專利名稱：一種抗凝血水蛭肽的酶解制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物活性肽的酶解制備領(lǐng)域，具體涉及一種抗凝血水蛭肽的酶解制備方法。
背景技術(shù)：
菲牛蛭，俗稱金邊螞蟥、蟥蜞、牛蜞，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南特別是廣東、廣西和海南等地區(qū)，是一味經(jīng)典的傳統(tǒng)中藥，有破血、逐瘀、通經(jīng)的功效，用于治療癥瘕痞塊、血瘀閉經(jīng)、跌打損傷等病癥。李時(shí)珍的《本草綱目》記載咸走血，苦勝血；水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝經(jīng)血分藥，故能通肝經(jīng)聚血。菲牛蛭主要成分為膠原蛋白，還含有少量脂肪酸和微量礦物質(zhì)?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，菲牛蛭發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是其體內(nèi)的天然水蛭素，而天然水蛭素是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)中最強(qiáng)的特異性天然抗凝血物質(zhì)，對(duì)人類心腦血管疾病尤其是腦血栓等血栓性疾病有特效，然而水蛭素是一種分泌型生物活性物質(zhì)，僅存在于菲牛蛭頭部的唾液腺及其所分泌的唾液中。長(zhǎng)期以來，國(guó)內(nèi)對(duì)天然水蛭素的提取、分離研究難以有所突破，大都是取水蛭頭部加有機(jī)溶劑提取、或整體搗碎成泥漿狀后加溶劑提取、或活體生理鹽水提取、或用機(jī)械方法從吸飽血后的水蛭中擠出血漿提取，然后經(jīng)復(fù)雜的分離純化方法得到水蛭素粗品。這些方法存在提取收率低、原料浪費(fèi)、純度低、工藝復(fù)雜、周期長(zhǎng)、成本過高等的缺點(diǎn)。因此，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上銷售的各種天然水蛭素純度、活性水平層次不齊， 而且價(jià)格非常昂貴，不利于水蛭素類抗凝血活性物質(zhì)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。正是基于目前產(chǎn)品價(jià)格高和活性低等情況，迫切需要開發(fā)一種能夠降低成本、簡(jiǎn)單可行的制備方法。由于水蛭素是由菲牛蛭的唾液腺分泌而來，因此在菲牛蛭軀體膠原蛋白中必然含有抗凝血活性的功能區(qū)片段。于是采取可控酶解的方法，通過生物蛋白酶對(duì)菲牛蛭軀體膠原蛋白的催化水解作用，就有可能把其中所隱藏的抗凝血的功能區(qū)肽片段釋放出來，從而制備出具有抗凝血活性的肽。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于生物活性肽的開發(fā)極為活躍，已從蛋白質(zhì)水解液中分離出了高F值寡肽、ACE抑制肽、醒酒肽、抗氧化肽等。可以說，酶解制備抗凝血活性肽具有十分廣闊的前景和重大的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗凝血水蛭肽的酶解制備方法，本發(fā)明方法能夠?qū)崿F(xiàn)原料的多重利用，并具有高活性、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、反應(yīng)過程簡(jiǎn)單可控的生物催化劑制備抗凝血肽的新方法。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
一種抗凝血水蛭肽的酶解制備方法，包括如下步驟取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加入水中勻漿，水和該菲牛蛭的重量比為廣6:1，將勻漿液以lOOOOr/min高速離心 IOmin后，過濾沉淀，按沉淀與水的用量之比為3 15g:100ml混合于反應(yīng)器中，控制pH值為7. 0 10. 0，再加入堿性蛋白酶為生物催化劑，該堿性蛋白酶與菲牛蛭軀體中膠原蛋白的重量之比為1 8:100，反應(yīng)溫度為40 70 °C、振蕩速度為100 300 rpm、反應(yīng)1 5h后，冷凍干燥，即可得到所需抗凝血水蛭肽粉。所述勻漿時(shí)，加入的水與菲牛蛭的重量比為廣4:1。所述菲牛蛭軀體膠原蛋白與水的用量之比為6 12g: IOOml0所述堿性蛋白酶與菲牛蛭軀體膠原蛋白的重量之比為2 6:100。所述反應(yīng)溫度控制在50 70 °C。所述反應(yīng)體系pH值控制為7. 5 9.0。所述反應(yīng)器振蕩速度為100 200 rpm。所述反應(yīng)時(shí)間控制在1 池。本發(fā)明的原理在堿性條件下，以水解酶作為催化劑，催化菲牛蛭軀體膠原蛋白進(jìn)行水解反應(yīng)，得到抗凝血水蛭肽。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果
(1)對(duì)菲牛蛭勻漿液離心后所得上清液用來提取天然水蛭素，而對(duì)沉淀的軀體膠原蛋白酶解，避免了以往提取水蛭素過程中對(duì)菲牛蛭軀體原料的浪費(fèi)，從而實(shí)現(xiàn)原料的多重利用。(2)用蛋白酶對(duì)新鮮菲牛蛭軀體膠原蛋白進(jìn)行酶解，可以借助生物催化功能打開菲牛蛭軀體膠原蛋白中隱藏的抗凝血活性位點(diǎn)，得到抗凝血肽片段，反應(yīng)過程簡(jiǎn)單可控、產(chǎn)物易分離；
(3)整個(gè)制備過程中，反應(yīng)條件溫和，未使用有機(jī)試劑，無含堿廢液排放，環(huán)境友好。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。實(shí)施例1
取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加4倍水混合于打漿機(jī)中勻漿，將勻漿液 10000r/min離心lOmin，上清液冷藏備用，稱取9g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，調(diào)pH 至8. O JnAAlcalase 2. 4L酶(堿性蛋白酶，諾維信公司生產(chǎn))，置于55°C、150 rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)1. 5h后，在90°C水浴鍋中滅酶lOmin，冷卻后調(diào)pH至7. 0，冷凍干燥后可得到抗凝血活性大于500AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。實(shí)施例2
取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加3倍水混合于打漿機(jī)中勻漿，將勻漿液 10000r/min離心lOmin，上清液冷藏備用，稱取12g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，調(diào)pH 至8. 5，加入Alcalase2. 4L酶，置于55°C、150 rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)2h后，在 90°C水浴鍋中滅酶lOmin，冷卻后調(diào)pH至7. 0，冷凍干燥后可得到抗凝血活性大于600AT-U/ g的抗凝血水蛭肽粉。實(shí)施例3
取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加2倍水混合于打漿機(jī)中勻漿，將勻漿液 10000r/min離心lOmin，上清液冷藏備用，稱取15g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，調(diào) pH至9. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于55°C、150 rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)2. 5h后，在90°C水浴鍋中滅酶lOmin，冷卻后調(diào)pH至7. 0，冷凍干燥后可得到抗凝血活性大于 600AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。實(shí)施例4
取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加4倍水混合于打漿機(jī)中勻漿，將勻漿液 10000r/min離心lOmin，上清液冷藏備用，稱取9g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，調(diào)pH 至8. 5，加入Alcalase2. 4L酶，置于60°C、150 rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)2. 5h 后，在90°C水浴鍋中滅酶lOmin，冷卻后調(diào)pH至7. 0，冷凍干燥后可得到抗凝血活性大于 600AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。實(shí)施例5
取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加3倍水混合于打漿機(jī)中勻漿，將勻漿液 10000r/min離心lOmin，上清液冷藏備用，稱取12g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，調(diào)pH 至9. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于60°C、150 rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)2h后，在 90°C水浴鍋中滅酶lOmin，冷卻后調(diào)pH至7. 0，冷凍干燥后可得到抗凝血活性大于600AT-U/ g的抗凝血水蛭肽粉。實(shí)施例6
取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加4倍水混合于打漿機(jī)中勻漿，將勻漿液 10000r/min離心lOmin，上清液冷藏備用，稱取15g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，調(diào)pH 至8. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于60°C、150 rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)2h后，在 90°C水浴鍋中滅酶lOmin，冷卻后調(diào)pH至7. 0，冷凍干燥后可得到抗凝血活性大于600AT-U/ g的抗凝血水蛭肽粉。實(shí)施例7
取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加3倍水混合于打漿機(jī)中勻漿，將勻漿液 10000r/min離心lOmin，上清液冷藏備用，稱取9g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，調(diào)pH 至9. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于65°C、150 rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)2h后，在 90°C水浴鍋中滅酶lOmin，冷卻后調(diào)pH至7. 0，冷凍干燥后可得到抗凝血活性大于550AT-U/ g的抗凝血水蛭肽粉。實(shí)施例8
取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加4倍水混合于打漿機(jī)中勻漿，將勻漿液 10000r/min離心lOmin，上清液冷藏備用，稱取12g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，調(diào) pH至8. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于65°C、150 rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)2. 5h 后，在90°C水浴鍋中滅酶lOmin，冷卻后調(diào)pH至7. 0，冷凍干燥后可得到抗凝血活性大于 550AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。實(shí)施例9
取冷藏時(shí)間不超過Mh的新鮮菲牛蛭，加3倍水混合于打漿機(jī)中勻漿，將勻漿液 10000r/min離心lOmin，上清液冷藏備用，稱取15g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，調(diào) pH至8. 5，加入Alcalase2. 4L酶，置于65°C、150 rpm的水浴恒溫振蕩器內(nèi)振蕩，反應(yīng)1. 5h 后，在90°C水浴鍋中滅酶lOmin，冷卻后調(diào)pH至7. 0，冷凍干燥后可得到抗凝血活性大于 500AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抗凝血水蛭肽的酶解制備方法，其特征在于，包括如下步驟取冷藏時(shí)間不超過24h的新鮮菲牛蛭，加入水中勻漿，水和該菲牛蛭的重量比為廣6:1，將勻漿液以IOOOOr/ min高速離心IOmin后，過濾沉淀，按沉淀與水的用量之比為3 15g: IOOml混合于反應(yīng)器中，控制PH值為7. 0 10. 0，再加入堿性蛋白酶為生物催化劑，該堿性蛋白酶與菲牛蛭軀體中膠原蛋白的重量之比為1 8:100，反應(yīng)溫度為40 70 °C、振蕩速度為100 300 rpm、反應(yīng)1 證后，冷凍干燥，即可得到所需抗凝血水蛭肽粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述勻漿時(shí)，加入的水與菲牛蛭的重量比為廣4:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述菲牛蛭軀體膠原蛋白與水的用量之比為6 12g: 100ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述堿性蛋白酶與菲牛蛭軀體膠原蛋白的重量之比為2 6:100。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述反應(yīng)溫度控制在50 70°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述反應(yīng)體系PH值控制為7.5 9. 0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述反應(yīng)器振蕩速度為100 200rpm 。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述反應(yīng)時(shí)間控制在1 池。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗凝血水蛭肽的酶解制備方法，包括取冷藏時(shí)間不超過24h的新鮮菲牛蛭，加入水中勻漿，水和菲牛蛭的重量比為1~6:1，勻漿液以10000r/min高速離心10min后，過濾沉淀，按沉淀與水的用量之比為3～15g:100ml混合于反應(yīng)器中，控制pH值為7.0～10.0，再加入堿性蛋白酶，該堿性蛋白酶與菲牛蛭軀體中膠原蛋白的重量之比為1～8:100，反應(yīng)溫度為40～70℃、振蕩速度為100～300rpm、反應(yīng)1～5h后，冷凍干燥，即可。本發(fā)明突破天然水蛭素類抗凝血活性物質(zhì)來源的局限性，實(shí)現(xiàn)了原料的多重利用，具有產(chǎn)品活性高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、反應(yīng)過程簡(jiǎn)單可控等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102277407SQ201110242019
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者吳暉, 賴富饒, 鐘超 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)