專利名稱:一種產(chǎn)堿桿菌及利用其制備d-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及產(chǎn)堿桿菌及其用途,更具體地說是涉及一種產(chǎn)堿桿菌以及利用該產(chǎn)堿桿菌制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法。
背景技術(shù):
D-對(duì)羥基苯甘氨酸是一種重要的醫(yī)藥原料,用于合成內(nèi)酰胺類抗菌素類藥物,如羥氨芐青霉素、頭孢克羅、頭孢立新、頭孢拉定等抗菌藥物。這些藥物對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、弓形體、螺旋體等均有殺滅作用,在臨床醫(yī)學(xué)上被廣泛應(yīng)用,對(duì)很多常見病的治療起著重要的作用。已有技術(shù)制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸方法有兩種化學(xué)合成法和酶法?;瘜W(xué)合成法的缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜、成本高、對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸與化學(xué)合成法相比具有工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)品收率高、能源消耗少、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn),是目前最經(jīng)濟(jì)的工業(yè)生產(chǎn)方法。生物酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸可以分為酶拆分法和酶轉(zhuǎn)化法兩種方法。酶拆分法以化學(xué)法制備的乙?;疍L-HPG為底物,利用氨基?;高M(jìn)行拆分。酶轉(zhuǎn)化法以DL-對(duì)羥基苯海因?yàn)榈孜铮煤R蛎笇⒌孜镛D(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯甘氨酸。酶拆分法的缺點(diǎn)是1、產(chǎn)物收率低,最高不超過50%;2、必須事先合成消旋的乙?;疍L-HPG底物, 工藝復(fù)雜。酶轉(zhuǎn)化法制備D-對(duì)羥基-苯甘氨酸是利用微生物體內(nèi)產(chǎn)生的D-海因酶DHase 將DL-對(duì)羥基苯海因水解成為N-氨甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸NC-D-p-HPG,然后用化學(xué)法或氨甲酰水解酶將NC-D-p-HPG水解脫去氨甲?;玫紻-對(duì)羥基-苯甘氨酸。酶轉(zhuǎn)化法理論上能將底物100%地轉(zhuǎn)化為單一對(duì)映體的氨基酸,但是現(xiàn)在能夠以高產(chǎn)率和高光學(xué)純度實(shí)現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的微生物菌種還很少。所以發(fā)明一種能夠促進(jìn)酶轉(zhuǎn)化法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的微生物菌種和利用該微生物菌種制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法是十分必要的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)酶轉(zhuǎn)化法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的微生物新菌種和利用該微生物新菌種制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種產(chǎn)堿桿菌 Alcaligenes sp. SHNUO1,菌種保存號(hào) CGMCC NO. 3872。采用上述產(chǎn)堿桿菌作為催化劑制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,包括下列步驟(1)取產(chǎn)堿桿菌 Alcaligenes sp. SHNUOl,CGMCC NO. 3872 細(xì)胞置于 pH 值為 6 10的磷酸鉀緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中;(2)向步驟⑴緩沖溶液中加入濃度為10 200mM的消旋體海因,反應(yīng)溫度20 50°C,反應(yīng)時(shí)間3 96小時(shí),得N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸;(3)將步驟(2)反應(yīng)液與NaNO2反應(yīng)后分離、純化得D-對(duì)羥基苯甘氨酸。步驟(1)中所述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞濃度為濕重5 100g/L。步驟O)中所述消旋體海因?yàn)閷?duì)羥基苯海因。
本發(fā)明的要點(diǎn)是從土壤中分離并經(jīng)過多輪篩選后獲得的新的產(chǎn)堿桿菌,該產(chǎn)堿桿菌菌種于2010年5月M日在中國普通微生物菌種保藏中心保藏,保藏號(hào)為CGMCC3872 ; 并利用該產(chǎn)堿桿菌的催化作用選擇性水解反應(yīng)制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸。本發(fā)明的具體實(shí)施方法是1、菌種的富集富集將取自各地的土樣加入到IOml無菌水中,均勻攪拌,待部分沉降后取約ImL 上部混合液加入富集培養(yǎng)基中,于,200r/min恒溫振蕩培養(yǎng)約48h。分離將經(jīng)富集培養(yǎng)得到的菌液稀釋適當(dāng)濃度,各取0. 2mL涂布于分離培養(yǎng)基上, 培養(yǎng)直到長出足夠大的菌落。純化挑取生長良好、菌落大小、形態(tài)、顏色不一的菌落劃線接種于普通細(xì)菌培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化;挑取典型單菌落,反復(fù)純化,得到純種。2、菌種的篩選雙層瓊脂法篩選將分離得到的各菌株點(diǎn)種于普通細(xì)菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)21h,覆蓋一薄層45°C 左右的含有底物及15g/L瓊脂的Tris-HCl,pH8. 0,作為上層,待凝固后于培養(yǎng)Mh。直接在菌落上滴加一滴濃度為100g/L的PDAB,對(duì)二甲氨基苯甲醛6mol/L HCl配制,5_10s內(nèi)呈特異的黃色者為陽性菌株。微孔快速篩選法復(fù)篩將上述得到的陽性菌株接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基斜面上二8°C培養(yǎng)21h。配制含底物 D-p-HPH的9g/L的Tris-HCl緩沖液,pH9. 0。在每個(gè)微孔內(nèi)加入底物液100 μ L,同時(shí)在另一孔內(nèi)加入不含底物的ΡΗ9. 0的Tris-HCl緩沖液作為空白對(duì)照。從斜面上各挑少許等量菌體分別加入2孔內(nèi),混勻,37°C下反應(yīng)0.證,然后在各孔中加入100g/L對(duì)二甲氨基苯甲醛 15μ L,5-10s出現(xiàn)特異黃色而對(duì)照無色者為陽性菌株。產(chǎn)物的薄層色譜測(cè)定用pH8. 0,0. 2mol/L的磷酸鈉鹽緩沖液配制DL-對(duì)羥基苯海因溶液,將50mL 6%的 DL-對(duì)羥基苯海因溶液,加入到各個(gè)含有陽性菌株的錐形瓶中,于37°C 150r/min振蕩反應(yīng) 42-4 ι。離心取上清液,滴加HCL調(diào)節(jié)pH至3,振蕩反應(yīng)池。用毛細(xì)管取轉(zhuǎn)化液點(diǎn)樣于薄層層析板上,同時(shí)分別以DL-對(duì)羥基苯海因,D-對(duì)羥基苯甘氨酸溶液點(diǎn)樣作對(duì)照,用正丁醇冰醋酸水體積比為4 1 1配制的層析劑展開,待溶劑展開到距頂端約IOmm時(shí)取出,在紫外燈下有D-對(duì)羥基苯甘氨酸條帶出現(xiàn)者確定為產(chǎn)海因酶的菌株,從中優(yōu)選一株活性和選擇性最高的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)和生理生化鑒定確定其屬于產(chǎn)堿桿菌。本發(fā)明制備的產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp. ) SHNUOl,在中國普通微生物菌種保藏中心保藏號(hào)為CGMCC NO. 3872。采用上述產(chǎn)堿桿菌做為催化劑制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,包括下列步驟(1)培養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp. ) SHNUO1, CGMCC N0. 3872,然后取上述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞置于緩沖溶液中;(2)向上述緩沖溶液中加入消旋體對(duì)羥基苯海因,經(jīng)催化水解產(chǎn)生D-N-氨甲酰-對(duì)羥基苯甘氨酸,經(jīng)亞硝酸鈉處理后得到D-對(duì)羥基苯甘氨酸;
(3)反應(yīng)液經(jīng)分離、純化得到目標(biāo)產(chǎn)物光學(xué)純D-對(duì)羥基苯甘氨酸。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,反應(yīng)體系中產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞濃度為5 IOOg(濕重)/L。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,反應(yīng)體系中消旋體海因的濃度為10 200mM。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,反應(yīng)溫度控制為20 50°C,反應(yīng)時(shí)間為3 96 小時(shí)。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,緩沖溶液為PH值為6 8的磷酸鉀緩沖溶液或 Tris-HCl緩沖溶液。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,反應(yīng)體系中可加入質(zhì)量為反應(yīng)體系質(zhì)量0. 2% 10 %的有機(jī)助溶劑,所述有機(jī)助溶劑選自甲醇、乙醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺中的一種或一種以上的混合物。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,消旋體海因?yàn)閷?duì)羥基苯海因。本發(fā)明采用新的產(chǎn)堿桿菌做為催化劑對(duì)消旋體海因進(jìn)行對(duì)映選擇性水解反應(yīng)結(jié)合化學(xué)處理制備出> 99%的高光學(xué)純度D-對(duì)羥基苯甘氨酸。該催化劑易于制備、反應(yīng)條件溫和,具有工業(yè)應(yīng)用開發(fā)前景。在實(shí)施例中D-對(duì)羥基苯甘氨酸產(chǎn)率可達(dá)90%,對(duì)映體過量值大于99%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、產(chǎn)堿桿菌選育方法簡(jiǎn)單,易于制備。2、采用本發(fā)明產(chǎn)堿桿菌催化效果好,制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸產(chǎn)率高達(dá)90 %,D-對(duì)羥基苯甘氨酸成本低。3、制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸無污染物排放,有利于保護(hù)環(huán)境。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp. ) SHNUO1, CGMCC NO. 3872是一種屬于細(xì)菌類桿菌屬的菌株,該菌株是從土壤中分離,并經(jīng)過多輪篩選后獲得的,于2010 年5月M日在中國普通微生物菌種保藏中心保藏,保藏號(hào)為CGMCC3872。本發(fā)明的菌種具有如下的微生物學(xué)特征該菌株在普通細(xì)菌固體培養(yǎng)基上生長形成的菌落,外觀溫潤,顏色乳白色,邊緣處為細(xì)致的不規(guī)則小鋸齒狀,側(cè)面觀為圓滑的大弧度凸起。該菌株在液體培養(yǎng)基中生長時(shí),會(huì)形成菌環(huán),說明其為好氧細(xì)菌。在10xl00(油鏡)倍的光學(xué)顯微鏡下,可分辨出該菌為單個(gè)的桿菌。經(jīng)革蘭氏染色,顯示該菌株為革蘭氏陰性菌。根據(jù)16S rDNA分子生物學(xué)鑒定,該細(xì)菌與產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)的同源性為 99%。采用上述產(chǎn)堿桿菌作為催化劑制備光學(xué)純手性N-氨甲酰-氨基酸的方法,包括下列步驟a.培養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.) SHNUO1,CGMCC NO. 3872,然后取上述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞置于緩沖溶液中;b.向上述緩沖溶液中加入消旋體對(duì)羥基苯海因,經(jīng)催化對(duì)映選擇性水解產(chǎn)生相應(yīng)的D-N-氨甲酰-對(duì)羥基苯甘氨酸,之后在酸性條件下加入亞硝酸鈉將D-N-氨甲酰-對(duì)羥基苯甘氨酸轉(zhuǎn)化為D-對(duì)羥基苯甘氨酸;c.反應(yīng)液經(jīng)分離、純化得到目標(biāo)產(chǎn)物光學(xué)純D-對(duì)羥基苯甘氨酸。反應(yīng)體系中所述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞濃度為5 IOOg(濕重)/L。反應(yīng)體系中所述所述消旋體海因的濃度為10 200mM。步驟b的反應(yīng)溫度控制為 20 50°C,反應(yīng)時(shí)間為3 96小時(shí)。所述緩沖溶液為pH值為6 8的磷酸鉀緩沖溶液或 Tris-HCl緩沖溶液。實(shí)施例1 細(xì)菌培養(yǎng)基配方為甘油10. Og/L,酵母膏 10. Og/L, KH2PO4 2. Og/L, MgSO4 0. 5g/ L,pH 7.0。取4°C保存的產(chǎn)堿桿菌斜面菌種,挑取一環(huán)接種至裝有50ml培養(yǎng)基的250ml搖瓶中,在30°C下,160rpm振搖培養(yǎng)Mh,離心收獲細(xì)胞。發(fā)酵液酶活力約為10 20U/L,細(xì)胞濃度濕重5 10g/L,單位細(xì)胞的酶活力為2U/g濕細(xì)胞。細(xì)胞活力單位的定義為在30°C, PH 7.0的條件下,每分鐘催化對(duì)羥基苯海因水解生成1.0 μ mol N-氨甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸所需的酶量。實(shí)施例2 取濕重1. Og的上述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞,懸浮于9. 5ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. 1M,pH 8. 5),加入200mg對(duì)羥基苯海因和0. 5ml 二甲基亞砜,反應(yīng)混合物在30°C、160r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng),間歇取樣用液相色譜(色譜柱為Chromasil C18色譜柱)分析對(duì)羥基苯海因和N-甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸含量,反應(yīng)12小時(shí)后,N-甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸的分析產(chǎn)率為 95%。實(shí)施例3 取濕重20. Og的上述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞,懸浮于190ml磷酸鈉鹽緩沖溶液中(0. 1M,pH 8. 5),加入4g對(duì)羥基苯海因和IOml 二甲基亞砜,反應(yīng)混合物在30°C、160r/min的恒溫?fù)u床上振搖反應(yīng),將反應(yīng)18-20hr的反應(yīng)液離心,取上清,在冰水浴中緩慢滴加濃鹽酸(6mol/ L),將pH值調(diào)為pH 3.0左右。然后,用現(xiàn)配制的10%的NaNO2溶液,繼續(xù)在冰水浴的條件下緩慢滴加:3hr,其中,濃鹽酸與10%的NaNO2溶液的體積比大約為4 5。滴加完畢后,繼續(xù)反應(yīng)air。采用國產(chǎn)732陽離子交換樹脂純化產(chǎn)物,最終得到D-對(duì)羥基苯甘氨酸收率為 90%, [a ]D20(C = 1,lmol/1 HCl) = 160. 5(文獻(xiàn)值-155 -161)。以上所述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明,而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換,均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)堿桿菌 Alcaligenes sp. SHNUO1,菌種保藏號(hào) CGMCCN0. 3872。
2.一種利用產(chǎn)堿桿菌制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,包括以下步驟(1)取產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp. SHNUOLCGMCC NO. 3872 細(xì)胞置于 pH 值為 6 10 的磷酸鉀緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液中;(2)向步驟(1)緩沖溶液中加入濃度為10 200mM的消旋體海因,反應(yīng)溫度20 50°C,反應(yīng)時(shí)間3 96小時(shí),得N-氨甲酰-D-氨基酸;(3)將步驟(2)產(chǎn)物與NaNO2反應(yīng)后分離、得D-對(duì)羥基苯甘氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用產(chǎn)堿桿菌制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,其特征在于步驟(1)中所述產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞濃度為濕重5 100g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用產(chǎn)堿桿菌制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法,其特征在于步驟O)中所述消旋體海因?yàn)閷?duì)羥基苯海因。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)堿桿菌及其用途,一種產(chǎn)堿桿菌以及利用其制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法。已有技術(shù)制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸方法的缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜、成本高、對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重。本發(fā)明從土壤中分離并篩選后獲得菌種保存號(hào)CGMCC No.3872的產(chǎn)堿桿菌。制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法為取產(chǎn)堿桿菌細(xì)胞置于磷酸鉀緩沖溶液中;向緩沖溶液中加入消旋體海因,反應(yīng)溫度20~50℃,時(shí)間3~96小時(shí);將反應(yīng)液與NaNO2反應(yīng)后分離、純化得D-對(duì)羥基苯甘氨酸。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)堿桿菌選育方法簡(jiǎn)單;制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸效果好,產(chǎn)率高達(dá)90%;D-對(duì)羥基苯甘氨酸成本低;無污染物排放,有利于保護(hù)環(huán)境。
文檔編號(hào)C12R1/05GK102399709SQ201110240379
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者孫婧, 徐毅, 陳建波 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)