專利名稱：一種輔酶a的制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔酶A的制備工藝。
背景技術(shù)：
輔酶A，Coenzyme A簡稱CoA，它是由β-巰基乙胺、4，-磷酸泛酸、5，-二磷酸腺苷組成。CoA在生物體內(nèi)主要作為轉(zhuǎn)乙酰基的輔酶。CoA是體內(nèi)乙?；磻?yīng)的輔酶，對體內(nèi)糖、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的代謝起著重要的作用，如三羧酸循環(huán)、肝糖原的積存、乙酰膽堿的合成、膽固醇的降低及血漿脂肪含量的調(diào)節(jié)等。臨床用于動脈硬化、心肌梗塞、多種肝病包括肝炎、脂肪肝等癥、血小板減少性紫斑、白細胞減少癥、尿毒癥、糖尿病酸中毒、功能性低熱的輔助治療等。輔酶A原料藥為白色或淡黃色粉末，有類似蒜臭味，是體內(nèi)乙?；磻?yīng)的輔酶，對糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝起重要作用。輔酶A是通過微生物發(fā)酵、酶促合成、大孔樹脂吸附、氧化亞銅提純、葡聚糖凝膠層析精制而得。目前市場普遍存在微生物發(fā)酵單位低(發(fā)酵單位在300 400u/ml之間， 平均在330u/ml)、發(fā)酵液雜質(zhì)多后續(xù)分離純化難度大、最終收率低等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的發(fā)酵表達量低、活力單位收率少等缺陷，本發(fā)明提供了一種高活力發(fā)酵表達的輔酶A的制備工藝，本發(fā)明對微生物發(fā)酵培養(yǎng)基配比進行了改進，對適合微生物生長的葡萄糖、玉米漿及適合生物酶合成的蛋白胨、無機鹽等進行了優(yōu)化組合，篩選出了最適的微生物發(fā)酵酶促合成反應(yīng)配比，使得微生物菌量與生物酶促合成達到平衡，輔酶A的生物合成表達最大化。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種輔酶A的制備工藝，包括微生物發(fā)酵、酶促合成、大孔樹脂吸附、氧化亞銅提純、葡聚糖凝膠層析和還原沉淀六部分，其中，微生物發(fā)酵包括菌種選育、菌種發(fā)酵兩個階段；所述菌種發(fā)酵階段，所采用的培養(yǎng)基的配方組成如下葡萄糖8% 10% ；玉米漿 1. 3% 1. 5%;牛骨或魚蛋白胨1. 5% 1. 8%;硫酸鎂1. 0% 1. 2%;氯化鈣0. 01%
0.02 %，尿素0. 8 % 1. 0 %，余量為水，各組分按重量百分比。優(yōu)選的，所述養(yǎng)基的配方組成如下葡萄糖10% ；玉米漿1. 4%，牛骨蛋白胨
1.5% ；硫酸鎂1.0% ；氯化鈣0. 01%，尿素0.8%，余量為水。優(yōu)選的，所述菌種發(fā)酵階段，發(fā)酵條件為溫度30 35°C，空氣流量1 (0.6 1. 0)，時間20 沈小時，發(fā)酵完成后，檢測PH值、OD值、殘留糖量并鏡檢有無雜菌。優(yōu)選的，在所述菌種選育階段，選用產(chǎn)氨短桿菌，理由為能進行輔酶A酶合成反應(yīng)的菌種很多，如酵母菌、短桿芽孢桿菌、假單孢菌、產(chǎn)氨短桿菌等；國內(nèi)外文獻報道表明， 產(chǎn)氨短桿菌通過發(fā)酵富集菌量然后進行酶促合成輔酶A產(chǎn)量是最高的，因此選用產(chǎn)氨短桿菌。優(yōu)選的，在所述酶促合成部分，向酶反應(yīng)液中分次加入1次、2次或3次前體物質(zhì)鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣和三磷酸腺苷二鈉，進一步優(yōu)選的，向酶反應(yīng)液中分加入1次前體物質(zhì)鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣和三磷酸腺苷二鈉。優(yōu)選的，所述前體物質(zhì)鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣和三磷酸腺苷二鈉按酶反應(yīng)液的重量百分比添加，添加量分別為0. 1 % 0. 2 %鹽酸半胱氨酸、0. 07 % 0. 08 %泛酸鈣、
0. 2% 0. 3%三磷酸腺苷二鈉。優(yōu)選的，所述酶促合成部分，酶反應(yīng)溫度30 35°C，空氣流量1 (0.3 0.6)， 時間20 M小時，反應(yīng)過程中不斷地攪拌；反應(yīng)后，得反應(yīng)液，反應(yīng)液酸化壓濾，得壓濾清液。本發(fā)明的輔酶A的制備工藝具體步驟可以如下(一)微生物發(fā)酵輔酶A發(fā)酵菌種經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，溫度30 35°C，空氣流量1 (0.6 1.0)，時間 20 沈小時，檢測pH值、OD值、殘留糖量并鏡檢無雜菌。(二)酶促合成向酶反應(yīng)液中逐步加入前體物質(zhì)鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣、三磷酸腺苷二鈉，酶反應(yīng)溫度30 35°C，空氣流量1 (0. 3 0. 6)，時間20 M小時。攪拌得反應(yīng)液，反應(yīng)液酸化壓濾，得壓濾清液。(三)大孔樹脂吸附壓濾清液上已處理好的CAD型大孔樹脂吸附，低濃度乙醇淋洗除雜質(zhì)，堿性乙醇液洗脫得到分離液，洗脫液真空濃縮，得濃縮液。(四)氧化亞銅提純濃縮液加入鹽酸半胱氨酸，硫酸調(diào)節(jié)pH，加入氧化亞銅，使輔酶A形成巰醇鹽沉淀，用無鹽水洗滌沉淀，用硫化氫脫除銅，離心后濃縮得濃縮液。(五)葡聚糖凝膠層析濃縮液上已處理好的G-25型葡聚糖凝膠樹脂進行分離純化，使用紫外分析檢測儀和薄層層析進行檢測，在^Onm ^Onm波長范圍檢測，收集輔酶A的有效成份。(六)還原沉淀洗脫液用飽和的氫氧化鋰、氫氧化鈉或氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到4. 5 5. 0，加入巰基乙醇為還原劑，搖勻后放入恒溫箱中，30 35°C還原10 16小時，真空濃縮得濃縮液。濃縮液使用丙酮沉淀輔酶A，溫度控制小于< 5°C，過濾得輔酶A濕品，五氧化二磷真空干燥。上述步驟中，步驟(三) (六)均為常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明對此無改進，在此不再贅述。經(jīng)本發(fā)明的工藝制備得到的輔酶A，活力測定達到500 600u/ml，最高批次可達 717u/ml ；與現(xiàn)有技術(shù)相比，提高了輔酶A發(fā)酵表達量，使單位體積的酶活力提高1/3，最高表達單位717u/ml ；減少了發(fā)酵液的雜質(zhì)，為后續(xù)分離純化提供了有利條件；提高了最終的收率每噸發(fā)酵液的平均收率由原來的0. 51億單位提高至0. 79億單位以上。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。需要說明的是，本發(fā)明僅對微生物發(fā)酵部分的配方比例和酶促合成反應(yīng)階段進行了優(yōu)化，其他大孔樹脂吸附、氧化亞銅提純及葡聚糖凝膠層析仍采用原工藝技術(shù)，因此實施例中未對原工藝技術(shù)進行詳細的說明。實施例1(一)微生物發(fā)酵將培養(yǎng)基按規(guī)定配比葡萄糖8% ；玉米漿1. 4% (玉米漿購自石家莊中營淀粉有限公司，080715批，下同)；牛骨蛋白胨1.5% (進口)；硫酸鎂1.0% ；氯化鈣0· 01%，尿素0. 8% ；余量為水，各組分按重量百分比，投入發(fā)酵罐內(nèi)，加入余量的水，攪拌均勻，流通蒸汽消毒滅菌。然后將培養(yǎng)好的輔酶A產(chǎn)氨短桿菌種按接種量6%移入發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在30 35°C，空氣流量1 0. 8，時間22小時，培養(yǎng)終點控制；pH值應(yīng)為6. 0 6. 5、 OD值為1. 5 2.0、鏡檢無雜菌、殘留糖量4% 6%。( 二 )酶促合成向發(fā)酵液中加入破壁劑苯扎溴銨及前體物質(zhì)0. 15%鹽酸半胱氨酸、0. 07%泛酸鈣、0.2%三磷酸腺苷二鈉，各組分按重量百分比，1次加入所需前體物質(zhì)，攪拌均勻。酶反應(yīng)溫度控制在30 35°C，空氣流量1 0. 5，時間22小時，反應(yīng)液檢測效價，效價在500 600u/ml之間，反應(yīng)液酸化壓濾，得壓濾清液。(三)大孔樹脂吸附壓濾清液上已處理好的CAD型大孔樹脂吸附，流速控制在1/4裝柱體積/小時，得吸附飽和樹脂，用0. 03mol/l稀硝酸洗滌除雜質(zhì)，流速控制在1/4裝柱體積/小時。用氨-乙醇液解析洗脫輔酶A，流速控制在1/4裝柱體積/小時，收集pH2. 0 7. 0的解析液，得到分離液，洗脫液真空濃縮得濃縮液，濃縮液效價控制在> 3000u/ml，體積為解析液的1/12，得濃縮液。(四)氧化亞銅提純向濃縮液中加入鹽酸半胱氨酸，硫酸調(diào)節(jié)pH，加入氧化亞銅，使輔酶A反應(yīng)形成巰醇鹽微量沉淀，反應(yīng)完成后水化沉淀，離心得輔酶A酮鹽沉淀。用稀酸和純化水洗滌沉淀， 加入濃縮液體積的純化水制成混懸液，調(diào)pH 3. 0 3. 5，用硫化氫脫除銅5 8小時，離心后上清液真空濃縮，濃縮液效價控制在> 25000u/ml，濃縮后體積為原體積的1/10，得濃縮液。(五)葡聚糖凝膠層析濃縮液上已處理好的G-25型葡聚糖凝膠樹脂進行分離純化，上柱流速控制在1/4 裝柱體積/小時，然后用注射用水作為展層液進行分離，使用紫外分析檢測儀和薄層層析進行檢測，在260nm 280nm波長范圍檢測，收集輔酶A的有效成份。再次濃縮，濃縮后體積為原體積的1/12，濃縮液效價控制在> 60000u/ml，濃縮液過濾除沉淀。(六)還原沉淀濃縮濾液用飽和的氫氧化鋰溶液調(diào)節(jié)pH值到4. 5 5. 0，按單位的15%加入巰基乙醇為還原劑，搖勻后放入恒溫箱中，30 35°C還原14小時，真空濃縮得濃縮液，濃縮液效價控制在> 120000u/ml，濃縮液過濾除沉淀。濃縮液使用pH3. 0的硝酸冷丙酮沉淀輔酶A， 溫度控制< 5°C，過濾得輔酶A濕品，沉淀濕品用冷丙酮洗滌二次，過濾至干，變色硅膠作干燥劑進行真空干燥，溫度控制35 40°C，時間48 72小時，球磨粉碎得輔酶A成品。送樣檢驗。
實施例2(一 )微生物發(fā)酵將培養(yǎng)基按規(guī)定配比葡萄糖10% ；玉米漿1. 3% ；牛骨蛋白胨1. 6% ；硫酸鎂 1.0%;氯化鈣0. 02%，尿素1.0%;余量為水，各組分按重量百分比，投入發(fā)酵罐內(nèi)，攪拌均勻，流通蒸汽消毒滅菌。然后將培養(yǎng)好的輔酶A產(chǎn)氨短桿菌種按接種量6%移入發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在30 35°C，空氣流量1 0. 8，時間22小時，培養(yǎng)終點控制；pH值應(yīng)為 6. 0 6. 5、OD值為1. 5 2. 0、鏡檢無雜菌、殘留糖量4% 6%。( 二 )酶促合成向發(fā)酵液中加入破壁劑苯扎溴銨及前體物質(zhì)0. 2%鹽酸半胱氨酸、0. 075%泛酸鈣、0. 3%三磷酸腺苷二鈉，各組分按重量百分比，將總量前體物質(zhì)平均分配，分別在0小時起始、3小時、6小時補加前體物質(zhì)，分1次，2次，3次加入所需前體物質(zhì)，攪拌均勻。酶反應(yīng)溫度控制在30 35°C，空氣流量1 0. 5，時間22小時，反應(yīng)液檢測效價，效價為500 600u/ml，反應(yīng)液酸化壓濾，得壓濾清液。發(fā)酵液取樣檢驗輔酶A效價，其具體檢測結(jié)果如下表1所示表 1
樣品1次加入樣品2次加入樣品3次加入樣品發(fā)酵液單位(u/ml)717708402 根據(jù)實驗數(shù)據(jù)可知，酶促反應(yīng)階段一次加入全量的前體物質(zhì)，可以提高輔酶A的效價單位，顯著優(yōu)于分三次加入前體物質(zhì)。(三)大孔樹脂吸附壓濾清液上已處理好的CAD型大孔樹脂吸附，流速控制在1/4裝柱體積/小時，得吸附飽和樹脂，用0. 03mol/l稀硝酸洗滌除雜質(zhì)，流速控制在1/4裝柱體積/小時。用氨-乙醇液解析洗脫輔酶A，流速控制在1/4裝柱體積/小時，收集pH2. 0 7. 0的解析液，得到分離液，洗脫液真空濃縮得濃縮液，濃縮液效價控制在> 3000u/ml，體積為解析液的1/12，得濃縮液。(四)氧化亞銅提純向濃縮液中加入鹽酸半胱氨酸，硫酸調(diào)節(jié)pH，加入氧化亞銅，使輔酶A反應(yīng)形成巰醇鹽微量沉淀，反應(yīng)完成后水化沉淀，離心得輔酶A酮鹽沉淀。用稀酸和純化水洗滌沉淀， 加入濃縮液體積的純化水制成混懸液，調(diào)pH 3. 0 3. 5，用硫化氫脫除銅5 8小時，離心后上清液真空濃縮，濃縮液效價控制在> 25000u/ml，濃縮后體積為原體積的1/10，得濃縮液。(五)葡聚糖凝膠層析濃縮液上已處理好的G-25型葡聚糖凝膠樹脂進行分離純化，上柱流速控制在1/4 裝柱體積/小時，然后用注射用水作為展層液進行分離，使用紫外分析檢測儀和薄層層析進行檢測，在260nm 280nm波長范圍檢測，收集輔酶A的有效成份。再次濃縮，濃縮后體積為原體積的1/12，濃縮液效價控制在> 60000u/ml，濃縮液過濾除沉淀。
(六)還原沉淀濃縮濾液用飽和的氫氧化鋰溶液調(diào)節(jié)pH值到4. 5 5. 0，按單位的15%加入巰基乙醇為還原劑，搖勻后放入恒溫箱中，30 35°C還原14小時，真空濃縮得濃縮液，濃縮液效價控制在> 120000u/ml，濃縮液過濾除沉淀。濃縮液使用pH3. 0的硝酸冷丙酮沉淀輔酶A， 溫度控制< 5°C，過濾得輔酶A濕品，沉淀濕品用冷丙酮洗滌二次，過濾至干，變色硅膠作干燥劑進行真空干燥，溫度控制35 40°C，時間48 72小時，球磨粉碎得輔酶A成品。送樣檢驗。實施例3(一 )微生物發(fā)酵將培養(yǎng)基按規(guī)定配比葡萄糖10% ；玉米漿1.4% ；魚蛋白胨1.5% ；硫酸鎂 1.0%;氯化鈣0. 01%，尿素0.8%;余量為水，各組分按重量百分比，投入發(fā)酵罐內(nèi)，攪拌均勻，流通蒸汽消毒滅菌。然后將培養(yǎng)好的輔酶A產(chǎn)氨短桿菌種按接種量6%移入發(fā)酵罐培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在30 35°C，空氣流量1 0. 8，時間22小時，培養(yǎng)終點控制；pH值應(yīng)為 6. 0 6. 5、OD值為1. 5 2. 0、鏡檢無雜菌、殘留糖量4% 6%。( 二 )酶促合成向發(fā)酵液中加入破壁劑苯扎溴銨及前體物質(zhì)0. 2%鹽酸半胱氨酸、0. 07%泛酸鈣、 0. 2%三磷酸腺苷二鈉，1次加入所需前提物質(zhì)，攪拌均勻。酶反應(yīng)溫度控制在30 35°C， 空氣流量1 0. 5，時間22小時，反應(yīng)液檢測效價，效價為500 600u/ml，反應(yīng)液酸化壓濾，
得壓濾清液。(三)大孔樹脂吸附壓濾清液上已處理好的CAD型大孔樹脂吸附，流速控制在1/4裝柱體積/小時，得吸附飽和樹脂，用0. 03mol/l稀硝酸洗滌除雜質(zhì)，流速控制在1/4裝柱體積/小時。用氨-乙醇液解析洗脫輔酶A，流速控制在1/4裝柱體積/小時，收集pH2. 0 7. 0的解析液，得到分離液，洗脫液真空濃縮得濃縮液，濃縮液效價控制在> 3000u/ml，體積為解析液的1/12，得濃縮液。(四)氧化亞銅提純向濃縮液中加入鹽酸半胱氨酸，硫酸調(diào)節(jié)pH，加入氧化亞銅，使輔酶A反應(yīng)形成巰醇鹽微量沉淀，反應(yīng)完成后水化沉淀，離心得輔酶A酮鹽沉淀。用稀酸和純化水洗滌沉淀， 加入濃縮液體積的純化水制成混懸液，調(diào)pH 3. 0 3. 5，用硫化氫脫除銅5 8小時，離心后上清液真空濃縮，濃縮液效價控制在> 25000u/ml，濃縮后體積為原體積的1/10，得濃縮液。(五)葡聚糖凝膠層析濃縮液上已處理好的G-25型葡聚糖凝膠樹脂進行分離純化，上柱流速控制在1/4 裝柱體積/小時，然后用注射用水作為展層液進行分離，使用紫外分析檢測儀和薄層層析進行檢測，在260nm 280nm波長范圍檢測，收集輔酶A的有效成份。再次濃縮，濃縮后體積為原體積的1/12，濃縮液效價控制在> 60000u/ml，濃縮液過濾除沉淀。(六)還原沉淀濃縮濾液用飽和的氫氧化鋰溶液調(diào)節(jié)pH值到4. 5 5. 0，按單位的15%加入巰基乙醇為還原劑，搖勻后放入恒溫箱中，30 35°C還原14小時，真空濃縮得濃縮液，濃縮液效價控制在≥ 120000u/ml，濃縮液過濾除沉淀。濃縮液使用pH3. 0的硝酸冷丙酮沉淀輔酶A， 溫度控制< 5°C，過濾得輔酶A濕品，沉淀濕品用冷丙酮洗滌二次，過濾至干，變色硅膠作干燥劑進行真空干燥，溫度控制35 40°C，時間48 72小時，球磨粉碎得輔酶A成品。送樣檢驗。按輔酶A法定標(biāo)準(zhǔn)檢測發(fā)酵后酶促反應(yīng)液每Iml含輔酶A的效價單位同時計算各步收率及總收率，結(jié)果如表2所示。本發(fā)明與前公開專利CN101230374A比較，本發(fā)明在菌種選育階段，選用產(chǎn)氨短桿菌。本發(fā)明與前公開專利CN101230374A比較，本發(fā)明采用優(yōu)選的培養(yǎng)基配方，在菌體發(fā)酵階段鏡檢無雜菌，其OD值控制在1. 5 2. 0，使產(chǎn)輔酶A的產(chǎn)氨短桿菌最富集。本發(fā)明與前公開專利CN101230374A比較，本發(fā)明在培養(yǎng)基配方優(yōu)選中，選用牛骨蛋白胨或魚蛋白胨，為產(chǎn)氨短桿菌菌體生長提供最豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。本發(fā)明與前公開專利CN101230374A比較，本發(fā)明在酶促反應(yīng)階段破壁后，1次全量加入前體物質(zhì)，在產(chǎn)氨短桿菌菌體酶系的起始階段進行輔酶A的酶生物合成，依據(jù)酶反應(yīng)速度起始最快并呈線性速率的原理，在起始階段提供足夠量的底物，使輔酶A的酶生物合成速率達到最大轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明與前公開專利CN101230374A比較，本發(fā)明在酶促反應(yīng)階段，提供了足夠量的前體物質(zhì)，使輔酶A的酶反應(yīng)向正反應(yīng)方向進行，合成的輔酶A達到最大量。上述步驟(三) (六)均為公知技術(shù)，本發(fā)明對此無改進，在此不再詳述。由于發(fā)酵液發(fā)酵單位達到600u/ml，減少了發(fā)酵液的雜質(zhì)，為后續(xù)分離純化提供了有利條件；因此提高了最終的收率使每噸發(fā)酵液的平均收率由原來的0. 51億單位提高至0. 79億單位以上。表權(quán)利要求
1.一種輔酶A的制備工藝，包括微生物發(fā)酵、酶促合成、大孔樹脂吸附、氧化亞銅提純、 葡聚糖凝膠層析和還原沉淀六部分，其中，微生物發(fā)酵包括菌種選育、菌種發(fā)酵兩個階段， 其特征在于所述菌種發(fā)酵階段，所采用的培養(yǎng)基的配方組成如下葡萄糖8% 10% ；玉米漿1. 3% 1.5% ；牛骨或魚蛋白胨1. 5% 1.8% ；硫酸鎂1.0% 1.2% ；氯化鈣 0. 01% 0. 02%，尿素0. 8% 1. 0%，余量為水，各組分按重量百分比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于，所述養(yǎng)基的配方組成如下葡萄糖10% ；玉米漿1. 4% ；牛骨蛋白胨1. 5% ；硫酸鎂1. 0% ；氯化鈣0. 01%，尿素 0.8%，余量為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于所述菌種發(fā)酵階段，發(fā)酵條件為溫度30 35°C，空氣流量1 (0. 6 1.0)，時間20 沈小時，發(fā)酵完成后，檢測PH值、OD值、殘留糖量并鏡檢有無雜菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于所述菌種選育階段，選用產(chǎn)氨短桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于在所述酶促合成部分， 向酶反應(yīng)液中分次加入1次、2次或3次前體物質(zhì)鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣和三磷酸腺苷二鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于在所述酶促合成部分， 向酶反應(yīng)液中分1次加入前體物質(zhì)鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣和三磷酸腺苷二鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于所述前體物質(zhì)鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣和三磷酸腺苷二鈉的添加量分別為0. 0. 2%鹽酸半胱氨酸、 0. 07% 0. 08%泛酸鈣、0. 2% 0. 3%三磷酸腺苷二鈉，按重量百分比。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種輔酶A的制備工藝，其特征在于所述酶促合成部分，酶反應(yīng)溫度30 35°C，空氣流量1 (0. 3 0.6)，時間20 M小時，反應(yīng)過程中不斷地攪拌；反應(yīng)后，得反應(yīng)液，反應(yīng)液酸化壓濾，得壓濾清液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔酶A的制備工藝，包括微生物發(fā)酵、酶促合成、大孔樹脂吸附、氧化亞銅提純、葡聚糖凝膠層析和還原沉淀六部分，其中，微生物發(fā)酵包括菌種選育、菌種發(fā)酵兩個階段；菌種發(fā)酵階段，所采用的培養(yǎng)基的配方組成如下葡萄糖8％～10％；玉米漿1.3％～1.5％；牛骨或魚蛋白胨1.5％～1.8％；硫酸鎂1.0％～1.2％；氯化鈣0.01％～0.02％，尿素0.8％～1.0％，余量為水。本發(fā)明的工藝制備得到的輔酶A，活力測定達到500～600u/ml，最高批次可達717u/ml；與現(xiàn)有技術(shù)相比，提高了輔酶A發(fā)酵表達量，使單位體積的酶活力提高1/3，最高表達單位717u/ml；減少了發(fā)酵液的雜質(zhì)，為后續(xù)分離純化提供了有利條件；提高了最終的收率每噸發(fā)酵液的平均收率由原來的0.51億單位提高至0.79億單位。
文檔編號C12P19/40GK102321708SQ20111022592
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者劉盛儒, 孫巖, 張梅村, 王基偉, 王增鑫, 遲創(chuàng)成, 隗青 申請人:濟南維爾康生化制藥有限公司