 200r/min,20 35°C條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)2 5d ；所述誘導(dǎo)劑a為正丁腈、異丁腈或己內(nèi)酰胺；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成為甘油8g/L，酵母膏6g/L，NaCl lg/L, K2HPO4 5g/L，MgSO4 0. 2g/L,溶劑為水，pH值7. 0 ；所述誘導(dǎo)劑a的終濃度為5g/L ；(B)取亞氨基二乙腈配制成質(zhì)量濃度0.5% 6%的水溶液，調(diào)初始pH為7. 0 7. 5， 作為酶催化反應(yīng)底物溶液；以步驟(A)發(fā)酵獲得的濕菌體、細(xì)胞破碎獲得的粗酶液或經(jīng)固定化得到的固定化細(xì)胞作為酶源，酶源加入量以濕菌體計(jì)為0. 1 IOg濕菌體/IOmL底物溶液；控制反應(yīng)溫度為30°C、反應(yīng)pH為6. 0 9. 0，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 16h，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到亞氨基二乙酸。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(B)取亞氨基二乙腈配制成質(zhì)量濃度0. 5% 6%的水溶液，以氨水、NaOH或HCl水溶液調(diào)pH為7. 0 7. 5。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(A)所述的發(fā)酵培養(yǎng)在30°C條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)3d。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟(B)所述的控制反應(yīng)溫度為 30°C，進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)IOh。
全文摘要
本發(fā)明提供了微生物催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法及菌株，所述的方法是利用產(chǎn)腈水解酶的菌株，經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)得到腈水解酶，以腈水解酶做為生物催化劑生物催化亞氨基二乙腈制備得到亞氨基二乙酸。該發(fā)明為采用生物催化亞氨基二乙腈生產(chǎn)亞氨基二乙酸提供了基礎(chǔ)，具有重要應(yīng)用前景。
文檔編號C12P13/04GK102277320SQ20111022379
公開日2011年12月14日 申請日期2009年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月16日
發(fā)明者張濤, 徐建妙, 柳志強(qiáng), 沈寅初, 薛亞平, 鄭仁朝, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)