專利名稱：從刮宮樣品中獲取人宮內膜間充質干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于干細胞分離培養(yǎng)及保存相關技術。
背景技術：
干細胞技術是當今生命科學中最熱門的技術之一，其研究內容幾乎涉及所有生命科學的生物醫(yī)學領域，除了在細胞治療、組織/器官移植和基因治療中發(fā)揮重要作用外，還在發(fā)現新基因、基因功能分析、發(fā)育生物學模型及新藥開發(fā)等方面產生重要影響。近幾年來，干細胞的研究取得了重大突破，1999和2000年，世界最權威的美國《kience》雜志連續(xù)2年將干細胞和人類基因組計劃列為當年的10大科學突破。干細胞很可能在醫(yī)學領域引發(fā)革命性進步，因而具有不可估量的醫(yī)學價值，干細胞和人類基因組計劃將同時成為新世紀最具有發(fā)展和應用前景的領域。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，簡稱MSCs)是來源于成熟組織中的多能干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，同時又因為其低免疫原性而成為細胞移植和組織工程的新型種子細胞，具有廣闊的應用前景。眾所周知，子宮內膜細胞系具有很強的自我更新能力。自1978年I^ianishnikov 提出存在子宮內膜干細胞以來，人們一直沒有停止過研究子宮內膜干細胞的腳步， 1993-2002子宮內膜干細胞的存在有了臨床實踐的支持，進一步肯定了研究子宮內膜干細胞的重要性，直到2004年Chan等證實了子宮內膜干細胞的存在，極大的激發(fā)了研究者們的研究熱情。前期子宮內膜干細胞的研究材料主要是取自體內的子宮內膜組織，既不方便又限制了研究進展。2006年日本研究人員從女性月經血中成功提取出干細胞，掀起了研究經血來源子宮內膜干細胞的熱潮。經美日中等多國科學家的研究證實在隨女性經血脫落的子宮內膜組織中，具有相當數量的間充質干細胞——宮內膜干細胞，數量為骨髓來源的30 倍；這些干細胞活力更強，更強的自我更新和增殖能力(如心肌細胞的培育效率為傳統(tǒng)利用骨髓細胞培育的100倍)，分化潛能更接近胚胎干細胞。有研究發(fā)現子宮內膜的再生細胞 (ERC)不僅具有幾乎每M小時復制一次的驚人速率，而且它們產生獨特生長因子的速率， 比來自于臍帶血的干細胞要大上10萬倍。從人刮宮術獲得的體液(包括血液)中就含有隨之一起刮取得到的子宮內膜組織，上述理論研究使得從該體液中獲取子宮內膜干細胞成為可能。人流是指用手術的方法終止妊娠，手術方法之一就是鉗刮術，通過刮宮可以在取出少量胚胎組織的同時獲得一定的子宮內膜組織，而隨這些刮取獲得的子宮內膜組織一起獲得的體液便成了獲取宮內膜干細胞的最好來源。相比而言，因為供體的年齡原因，該干細胞可能會擁有更強的增殖能力和更好的活力，除此之外，也可以使得原來被丟棄的體液變廢為寶，無論是從研究角度還是供體角度都是有百利而無一害。如果把這些干細胞通過科學的方法儲存起來，在女性未來的一生中，一旦發(fā)生肝硬化、糖尿病、心衰竭、腫瘤等重大疾病或意外嚴重傷害時，就可立即做自體干細胞的移植，恢復健康，減輕自己及家人的經濟負擔，減輕社會負擔，還有可能實現女性夢寐以求的“青春常在”、“紅顏永駐”的美好愿望，擁有高品質的人生。女性的宮內膜干細胞不但可用于本人，還可為她的子女、相關親屬(如堂表弟妹，甚至父母)等人的臨床應用。由于國內實行獨生子女政策，一旦患血液系統(tǒng)惡性疾病和遺傳性疾病，就只能采用異基因干細胞移植，宮內膜干細胞是異基因干細胞移植最豐富最好的資源。一旦儲存了宮內膜干細胞，就相當于為其整個家族建立了一個預防和治療腫瘤及其它相關需干細胞治療疾病的生命銀行。儲存的宮內膜干細胞還可供全國和全世界患者選擇作干細胞移植用， 并逐步替代價格昂貴、難以找到配型相合的骨髓干細胞。全世界等待干細胞移植的患者數以億計，僅白血病在我國的發(fā)病率就達十萬分之三、四，即每年新增四萬名左右的患者，而累計的白血病患者約有四百萬，其中大部分是兒童，他們都急需通過干細胞移植來救治。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現有干細胞來源困難或受倫理限制等問題，尋找一種更為高效的來源廣泛且不受倫理限制的宮內膜干細胞分離和培養(yǎng)方法。在此基礎上，擴增和純化干細胞，并對所培養(yǎng)的干細胞進行形態(tài)和功能鑒定，從而建立具有干細胞特性的新型干細胞株，然后再將優(yōu)質的干細胞資源儲存。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種從刮宮樣品中獲取人宮內膜間充質干細胞的方法，包括以下步驟1)、樣品收集將人流產物與采集液按照1 0. 9 1. 1的體積比混合；得刮宮樣品；采集液為在每500mL的采集液中含有400單位肝素以及濃度為％ig/mL的環(huán)丙沙星和濃度為lOmg/mL的卡那霉素，其余為DMEM培養(yǎng)基Gnvitrogen公司)；2)、宮內膜干細胞分離培養(yǎng)A、樣本的初處理將刮宮樣品于3 5°C進行搖床孵育22 沈小時，然后進行過濾(過濾目的是為了濾除刮宮樣品中的絨毛和蛻膜、胚胎組織)；得濾液；B、利用密度梯度離心法，收集血液中的碎片組織及單核細胞，依次進行以下步驟濾液1500 2500g離心8 12分鐘，分別得位于上層的上清和位于下層的血液；取部分上清用于病毒檢測，如病毒檢測為陽性，則結束整個操作；如病毒檢測為陰性，則繼續(xù)進行以下操作去除其余上清后，得血液；用PBS緩沖液稀釋血液，PBS緩沖液與血液的體積用量比為1. 5 2. 5 1 ；將稀釋后的血液加至人淋巴細胞分離液(市購產品)上，稀釋后的血液和分離液的體積比為1.8 2. 2 1，600 IOOOg離心12 18分鐘，離心完畢后，離心管內出現明顯的分層；吸出位于中間的單核細胞層(白膜層)，用PBS緩沖液洗滌細胞后離心(洗滌2 次，每次均是400g離心10分鐘)，最后用Chang完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液；C、細胞的培養(yǎng)將上述步驟所得的單細胞懸液接種于Chang完全培養(yǎng)基中，細胞接種密度為 IXlO5 lX106/ml，置于37°C、飽和濕度、體積分數為5%的(X)2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)時間為4 5天；Chang完全培養(yǎng)基由以下成分組成65ml的MEM alpha (MEM-alpha培養(yǎng)基， Invitrogen ^w]), 18ml ^ Chang B ( ) (Irvine Scientific ^w]) ,2ml ^ Chang 0( 液)(Irvine Scientific 公司)Uml 的 Penicillin/Str印tomycin (青霉素 / 鏈霉素硫酸鹽，Invitrogen 公司)、Iml 的 L-glutamine (L-谷氨酰胺，Invitrogen 公司，濃度為 200mM) 和15ml的ES-FBS (胎牛血清，Invitrogen公司)；D、細胞擴增和純化待步驟幻的4 5天的培養(yǎng)結束后，更換培養(yǎng)基，棄除未貼壁細胞；根據細胞生長狀況，每3 4天全量換液一次，待細胞生長達到80% 90%融合時，用重量百分含量為 0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞，然后按5000 6000個/cm2密度傳代接種培養(yǎng)，并記為 Pi代；上述過程在37°C、飽和濕度、體積分數為5%的CO2培養(yǎng)箱中進行；3)、細胞凍存待上述步驟所得的Pl代細胞鋪滿瓶底后，用重量百分含量為0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞，用預冷的凍存液重懸細胞，得細胞懸液，細胞懸液中細胞的濃度是1 2*106/ml ；并分裝于4支2ml凍存管中；凍存液為DMSO (Calbiochem公司)與Chang完全培養(yǎng)基按照19的體積比混合而得；將上述細胞懸液進行如下凍存程序(即，將上述4支凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序)第一步、4°C，等待(即溫度降至4°C后，進入第二步)；第二步、1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體)；第三步、10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步、1. 0°C /分鐘降至-40. 0°C (箱體)；第五步、10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結束；得凍存樣本；將所述凍存樣本放入液氮儲存罐保存。在本發(fā)明中，經過培養(yǎng)貼壁生長的部分為目標細胞。現在世界上大部分干細胞庫的做法是從人體取得干細胞(或混有干細胞的其他組織，人臍帶、羊水、外周血等)后，稍加分離即進行凍存，等到需要時再將凍存的細胞復蘇、培養(yǎng)增殖。本發(fā)明的優(yōu)越之處在于從刮宮樣品中取得體液標本后，經過密度梯度分離后，去除大部分紅細胞，再進行純化擴增培養(yǎng)，獲得純度較高、數量較大的目標細胞即宮內膜干細胞(人宮內膜間充質干細胞)，再進行凍存，這樣就保證了凍存細胞的質量，且以后需要用到該份細胞，復蘇后的培養(yǎng)時間也較其他方法短得多(圖2復蘇細胞的生長曲線，顯示細胞的增殖能力)。本發(fā)明的優(yōu)越之處在于干細胞資源來自刮宮術后廢棄的體液，采集方便，變廢為寶，其所含干細胞含量豐富，增殖較快；通過高效的分離方法能夠保證被儲存的干細胞的質
So在現有技術中，蛻膜組織和子宮內膜活檢組織中分離得到干細胞沒有進行嚴格的間充質干細胞鑒定。特別是子宮內膜活檢時，一般是在進行常規(guī)例行病理診斷時順便獲得樣品。而本發(fā)明所采用的是刮宮的方法，從刮宮的體液中分離宮內膜干細胞，進過包括微生物的清除、干細胞鑒定，培養(yǎng)、擴增和儲存等技術。在目前還沒有人報道。與從經血中分離宮內膜干細胞相比，減少了微生物污染的可能性，因為刮宮是在無菌的環(huán)境下進行的，由此所獲得的細胞活力更高。


下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1是實施例1中培養(yǎng)不同時間的宮內膜干細胞放大100倍的顯微照片；A 為 PO 代換液 4 天，100X ；B 為 Pl 代 3 天，100X ；C 為 P2 代 3 天，100X ；D 為 P7 代 3 天，100X ；E 為 P22 代 3 天，100X ；圖2復蘇細胞生長曲線；圖3是實施例1中流式細胞分析結果圖。
具體實施例方式實施例1 通過刮宮術培養(yǎng)獲取人宮內膜干細胞的分離、培養(yǎng)、擴增及凍存、復蘇1)、準備采集套裝和配制培養(yǎng)基負壓采集瓶(無菌)。采集液在2000mg的環(huán)丙沙星、5000mg的卡那霉素和400單位肝素中添加DMEM基礎培養(yǎng)基(即DMEM培養(yǎng)基)，直至定容至500ml，得采集液。S卩，該500ml采集液中含有400單位肝素以及濃度為％ig/mL的環(huán)丙沙星和濃度為 10mg/mL的卡那霉素。使用前，該采集液于2 4°C環(huán)境下存放。配制Chang完全培養(yǎng)基在無菌條件下，在無菌容器中加入65mL MEM-alpha 培養(yǎng)基(MEM alpha, Invitrogen 公司)、18mL Chang B 基液(Irvine Scientific 公司)、2mL Chang C基液(Irvine kientific公司)、ImL青霉素硫酸鹽或者鏈霉素硫酸鹽(Penicillin/Sti^ptomycin，Invitrogen 公司)、lmL 濃度為 200mM 的 L-谷氨酰胺 (L-glutamine, Invitrogen 公司)、15mL ES-FBS (胎牛血清，Invitrogen 公司)，充分混勻， 置4°C冰箱待用。2)、樣品采集在志愿者02歲，已簽訂知情同意書)術前1個小時到達手術室。手術開始前1 分鐘，將負壓采集瓶放至負壓吸引器合適的位置。在嚴格消毒和無痛麻醉下，利用負壓吸引管吸引子宮腔內的胎物至負壓采集瓶中，再用刮匙清理宮腔并進行收集，即，吸出物是由絨毛、蛻膜、子宮內膜組織碎片、胚胎組織和一定量的體液(血液)等組成，以此作為人流產物，此為常規(guī)技術。待手術結束后，加等體積的采集液至負壓采集瓶中(即將人流產物與采集液按照1 1的體積比混合，得刮宮樣品)，保持低溫狀態(tài)(4-10°C )盡快送至實驗室。刮宮樣品送至實驗室后，將負壓采集瓶中的刮宮樣品轉移至新的50ml離心管中， 放入搖床孵育，溫度設置為4°C。3)、病毒和無菌檢查待刮宮樣品搖床孵育滿24h后，將孵育所得的刮宮樣品先進行過濾，以濾除絨毛、 蛻膜、胚胎組織，并將過濾過所得物混勻；2000g離心10分鐘；分別得位于上層的上清和位于下層的血液；取所得的部分上清液按照血培養(yǎng)法進行厭氧菌和需氧菌、霉菌檢查，并鑒定，若為陽性結果，則結束整個儲存宮內膜干細胞的程序；同時，取所得的部分上清液通過ELASA進行病毒檢測，檢測范圍包括HBsAg、HBcAb、HCVAb、HIV-A、TP-PA、CMV-IgM，若為陽性結果，則結束整個儲存宮內膜干細胞的程序。取位于下層的血液進入以下步驟進行分離培養(yǎng)。即，進行病毒、無菌檢查和進行血液分離培養(yǎng)為同時分別進行，由于病毒和無菌檢查需要一定的時間，如果陽性結果，則無需繼續(xù)進行對血液的分離培養(yǎng)。4)、宮內膜干細胞分離培養(yǎng)將上述位于下層的血液(即將上述2000g離心10分鐘所得物去除所有的上清后)，利用密度梯度離心分離子宮碎片組織及單核細胞，具體如下首先用PBS緩沖液按一定比例(PBS緩沖液與血液的體積比為2 1)稀釋血液細胞，電動移液器吹打混勻；得稀釋后血液；在超凈工作臺中取干凈離心管，轉移15mL人淋巴細胞分離液至每根50ml離心管中；鋪層加樣將稀釋后的血液小心的加至已倒好的人淋巴細胞分離液上(加樣時動作要輕柔，避免沖散分層液面或與分層液面混合而影響分離效果)，稀釋后血液和人淋巴細胞分離液的體積比為2 1 ；配平離心管，800g離心15分鐘，離心機升降速要調至最低速擋，確保離心穩(wěn)定，分層清晰；提取單個核細胞離心完畢后，離心管內出現明顯的分層，由下到上依次為紅細胞層、粒細胞層、分離液層、單核細胞(MNC)層和血漿層；吸出單核細胞層(可見部分碎片組織)把吸管或移液管直接伸入單核細胞層，先吸該層中央部分細胞，再吸取四周細胞，動作要輕柔，保證不把該層細胞吹散。如果分離液層和MNC層呈乳白色，界面不清楚，提示含有較多單核細胞，酌情吸取分離液層，速度要緩慢，確保不吸取到紅細胞層；洗滌細胞吸出的單核細胞混有部分細胞分離液，需用PBS緩沖液加以洗滌；用電動移液器加PBS緩沖液將細胞稀釋兩倍以上，混勻，400g離心10分鐘；離心完畢后，小心取出離心管，去除上清；重復上述步驟一次；細胞計數將以上所得細胞充分混勻，用臺盤藍染色，計數活細胞；接種細胞根據細胞計數結果，調整細胞密度至2*105/ml接種于75cm2培養(yǎng)瓶內(內裝IOml的Chang完全培養(yǎng)基)。當然，接種時的細胞密度可采用l*105_l*106/ml。 Chang完全培養(yǎng)基的體積比為=Vmem
alpha * ^Chang B * ^Chang C * ^Penicillin/Streptomycin * ^L-glutamine200,1 VES_FBS = 65 18 2 1 1 15 (具體如步驟1)中的配制Chang完全培養(yǎng)基所述)O5)細胞擴增和純化細胞培養(yǎng)于75cm2培養(yǎng)瓶中(內設含有密度為2*105/ml細胞的Chang完全培養(yǎng)基10ml)，置于培養(yǎng)箱內，瓶蓋擰松半圈，確保瓶內空氣與培養(yǎng)箱內空氣相通，保持培養(yǎng)箱 37 °C、飽和濕度、CO2體積濃度5%的狀態(tài)開始培養(yǎng)。4天后，從(X)2培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶，在無菌條件下去除瓶中的培養(yǎng)基，棄除未貼壁細胞，添加IOmL Chang完全培養(yǎng)基到培養(yǎng)瓶中，再次放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據細胞生長情況，每3-4天全量換液一次(即全量更換Chang完全培養(yǎng)基一次)。待細胞達到 80%-90%融合時，在每個培養(yǎng)瓶中加入ImLO. 25% (質量濃度)的胰蛋白酶消化，水平方向輕輕搖晃，使胰酶鋪滿平底，作用1分鐘后，倒置顯微鏡下觀察消化效果，待大部分細胞 (即80 % 90 % )縮至圓形后，再加入IOmL Chang完全培養(yǎng)基終止消化；然后按5000-6000 個/cm2密度傳代接種培養(yǎng)，并記為Pl代。傳代培養(yǎng)過程中，根據細胞生長情況，每3-4天進行全量或半量換液，直至細胞再次達到融合(即細胞達到80% -90%融合時)，細胞鋪滿瓶底，重復以上操作進行傳代，記為 P2代，依此操作進行傳代。細胞原代培養(yǎng)3-4天全量換液后，去除未貼壁細胞，鏡下觀察，可見較多幾個細胞聚集在一起的克隆，細胞增殖迅速，其倍增時間大約為M-36小時，2天后細胞形態(tài)呈均勻長梭形，培養(yǎng)4-5天后細胞可達到80% -90%融合，細胞呈漩渦狀分布。傳代后細胞M小時內完全貼壁，3-4天可鋪滿瓶底，繼續(xù)傳代。圖1顯示了培養(yǎng)傳代過程中的細胞形態(tài)圖A原代培養(yǎng)4天，換液后2天的細胞形態(tài)圖，可見細胞形態(tài)較多，有圓形、多角形、梭形等，此時細胞較雜；B是Pl代細胞傳代后3 天的圖，細胞形態(tài)趨于一致；C是P2代細胞傳代后3天的圖，D是P7代細胞傳代后3天的圖， 細胞呈漩渦狀排列，此時細胞純度較高；E是P22代細胞傳代后3天的圖，細胞密度較低，增殖速度開始減慢。以上結果說明，從細胞形態(tài)來看，本發(fā)明分離培養(yǎng)的細胞符合干細胞的特點，細胞的增殖能力較強，本發(fā)明中細胞可傳代至30代左右。6)、細胞凍存選擇Pl代細胞進行凍存，既保證了凍存時細胞的原始狀態(tài)，也能夠使細胞擴增到
足夠數量級。每個試管內裝含有密度為1 2*106/ml的Pl代細胞1ml。具體為在上述步驟幻中，待Pl代細胞生長至融合80% -90%后，用Iml質量濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞。用少量Chang完全培養(yǎng)基重懸細胞，臺盤藍染色，計算細胞數量和細胞活率，確定細胞活率在80 %以上，用Chang完全培養(yǎng)基調整細胞密度為 2-4*106/ml，加入等體積預冷)的2倍濃度的凍存液(20% DMS0)；然后分裝于2ml的凍存管中。采用的凍存液終濃度是含有l(wèi)O^DMSCKcalbiochem公司)的Chang完全培養(yǎng)基 (即，凍存液為DMSO與Chang完全培養(yǎng)基按照1 9的體積比混合而得)；S卩，凍存前細胞的終濃度為l-2*106/ml。將凍存管放入程控降溫儀進行預冷，開始凍存程序。凍存程序設置如下
第一步4°C，等待(即溫度降至4°C后，進入第二步)；第二步1. O0C /分鐘降至-3. O0C (箱體)；第三步10. O0C /分鐘降至-20. O0C (箱體)；第四步1 · 0°C /分鐘降至-40. 0°C (箱體)；第五步10. O0C /分鐘降至-90. O0C (箱體)；第六步結束；取出凍存樣本，放入液氮儲存罐(即為-196°C )長期保存。實施例2、細胞復蘇培養(yǎng)將上述實施例1所得的凍存的樣本從液氮儲存罐中取出，立即放入37°C水浴中解凍。當觀察到凍存管內的冰核只有黃豆大小的時候，將凍存管取出，立刻放入冰水混合物中。在無菌條件下，將凍存管中樣本輕柔吸出，加入一支50mL無菌離心管中，再立即加入 IOmL的Chang完全培養(yǎng)基，充分混勻洗滌，在4°C、IOOOrpm的條件下離心10分鐘，去除管中上清。重復操作一次。用臺盤藍進行細胞計數及活率分析。按照10000個/cm2的密度(利用Chang完全培養(yǎng)基)將細胞接種到75cm2培養(yǎng)瓶中，放入37°C、飽和濕度、體積分數為5 % 的(X)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據細胞生長情況，每3-4天全量換液一次，待細胞達到80% -90%融合時，用濃度為0. 25%的胰蛋白酶消化，以5000-6000個/cm2密度傳代，復蘇后細胞形態(tài)正常，增殖速度沒有改變，傳代至30代左右，細胞出現老化現象，從圖2復蘇細胞的生長曲線看出，細胞的倍增時間保持在M-36小時。實施例3.流式細胞檢測選擇實施例1中所得培養(yǎng)P5代的宮內膜間充質干細胞按如下步驟進行流式檢測。每個試管內裝有濃度為5*106/ml的P5代細胞&ι1。1)細胞懸液制備用Iml的0. 25% (質量濃度)的胰酶將細胞消化下來，500rpm，5min離心，棄上清。 加PBS洗2遍，然后aiil PBS重懸細胞，從而使細胞濃度為5*106/ml。2) 4%多聚甲醛(PBS配制)固定15min，然后PBS洗2遍(1500rpm，離心5min)。3)5%的85六固定40111土11。4)根據流式抗體(直標)稀釋度要求每IO6個細胞/200ul分別加入20ul抗體 (CD29、CD45、CD105、CD117、CD90、CD34、CD73、CD44、HLA-DR)，避光，37°C 孵育 30min。5)用PBS洗一遍，1500rpm，離心5min，棄上清，再加入500ul PBS重懸，準備上機檢測。6)流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司，型號FC-500。所用抗體來自于貝克頓迪肯森公司(Becton，Dickinson & Company，富蘭克林湖，NJ)。根據檢測的干細胞大小特點利用前向散射光(FS)、側向散射光(SS)找到目標細胞群。根據所選擇的抗體的熒光素標記選擇流式檢測通道，對目標細胞的熒光強弱進行分析，計算出細胞表面標記分子的陽性百分比。具體如圖3所示。從以上實施例可見本發(fā)明方法可以成功從女性經血樣品中分離獲得人宮內膜干細胞，細胞經過擴增和純化培養(yǎng)可培養(yǎng)至20代；細胞經過凍存后能夠復蘇繼續(xù)傳代培養(yǎng)， 保持干細胞形態(tài)。經過流式細胞檢測，復蘇細胞表達⑶29、⑶105、⑶90、⑶73、⑶44，不表達⑶34、⑶117、⑶45、HLA(DR-DP-DQ)。表明本發(fā)明能夠建立人宮內膜干細胞株，本發(fā)明的人宮內膜干細胞儲存方法實際可行，并具有其他細胞庫儲存方法不具備的優(yōu)點。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.從刮宮樣品中獲取人宮內膜間充質干細胞的方法，其特征是包括以下步驟1)、樣品收集將人流產物與采集液按照1 0. 9 1. 1的體積比混合；得刮宮樣品； 所述采集液為在每500mL的采集液中含有400單位肝素以及濃度為％ig/mL的環(huán)丙沙星和濃度為lOmg/mL的卡那霉素，其余為DMEM培養(yǎng)基；2)、宮內膜干細胞分離培養(yǎng)A、樣本的初處理將刮宮樣品于3 5°C進行搖床孵育22 沈小時，然后進行過濾；得濾液；B、利用密度梯度離心法，收集血液中的碎片組織及單核細胞，依次進行以下步驟 濾液1500 2500g離心8 12分鐘，分別得位于上層的上清和位于下層的血液；取部分上清用于病毒檢測，如病毒檢測為陽性，則結束整個操作；如病毒檢測為陰性， 則繼續(xù)進行以下操作用PBS緩沖液稀釋血液，所述PBS緩沖液與血液的體積用量比為1. 5 2. 5 1 ； 將稀釋后的血液加至人淋巴細胞分離液上，所述稀釋后的血液和人淋巴細胞分離液的體積比為1.8 2. 2 1，600 IOOOg離心12 18分鐘，離心完畢后，離心管內出現明顯的分層；吸出位于中間的單核細胞層，用PBS緩沖液洗滌細胞后離心，最后用Chang完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液；C、細胞的培養(yǎng)將上述步驟所得的單細胞懸液接種于Chang完全培養(yǎng)基中，細胞接種密度為1 X IO5 1 X 106/ml，置于37°C、飽和濕度、體積分數為5%的(X)2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)時間為4 5天；所述Chang完全培養(yǎng)基由以下成分組成65ml的MEM alpha培養(yǎng)基、18ml的Chang B、 2ml 的 Chang C、Iml 的 Penicillin/StreptomycinUml 的濃度為 200mM 的 L-glutamine 禾口 15ml 的 ES-FBS ；D、細胞擴增和純化待步驟幻的4 5天的培養(yǎng)結束后，更換培養(yǎng)基，棄除未貼壁細胞；每3 4天全量換液一次，待細胞生長達到80% 90%融合時，用重量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞，然后按5000 6000個/cm2密度傳代接種培養(yǎng)，并記為Pl代； 上述過程在37°C、飽和濕度、體積分數為5%的(X)2培養(yǎng)箱中進行；3)、細胞凍存待上述步驟所得的Pl代細胞鋪滿瓶底后，用重量百分含量為0. 25%的胰蛋白酶消化收集細胞，用預冷的凍存液重懸細胞，得細胞懸液，所述細胞懸液中細胞的濃度是1_2*106/ ml ；所述凍存液為DMSO與Chang完全培養(yǎng)基按照1 9的體積比混合而得； 將上述細胞懸液進行如下凍存程序 第一步、4°C，等待； 第二步、1. O0C /分鐘降至-3. O0C ； 第三步、10. O0C /分鐘降至-20. O0C ； 第四步、1. O0C /分鐘降至-40. O0C ； 第五步、10. O0C /分鐘降至-90. O0C ；第六步結束；得凍存樣本； 將所述凍存樣本放入液氮儲存罐保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從刮宮樣品中獲取人宮內膜間充質干細胞的方法，包括以下步驟1)將人流產物與采集液按照1∶0.9～1.1的體積比混合；得刮宮樣品；2)宮內膜干細胞分離培養(yǎng)將刮宮樣品經搖床孵育后，過濾；得濾液；然后利用密度梯度離心法，收集血液中的碎片組織及單核細胞；接著進行細胞的培養(yǎng)以及細胞擴增和純化；3)待上述步驟所得的P1代細胞鋪滿瓶底后，用胰蛋白酶消化收集細胞，用預冷的凍存液重懸細胞，得細胞懸液，將上述細胞懸液進行凍存，將所得的凍存樣本放入液氮儲存罐保存。采用本發(fā)明的方法能獲得純度較高、數量較大的目標細胞即宮內膜干細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102296048SQ20111024793
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月24日 優(yōu)先權日2011年8月24日
發(fā)明者項春生 申請人:杭州易文賽生物技術有限公司