專利名稱：用于h5亞型禽流感病毒檢測的rt-lamp引物組、檢測方法及應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及禽流感病毒的檢測方法，尤其涉及基于RT-LAMP設計的檢測H5亞型禽流感病毒的引物組，及其檢測方法和應用，屬于禽流感病毒的檢測領域。
背景技術(shù)：
禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)為單股負鏈RNA，是正粘病毒科流感病毒屬成員，由8個獨立的RNA節(jié)段組成，顯著的生物學特征之一是亞型眾多，變異頻繁。迄今為止從禽類體內(nèi)已經(jīng)分離到上千種毒力各異的毒株，根據(jù)其病毒粒子表面的囊膜糖蛋白-血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性差異，分為16個HA亞型和9個NA亞型。不同亞型毒株對宿主的致病力差異顯著，高致病性禽流感(High pathogenic avian influenza,HPAI)可引起雞群100%死亡，被國際獸疫局確定為A類傳染病。在1959-1998 年的40年間，世界范圍內(nèi)一共報道了 17次高致病性禽流感(HPAI)。近年在全球時見報導的主要是H5m和H7m兩個亞型，其中倍受關注的是H5m。近幾年來發(fā)生的高致病力禽流感疫情是由H5亞型AIV引起的有1983 1984年美國發(fā)生H5N2亞型引起的禽流感流行， 病死率近90%，死亡和撲殺家禽1700萬只；1997年香港發(fā)生H5W亞型禽流感流行，宰殺了家禽150萬只。2003 2004年東南亞的H5W亞型禽流感暴發(fā)，韓國、日本、臺灣、越南、泰國等10多個國家和地區(qū)，我國內(nèi)地廣西、湖北、安徽等多個省市的某些鄉(xiāng)鎮(zhèn)發(fā)生H5W亞型引發(fā)的禽流感疫情，病死與宰殺的家禽已逾5000萬只。尤其是1997年以來已有人類感染禽流感并致死的報道，最近，世界衛(wèi)生組織最近再次確認全球已確診153例人感染禽流感 83人死亡，造成世界對H5W的一片恐慌。因此，為了對疫情快速采取應對措施，對疑似病例做出快速有效的診斷有重要意義。目前對AIV進行快速檢測的方法有IFA、ELISA、RT-PCR、 Real-time RT_PCR、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)禾口Microarray等?？焖僭\斷和及時監(jiān)測是禽流感防控的首要步驟和重要一環(huán)。目前，有關禽流感的檢測方法較多，經(jīng)典的流感病毒病原學診斷方法中病毒分離及其生物學特性的研究是最為可行和最能說明問題的，但病毒的分離鑒定需要將病料接種雞胚或組織培養(yǎng)，需要較長的時間(幾天到一周)，不能夠滿足急性烈性傳染病緊急疫情防制工作的需要，同時由于高致病性禽流感病毒存在感染哺乳動物的潛在危險，病毒的操作需要在生物安全三級實驗室進行，一般檢疫部門不具備這種試驗條件。快速、靈敏、特異的分子生物學檢測技術(shù)， 如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已經(jīng)在禽流感病毒檢測中發(fā)揮著重要作用 (Shan, 2003 ；Collins, 2002 ；Wang，2005 ；Spackman，2003 ；Poddar, 2002)。但都需要復雜的檢測儀器(如PCR儀，熒光定量PCR儀等)，在一些基層的實驗室操作時受到限制。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated Isothermal Amplification Method, LAMP)技術(shù)是一種新的體外擴增特異性DNA片段的分子生物學方法(Notomi，2000)。該方法不需要額外的反轉(zhuǎn)錄步驟，只需要簡單的水浴鍋，在30-90min內(nèi)即可擴增大量的核酸，不需要通過核酸電泳的方法來檢測結(jié)果，只需通過其副產(chǎn)物-白色的焦磷酸鎂沉淀來觀察結(jié)果(如果加入熒光染料后會更易觀察)。LAMP所具有的簡單、快速、高效、實用的特點，非常適合在基層實驗室，甚至現(xiàn)場進行快速診斷。該方法已經(jīng)成功地應用于H5和H9亞型AIV的檢測。建立一種能夠靈敏、特異的H5亞型AI V的RT-LAMP檢測方法的前提是需要針對H5HA基因保守區(qū)設計得到特異性引物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種能夠靈敏、特異的檢測H5亞型禽流感病毒RT-LAMP 的引物組；本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種用于H5亞型禽流感病毒檢測的RT-LAMP引物組，其特征在于所述的RT-LAMP 引物組由一對外引物，一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物組成；所述外引物對序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物對序列分別為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述環(huán)引物對序列分別為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。本發(fā)明還提供一種檢測H5亞型禽流感病毒的方法，其特征在于使用所述的引物組對待測樣品進行RT-LAMP擴增。優(yōu)選的，所述的擴增反應是將反應管置于PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為 62. 5°C反應lh，80°C作用IOmin結(jié)束反應。本發(fā)明的所述的RT-LAMP引物組可用于制備檢測或診斷H5亞型禽流感病毒的生物試劑。本發(fā)明還涉及一種用于H5亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測的試劑盒，包括Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于還包括熒光檢測試劑及以上所述的引物組；Reaction Mix、Enzyme Mix 和 Distilled Water 均可按照常規(guī)現(xiàn)有方法制備； 在本發(fā)明的一具體實施例中所述的Reaction Mix、Enzyme Mix來自RNAAmplification Kit (RT-LAMP)(購自日本榮研公司)。所述的RT-LAMP引物由一對外引物(H5-F3和H5-B3)，一對內(nèi)引物(H5-FIP和 H5-BIP)和一對環(huán)引物(H5-LF和H5-LB)組成；所述外引物對序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物對序列為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述環(huán)引物對序列為 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示；所述引物可按照現(xiàn)有方法制成凍干粉，PAGE純或HPLC純。在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述的熒光檢測試劑是Fluorescent Detection Reagent，購自日本榮研公司。本發(fā)明還提供了所述的H5亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測試劑盒在制備檢測或診斷H5亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述檢測H5亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測試劑盒的使用方法，包括1、將下述組分加入到反應管中
4Reaction Mix
100 ρ mol SEQ ID No. 1 ( H5 FIP ) 100 ρ mol SEQ ID No.2 ( H5 BIP ) 10 ρ mol SEQ ID No.3 ( H5 F3 ) 10 ρ mol SEQ ID No.4 ( H5 B3 ) 100 ρ mol SEQ ID No.5 ( H5 LF )
12.5 μL 0.4 μL 0.4 μL 0.5 μL 0.5 μL 0.2 μL
100 ρ mol SEQ ID No.6 ( H5LB )0.2 pL
Enzyme mixIpL
待檢測的樣品RNA5.0μL
樸充Distilied Water至25 pL。2、將反應管置于PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為62. 5°C反應Ih，80°C作用 IOmin結(jié)束反應；3、檢測(1)直觀檢測反應物中加入 1. 0μ L Fluorescent Detection Reagent 染料，艮口可直接顯示結(jié)果陽性反應發(fā)出綠色熒光，陰性反應保持原黃色不變；(2)瓊脂糖凝膠電泳用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析陽性反應呈現(xiàn)特有的梯狀條帶，陰性反應則無條帶出現(xiàn)。本研究選用的禽流感血凝素基因(Hemagglutinin，HA)位于病毒粒的囊膜上，由同質(zhì)的三聚體組成，形成一球狀的頭部和細長的頸部，是唯一能產(chǎn)生中和抗體的抗原，誘導機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護作用，是禽流感病毒誘導機體產(chǎn)生保護性體液免疫反應的主要靶抗原。其主要功能是識別宿主細胞膜上的受體，介導毒粒囊膜和細胞囊膜的融合。而且它是變異最大的基因，AIV的抗原性和致病性很大程度上取決于該基因的變異情況。此外HA蛋白分子上個別關鍵氨基酸位點的突變，尤其是受體結(jié)合部位的氨基酸發(fā)生替換，就有可能造成毒粒致病性和傳播能力的改變。所以它在AIV中具有極重要的意義，是近20年來禽流感工作者研究的熱點。


圖1為不同濃度底物進行RT-LAMP以及RT-PCR的敏感性擴增結(jié)果；圖IA為H5-RT-LAMP擴增結(jié)果；圖IB為H5-RT-PCR擴增結(jié)果；1-8所對應的病毒 RNA 濃度為分別為 10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、0. OOlPFU ；圖2為不同濃度的底物濃度進行RT-LAMP擴增的實時監(jiān)控圖顯示結(jié)果；1-8 所對應的病毒 RNA 濃度為分別為 10000PFU、1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、 0.1PFU、0. 01PFU、0. OOlPFU ；圖3為用RT-LAMP檢測Hl H16亞型禽流感病毒的實時監(jiān)控圖顯示結(jié)果；1. MD/HLJ/390/06 (HlNl) ；2. MD/HLJ/135/06 (H2N2) ；3. MD/HLJ/90/06 (H3N2)； 4. MD/HLJ/499/06(H4N6)；
5. DK/AH/1/06(H5N1) ；6.MD/HLJ/87/06(H6N1) ；7.CK/HeB/1/02(H7N2)；8. A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04 (H8N1) ；9. CK/HuN/33/08(H9N2) ； 10. MD/ HLJ/108/06(H10N2)；11. MD/HLJ/80/06(HllN2) ； 12. A/Duck/Alberta/60/76 (H12N5) ；13. A/gull/ Maryland/704/77(H13N6)；14.A/mallard/Gurjer/263/82(H14N5) ；15.A/duck/AUST/34/83(H15N8)；16. A/cormonant/Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；圖4為用RT-LAMP檢測Hl H16亞型禽流感病毒的特異性試驗結(jié)果；1. MD/HLJ/390/06 (HlNl) ；2. MD/HLJ/135/06 (H2N2) ；3. MD/HLJ/90/06 (H3N2)； 4. MD/HLJ/499/06(H4N6)；5.DK/AH/1/06(H5N1) ；6.MD/HLJ/87/06(H6N1) ；7. CK/HeB/1/02(H7N2)；8. A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04 (H8N1) ；9. CK/HuN/33/08(H9N2) ； 10. MD/ HLJ/108/06(H10N2)；11. MD/HLJ/80/06(HllN2) ； 12. A/Duck/Alberta/60/76 (H12N5) ；13. A/gull/ Maryland/704/77(H13N6)；14.A/mallard/Gurjer/263/82(H14N5) ；15.A/duck/AUST/34/83(H15N8)；16. A/cormonant/Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；圖5為用RT-LAMP檢測其它禽病病毒核酸的特異性試驗結(jié)果；M :DL2000DNA Marker ；1 :H5N1 ；2 雞新城疫病毒(NDV) ；3 雞傳染性支氣管炎病毒(IBV) ；4 雞傳染性法氏囊病毒(IBDV) ；5 雞馬立克氏病病毒(MDV) ；6 雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV) ；7 雞傳染性貧血病毒(CIAV) ；8 雞白血病病毒(ALV)；圖6為用RT-LAMP檢測其它禽病病毒核酸的實時監(jiān)控圖顯示結(jié)果。1 :H5N1 ；2 雞新城疫病毒(NDV) ；3 雞傳染性支氣管炎病毒(IBV) ；4 雞傳染性法氏囊病毒(IBDV) ；5 雞馬立克氏病病毒(MDV) ；6 雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV) ；7 雞傳染性貧血病毒(CIAV) ；8 雞白血病病毒(ALV)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例11試驗材料和方法1. 1毒株和試劑本試驗所用禽流感病毒Hl H16亞型標準參考毒株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)； H5亞型禽流感病毒(A/Duck/shanghai/35/2002 (H5N1))及其雞新城疫病毒 (NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞馬立克氏病病毒 (MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)、雞白血病病毒(ALV)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。RNA Amplification Kit (RT-LAMP)禾口 Fluorescent Detection Reagent，購自日本榮研公司；RNAgents Total RNA Isolation系統(tǒng)和Access RT-PCR系統(tǒng)均購自 Promega 公司。10日齡SPF雞胚、6周齡SPF雞由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實驗動物中心提供，所有SPF雞都在負壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。1. 2LAMP引物的設計和合成分析了流感數(shù)據(jù)庫中H5亞型流感病毒HA基因序列的同源性，找出HA基因保守區(qū)，設計了 6個引物，分別是外引物(H5-F3(SEQ ID No. 1所示)和H5-B3 (SEQ ID No. 2 所示))，內(nèi)引物(H5-FIP(SEQ ID No. 3所示)和H5-BIP (SEQID No.4所示))和環(huán)引物 (H5-LF (SEQ ID No. 5 所示)和 H5_LB(SEQ ID No. 6 所示))(表 1)。表1 RT-LAMP引物序列
權(quán)利要求
1.一種用于H5亞型禽流感病毒檢測的RT-LAMP引物組，其特征在于所述的RT-LAMP引物組由一對外引物，一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物組成；所述外引物對序列分別為SEQ ID No. 1 和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物對序列分別為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述環(huán)引物對序列分別為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。
2.一種檢測H5亞型禽流感病毒的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的引物組對待測樣品進行RT-LAMP擴增。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的擴增反應是將反應管置于PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為62. 5°C反應lh，80°C作用IOmin結(jié)束反應。
4.權(quán)利要求1所述的RT-LAMP引物組在制備檢測或診斷H5亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途。
5.一種用于H5亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測的試劑盒，包括Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于還包括熒光檢測試劑及權(quán)利要求1所述的引物組。
6.按照權(quán)利要求5所述的H5亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的熒光檢測試劑是Fluorescent Detection Reagent，購自日本榮研公司。
7.權(quán)利要求5或6所述的H5亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測試劑盒在制備檢測或診斷 H5亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組用于H5亞型禽流感病毒檢測的RT-LAMP引物組、檢測方法及應用，所述的引物組由一對外引物，一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物組成；所述外引物對序列分別如SEQ ID No.1、2所示，內(nèi)引物對序列分別如SEQ IDNo.3、4所示，環(huán)引物對序列分別如SEQ ID No.5、6所示。本發(fā)明的引物組可用于制備H5亞型禽流感病毒檢測的試劑盒，所述試劑盒包括Reaction Mix；Enzyme Mix；Distilled Water；熒光檢測試劑以及本發(fā)明的引物組。本發(fā)明檢測試劑盒具有用樣少、特異性強、敏感性高、快速準確等特點，為H5亞型禽流感的防控預警機制提供了簡捷、有效的早期快速診斷途徑。
文檔編號C12Q1/68GK102337353SQ20111025524
公開日2012年2月1日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者包紅梅, 王秀榮, 陳化蘭 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所