專利名稱：細菌耐藥基因檢測方法、基因芯片和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，特別是涉及一種檢測臨床常見細菌耐藥基因的方法。本發(fā)明還涉及用于該方法的試劑盒和基因芯片。
背景技術：
全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)的統(tǒng)計顯示，在耐藥細菌中，革蘭氏陰性菌占70%左右，其中以大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌為多，且多重耐藥情 況嚴重；革蘭氏陽性菌占30%左右，其中，葡萄球菌屬占到2/3，而金黃色葡萄球菌幾乎占葡萄球菌屬的一半，腸球菌屬占革蘭氏陽性菌的1/4左右，并以糞腸球菌和屎腸球菌為主。隨著感染性疾病的增多，第三代和第四代頭孢菌素、碳青霉烯類以及氟喹諾酮類等超廣譜抗菌藥物被廣泛使用，細菌的耐藥情況變得日益嚴重，造成感染性疾病難以控制、易復發(fā)、術后感染率高、昂貴抗菌藥物使用量增加等后果。耐藥菌株還隨著國際交流在全球范圍蔓延。傳統(tǒng)的病原學診斷及其耐藥性檢測主要依賴于形態(tài)學、培養(yǎng)等方法，需要先從標本中培養(yǎng)分離到病原菌，然后測定細菌的藥物敏感性，測定的方法主要包括定性測定的紙片擴散法、K-B法，定量測定的稀釋法(如肉湯稀釋法，瓊脂稀釋法)，E試驗法以及全自動藥敏儀法，這些方法的成本相對較低，但測定過程復雜，耗時長。目前，臨床上也有應用全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)來做耐藥檢測，但同樣需要經(jīng)歷培養(yǎng)、分離提純、鑒定三個步驟，最順利的情況也需要72小時才能提供藥敏結果，且難以對自身生長緩慢、生長條件苛刻的細菌進行檢測。此外，血清免疫學方法也可用于細菌的耐藥性檢測，但其假陽性率和假陰性率高，重復性差，效能也不高。鑒于臨床治療的需要，醫(yī)生往往先根據(jù)流行病學資料、臨床癥狀、體征及影像學特征等，估計可能的病原體及藥敏情況，經(jīng)驗性應用覆蓋可能病原體的抗菌藥物或者相對廣譜的抗菌藥物，待培養(yǎng)結果出來后，再對抗菌藥物進行調(diào)整，這嚴重限制了臨床醫(yī)師為患者及時有效地選擇敏感抗菌藥物，尤其不利于重癥感染性疾病的及時治療，而且很可能存在抗生素濫用的問題，助長了耐藥菌的產(chǎn)生。通過檢測細菌的耐藥基因，實現(xiàn)臨床上耐藥菌的快速準確診斷，是目前臨床微生物學的重要研究和發(fā)展方向，它對控制醫(yī)院內(nèi)感染和搶救重癥感染病人具有重要的意義。β -內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是細菌對β -內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機制。β -內(nèi)酰胺酶可由染色體和質(zhì)粒介導，數(shù)量超過200種，其中，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)超過50種，遍布于世界各地。ESBLs的產(chǎn)生，是革蘭氏陰性腸桿菌的主要耐藥機制。在醫(yī)院感染中，ESBLs所涉及的菌種，幾乎涵蓋了所有主要的革蘭氏陰性桿菌。質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥(PMQR)基因，包括qnr(quinolone resistance)、qepA(quinolone efflux protein A)和 aac (6’)-Ib-cr 等。質(zhì)粒通過接合等方式，在細菌間傳遞耐藥基因，造成耐藥性的傳播。基因aac (6’ )-Ib的304位T突變?yōu)镃或者A，或者535位G突變?yōu)門，導致102位色氨酸突變?yōu)榫彼幔?79位天冬氨酸突變?yōu)槔野彼?，引起細菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性。
DNA回旋酶GyrA和拓撲異構酶ParC的突變是導致細菌對喹諾酮類耐藥的重要機制，GyrA基因常見突變位點有83位絲氨酸(S83)突變?yōu)榱涟彼?L83)、87位天冬氨酸(D87)突變?yōu)樘於０?N87)或者酪氨酸(Y87) ;ParC常見突變位點有80位絲氨酸(S80)突變?yōu)楫惲涟彼?180)、84位谷氨酸(E84)突變?yōu)橘嚢彼?K84)、甘氨酸(G84)或者纈氨酸(V84)。mecA基因是MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)特有的耐藥基因，其編碼的PBP2a蛋白代替原來的青霉素結合蛋白PBP2，細菌細胞壁的合成不能被抑制，致使β -內(nèi)酰胺類藥物結合靶位缺失，從而形成耐藥。檢測mecA基因是被認為國內(nèi)外判斷MRSA的金標準。氨基糖苷類修飾基因aac出’)-Ie-aph (2”)-Ia的存在，是耐高濃度慶大霉素腸球菌(HLGR)的主要原因。目前，臨床微生物耐藥基因的檢測，基本以表型檢測為主。由于耐藥機制的多樣性，某些耐藥基因可能沉默表達，但潛在的耐藥性是存在的，在合適的環(huán)境條件下，就會轉(zhuǎn)·變成耐藥細菌，或者將耐藥基因傳播給其他細菌。PCR雜交分析是檢測細菌耐藥基因最常見的方法，然而，在眾多的耐藥基因中篩選某一種或者幾種耐藥基因，需要做大量的重復工作?；蛐酒夹g，具有敏感性高、特異性強、快速、高通量等特性，與PCR雜交分析法相比，基因芯片可并行檢測多種基因信息，實現(xiàn)大量重復工作的同步化，從而能提高檢測效率。針對細菌耐藥基因的檢測，國內(nèi)外研究者嘗試了不同檢測范圍的基因芯片。例如，Jan Weile等開發(fā)了一種檢測銅綠假單胞菌抗生素耐藥性和毒力因子的基因芯片，整個過程在5個小時內(nèi)完成，陽性預測值、陰性預測值、靈敏度、特異度分別為78%、91%、89 %>83 % (ffeile J et al. DNA microarray for genotyping multidrug-resistantPseudomonas aeruginosa clinical isolates[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2007,59(3) :325-338)。Miranda Batchelor等開發(fā)的革蘭氏陰性桿菌耐藥基因的微型芯片可以檢測編碼耐氨基糖苷類、甲氧芐啶、磺胺類、四環(huán)素和內(nèi)酰胺類以及超廣譜β _ 內(nèi)酸胺酶的 47 個耐藥基因(Batchelor M et al. Development of a miniaturisedmicroarray-based assay for the rapid identification of antimicrobial resistancegenes in Gram-negative bacteria[J].Int J Antimicrob Agents,2008,31 (5)440-451)。Naas等設計的芯片能檢測腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌中各型β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因，包括 TEM、SHV、CTX-M、KPC 等(Naas T et al. Evaluation of a DNAmicroarray,the check-points ESBL/KPC array,for rapid detection of TEM, SHV,andCTX-M extended-spectrum beta-lactamases and KPCcarbapenemases[J]. AntimicrobAgents Chemother. 2010, 54 (8) :3086-3092)。Marco Cassone 等設計制作了覆蓋 8 種細菌的65個大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的芯片(Cassone M et al. DNA microarray for detectionof macroIide resistance genes[J]. Antimicrob.Agents Chemother,2006,50 (6)2038-2041)。我國的基因芯片技術近年來也發(fā)展較快，例如，毛紅菊等設計了可以檢測超廣譜β內(nèi)酞胺酶類耐藥基因中的SHV、CTX-M的幾個亞型的基因芯片，該方法由標本處理到細菌鑒定及耐藥譜檢測，全程僅需6-8小時(毛紅菊等.利用基因芯片快速檢測多種臨床常見致病菌及其耐藥性基因[J].中華傳染病雜志，2006，24￠) :372-377)。沈定霞等設計了檢測大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌產(chǎn)生ESBLs和AmpC酶基因的基因芯片，并對上述三種菌株共225株進行檢測，除部分表型AmpC酶陽性的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌外，該芯片對所有表型ESBLs陽性菌株均能檢出；同時對CTX-M基因進行了分型(沈定霞等.基因芯片技術檢測大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶基因[J].中國抗生素雜志，2007，32 (12) :727-731)。王雅杰等設計的基因芯片，可以對常見革蘭陽性細菌同步進行細菌鑒定和耐藥性檢測，靈敏度和特異度均較高(王雅杰等.常見革蘭陽性細菌鑒定與耐藥檢測基因芯片的臨床應用[J].首都醫(yī)科大學學報，2007，28 (2) :140-144)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題之一是提供一種細菌耐藥基因檢測試劑盒，它可以用于多種臨床常見耐藥細菌產(chǎn)生的耐藥基因的同時檢測。
為解決上述技術問題，本發(fā)明的細菌耐藥基因檢測試劑盒，包括擴增待測細菌耐藥基因的引物對和檢測所述細囷耐藥基因的探針；所述引物具有如SEQ ID No:l 32所不的序列或其互補鏈；所述探針具有如SEQ ID No :33 61所示的序列或其互補鏈。本發(fā)明要解決的技術問題之二是提供一種細菌耐藥基因檢測芯片。為解決上述技術問題，本發(fā)明的用于細菌耐藥基因檢測的基因芯片，包括檢測待測細菌耐藥基因的探針，所述探針具有如SEQ ID No 33 61所示的序列或其互補鏈。所述細菌耐藥基因包括0XA-23、MP、VM、aac(6’)_Ie_aph(2”)_Ia、CTX_M、KPC、CIT、mecA、TEM、SHV, DHA, qnrB、qnrS、aac (6，) _Ib、ParC 和 GyrA。本發(fā)明要解決的技術問題之三是提供一種利用上述細菌耐藥基因檢測試劑盒和基因芯片進行細菌耐藥基因檢測的方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明的細菌耐藥基因檢測方法，包括以下步驟I)利用所述試劑盒中的引物，對待測樣本DNA中的耐藥基因進行PCR擴增；2)將步驟I)的產(chǎn)物與所述試劑盒中的檢測細菌耐藥基因的探針進行熒光標記反應；3)將步驟2)的產(chǎn)物與所述芯片進行雜交反應，確定樣本所含的耐藥基因。本發(fā)明的細菌耐藥基因檢測方法及檢測芯片和試劑盒，覆蓋了革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌所產(chǎn)生的最常見的16種耐藥基因的檢測，且檢測速度快，靈敏度和特異性高，從而有助于實現(xiàn)臨床細菌感染的快速診斷和及時有效地用藥，具有顯著的臨床實用價值。


附圖是用本發(fā)明的基因芯片對臨床血液樣本進行耐藥基因檢測得到的芯片掃描圖。
具體實施例方式以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I利用本發(fā)明的試劑盒進行臨床常見耐藥細菌的耐藥基因檢測I.檢測目標及引物和探針的設計本實施例的檢測目標包括革蘭氏陽性球菌中的金黃色葡萄球菌和腸球菌的耐藥基因，以及革蘭氏陰性桿菌中的肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的耐藥基因。所述耐藥基因沒有細菌種屬特異性差異，包括TEM、SHV、CTX-M、DHA、CIT、頂P、V頂、KPC> 0XA-23、qnrB、qnrS、mecA、aac (6，) -Ie-aph (2，，) -la、aac (6，) _Ib、GyrA 和 ParC,其中，aac(6，)-Ib基因設計3個突變位點，分別為T304C、T304A、G535T ；GyrA設計3個突變位點，分別為N87、Y87、L83 ；ParC設計4個突變位點，分別為180、K84、G84、V84。擴增上述耐藥基因特異性片段的引物對，其正向引物和反向引物的序列長度為·15 50個核苷酸,優(yōu)選為15 25個核苷酸。引物的詳細信息如表I所不表I本發(fā)明的細菌耐藥基因檢測試劑盒包括的引物
權利要求
1.一種細菌耐藥基因檢測試劑盒，其特征在于包括擴增待測細菌耐藥基因的引物對和檢測所述細囷耐藥基因的探針；所述引物具有如SEQ ID No : I 32所不的序列或其互補鏈；所述探針具有如SEQ ID No 33 61所示的序列或其互補鏈。
2.根據(jù)權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述耐藥基因為OXA-23、IMP、VIM、aac (6’ ) -Ie-aph (2”) -la、CTX-M、KPC, CIT、mecA、TEM、SHV, DHA, qnrB、qnrS、aac (6’ ) _Ib、ParC 和 GyrA。
3.一種用于細菌耐藥基因檢測的基因芯片，其特征在于包括檢測待測細菌耐藥基因的探針，所述探針具有如SEQ ID No 33 61所示的序列或其互補鏈。
4.根據(jù)權利要求3所述的基因芯片，其特征在于，還包括陽性對照探針和陰性對照探針，所述陽性對照探針具有如SEQ ID No :62所示的序列或其互補鏈，所述陰性對照探針具有如SEQ ID No :63所示的序列或其互補鏈。
5.利用權利要求I或2所述的細菌耐藥基因檢測試劑盒和權利要求3或4所述的用于細菌耐藥基因檢測的基因芯片進行細菌耐藥基因檢測的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)利用所述試劑盒中的引物，對待測樣本DNA中的耐藥基因進行PCR擴增； 2)將步驟I)的產(chǎn)物與所述試劑盒中的檢測細菌耐藥基因的探針進行熒光標記反應； 3)將步驟2)的產(chǎn)物與所述基因芯片進行雜交反應，確定樣本所含的耐藥基因。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反應體系為=IOXPCR緩沖液I. O 2. O μ L，IOmM dNTP混合液O. I O. 4 μ L，引物混合物O. 8 I. 2 μ L，DNA聚合酶O.I O. 4 μ L,樣本DNA O. 8 2 μ L,加滅菌蒸懼水補充至15 μ L。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述PCR的反應條件為95°C，5分鐘；95°C，30 #,68°C，30 秒，共 30 個循環(huán)；68°C，3 分鐘。
8.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述熒光標記反應的反應體系為擴增產(chǎn)物 2 5μ L，IOXBuffer I. 2 I. 8 μ L，5U/μ L Sequenase DNA 聚合酶 O. I O. 3 μ L，20 μ M 探針混合物 O. I O. 5 μ L，IOOmM Cy3-ddNTP O. I O. 5 μ L。
9.根據(jù)權利要求5或8所述的方法，其特征在于，所述熒光標記反應的反應條件為95。。，5 分鐘；95°C，30 秒，65°C，30 秒，72°C，20 秒，共 40 個循環(huán)；72°C，5 分鐘。
10.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述雜交反應的反應體系為熒光標記的擴增產(chǎn)物15 25 μ L，20 X SSPE 6 15 μ L，20nmol/L陽性質(zhì)控O. I O. 4 μ L，混合均勻，用滅菌水補充至30 40 μ L ;反應條件為在95°C下加熱5分鐘，冰上驟冷，然后與所述基因芯片在48°C下雜交反應2小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細菌耐藥基因檢測方法、基因芯片和試劑盒。該試劑盒包括擴增待測細菌耐藥基因的引物對和檢測探針。該基因芯片包括檢測待測細菌耐藥基因的探針。利用該試劑盒和基因芯片進行耐藥基因檢測的方法，包括步驟1)利用試劑盒中的引物，PCR擴增待測樣本DNA中的耐藥基因；2)擴增產(chǎn)物與試劑盒中的檢測探針進行熒光標記反應；3)熒光標記的擴增產(chǎn)物與基因芯片進行雜交，確定樣本所含耐藥基因。本發(fā)明的檢測方法覆蓋了臨床最常見的16種耐藥基因的檢測，有助于實現(xiàn)臨床細菌耐藥情況的快速診斷，從而可以為臨床合理選擇治療藥物提供支持。
文檔編號C12Q1/68GK102952875SQ201110254798
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權日2011年8月31日
發(fā)明者蔡挺, 張春秀, 張順, 陳金絲, 李巧云, 周佳菁, 肖華勝 申請人:寧波市第二醫(yī)院, 上海生物芯片有限公司, 上海伯豪生物技術有限公司