專利名稱：用于h9亞型禽流感病毒檢測(cè)的rt-lamp引物組、檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽流感病毒的檢測(cè)方法，尤其涉及基于RT-LAMP設(shè)計(jì)的檢測(cè)H9亞型禽流感病毒的引物組，及其檢測(cè)方法和應(yīng)用，屬于禽流感病毒的檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)為單股負(fù)鏈RNA，由8個(gè)獨(dú)立的RNA節(jié)段組成，顯著的生物學(xué)特征之一是亞型眾多，變異頻繁。不同亞型毒株對(duì)宿主的致病力差異顯著，H9N2亞型為中低致病力毒株，其特點(diǎn)是分布廣泛，能造成宿主的免疫抑制，并且可與其它病原微生物通過(guò)協(xié)同作用弓I起禽類發(fā)病。H9N2雖然為中等低致病力毒株，但它對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害同樣不容忽視，1996-2000 年間，我國(guó)H9N2亞型禽流感的發(fā)病率占總禽流感發(fā)病率的93. 89%，成為影響我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要AIV亞型。自1994年在我國(guó)廣東某雞場(chǎng)首次分離到H9N2亞型禽流感病毒以來(lái)，H9N2 亞型禽流感在我國(guó)一直呈上升趨勢(shì)，國(guó)際范圍內(nèi)也廣泛發(fā)生。我國(guó)學(xué)者先后從不同地區(qū)不同宿主體內(nèi)分離到了相同亞型的禽流感病毒。特別是1999年以來(lái)H9N2亞型禽流感病毒感染人事件的多次發(fā)生，嚴(yán)重威脅人類健康、畜牧業(yè)生產(chǎn)和畜產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易，尤其是公共衛(wèi)生意義引起了全世界的廣泛關(guān)注，對(duì)該亞型病毒的研究也取得了較快的進(jìn)展。由于H9亞型禽流感病毒引起的輕微呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量下降等和新城疫、 傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎等禽類疾病極為相似，在臨床上較難區(qū)分。為了在疫情出現(xiàn)后能夠快速及時(shí)地作出反應(yīng)，建立一種方便快捷的H9亞型禽流感病毒的檢測(cè)方法具有重要的意義。禽流感的檢測(cè)方法有病毒分離、血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)、IFA、ELISA、 RT-PCR、Real-time、PCR、NASBA(Nucleic acid sequence-based amplification)和微陣列芯片(Microarray)等，RT-PCR技術(shù)是研究的熱點(diǎn)之一?？焖僭\斷和及時(shí)監(jiān)測(cè)是禽流感防控的首要步驟和重要一環(huán)。目前，有關(guān)禽流感的檢測(cè)方法較多，經(jīng)典的流感病毒病原學(xué)診斷方法中病毒分離及其生物學(xué)特性的研究是最為可行和最能說(shuō)明問(wèn)題的，但病毒的分離鑒定需要將病料接種雞胚或組織培養(yǎng)，需要較長(zhǎng)的時(shí)間(幾天到一周)，不能夠滿足急性烈性傳染病緊急疫情防制工作的需要，同時(shí)由于高致病性禽流感病毒存在感染哺乳動(dòng)物的潛在危險(xiǎn)，病毒的操作需要在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，一般檢疫部門(mén)不具備這種試驗(yàn)條件?？焖?、靈敏、特異的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)， 如RT-PCR，RT-PCR-ELISA，real-time RT-PCR已經(jīng)在禽流感病毒檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用 (Shan, 2003 ；Collins, 2002 ；Wang，2005 ；Spackman，2003 ；Poddar, 2002)。但都需要復(fù)雜的檢測(cè)儀器(如PCR儀，熒光定量PCR儀等)，在一些基層的實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)受到限制。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification Method, LAMP)技術(shù)是一種新的體外擴(kuò)增特異性DNA片段的分子生物學(xué)方法(Notomi，2000)。該方法不需要額外的反轉(zhuǎn)錄步驟，只需要簡(jiǎn)單的水浴鍋，在30-90min內(nèi)即可擴(kuò)增大量的核酸，不需要通過(guò)核酸電泳的方法來(lái)檢測(cè)結(jié)果，只需通過(guò)其副產(chǎn)物-白色的焦磷酸鎂沉淀來(lái)觀察結(jié)果(如果加入熒光染料后會(huì)更易觀察)。LAMP所具有的簡(jiǎn)單、快速、高效、實(shí)用的特點(diǎn)，非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室，甚至現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速診斷。該方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于H9和H9亞型AIV的檢測(cè)。建立一種能夠靈敏、特異的H9亞型AI V的RT-LAMP檢測(cè)方法的前提是需要針對(duì)H9HA基因保守區(qū)設(shè)計(jì)得到特異性引物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種能夠靈敏、特異的檢測(cè)H9亞型禽流感病毒RT-LAMP 的引物組；本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種用于H9亞型禽流感病毒檢測(cè)的RT-LAMP引物組，其特征在于所述的RT-LAMP 引物組由一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物組成；所述外引物對(duì)序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物對(duì)序列分別為SEQ ID No. 3和SEQ ID No.4所示，所述環(huán)引物對(duì)序列分別為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)H9亞型禽流感病毒的方法，其特征在于使用所述的引物組對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。本發(fā)明的所述的RT-LAMP引物組可用于制備檢測(cè)或診斷H9亞型禽流感病毒的生物試劑。本發(fā)明還涉及一種用于H9亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測(cè)的試劑盒，包括Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于還包括熒光檢測(cè)試劑及以上所述的引物組；Reaction Mix、Enzyme Mix 和 Distilled Water 均可按照常規(guī)現(xiàn)有方法制備； 在本發(fā)明的一具體實(shí)施例中所述的Reaction Mix、Enzyme Mix來(lái)自RNAAmplification Kit (RT-LAMP)(購(gòu)自日本榮研公司)。其中，所述的RT-LAMP引物由一對(duì)外引物(H9-F3和H9-B3)，一對(duì)內(nèi)引物(H9-FIP 和H9-BIP)和一對(duì)環(huán)引物(H9-LF和H9-LB)組成；所述外引物對(duì)序列為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物對(duì)序列為SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4所示，所述環(huán)引物對(duì)序列為 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。所述引物可按照現(xiàn)有方法制成凍干粉，PAGE純或HPLC純。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述的熒光檢測(cè)試劑為Fluorescent Detection Reagent，購(gòu)自日本榮研公司。本發(fā)明還提供了所述的H9亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)或診斷H9亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述檢測(cè)H9亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的使用，包括1、將下述組分加入到反應(yīng)管中
4Reaction Mix12.5 pL
100 ρ mol SEQ ID No. 1 ( H9 FIP )0.4 μL
100 ρ mol SEQ ID No.2 ( H9 BIP )0.4 μL
10 ρ mol SEQ ID No.3 ( H9 F3 )0.5 μL
10 ρ mol SEQ ID No.4 ( H9 B3 )0.5 μL
100 ρ mol SEQ ID No.5 ( H9 LF )0.2 μL
100 ρ mol SEQ ID No.6 ( H9LB )0.2 μL
Enzyme Mix1.0 pL
待檢測(cè)的樣品RNA5.0 pL
樸充 Distilled Water 至25 pL。2、將反應(yīng)管置于PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為62. 5°C反應(yīng)Ih，80°C作用 IOmin結(jié)束反應(yīng)；3、檢測(cè)(1)直觀檢測(cè)反應(yīng)物中加入 1. Ομ L Fluorescent Detection Reagent 染料，艮口可直接顯示結(jié)果陽(yáng)性反應(yīng)發(fā)出綠色熒光，陰性反應(yīng)保持原黃色不變；(2)瓊脂糖凝膠電泳用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)特有的梯狀條帶，陰性反應(yīng)則無(wú)條帶出現(xiàn)。本發(fā)明通過(guò)分析流感數(shù)據(jù)庫(kù)中H9AIV的亞型流感病毒HA基因序列找出HA基因保守區(qū)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了 RT-LAMP特異性引物。這些基因序列涵蓋了多種家禽及野鳥(niǎo)的HA 基因，具有普遍性和代表性。利用該引物建立的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)Hl H16亞型禽流感病毒以及雞新城疫病毒等其他7種禽病病原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該檢測(cè)試劑盒僅能特異性擴(kuò)增H9亞型禽流感病毒核酸，而不能擴(kuò)增其他病毒核酸，具有很好的特異性。 禽流感病毒的潛伏期從數(shù)小時(shí)到數(shù)天，最長(zhǎng)可達(dá)21天。禽流感暴發(fā)流行初期，最先做的應(yīng)該是禁止家禽在市場(chǎng)上的流通，實(shí)行區(qū)域封鎖，并尋找病毒的來(lái)源。因此對(duì)活禽和野禽的監(jiān)測(cè)顯得尤為重要(Sakar et al，2010)，AIV帶有囊膜，對(duì)消毒劑比較敏感，但在生產(chǎn)實(shí)際中，AIV常從感染禽的鼻腔分泌物中及糞便物中排出，使病毒處于有機(jī)物的保護(hù)之下，可通過(guò)空氣、接觸和糞便傳播。據(jù)報(bào)道，試驗(yàn)雞攻毒18h后即可從泄殖腔及喉頭拭子中分離到病毒，持續(xù)到攻毒后第7d左右；攻毒后36h才可以從腦、肝、脾、腎、胰腺的混合樣品中分離到病毒，可持續(xù)到攻毒后第IOd左右(LIA0，et al，2004)，這表明通過(guò)棉拭子可在未出現(xiàn)癥狀時(shí)即可檢測(cè)到AIV，可真正做到早發(fā)現(xiàn)早防控。本發(fā)明通過(guò)鼻腔接種模仿自然感染，對(duì)感染后不同時(shí)間采取的棉拭子用病毒分離、RT-PCR和本發(fā)明RT-LAMP檢測(cè)試劑盒進(jìn)行平行檢測(cè)。其中，病毒分離和H9-RT-LAMP方法在感染后第1天即可檢測(cè)到病毒，第3天三種方法均可檢測(cè)到病毒。但檢測(cè)所需時(shí)間卻不同，應(yīng)用本發(fā)明RT-LAMP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)病原僅需要60-30min ；病毒分離方法至少需要2_3d ；RT-PCR方法需要6_7h，用時(shí)雖短但敏感性低于本發(fā)明RT-LAMP檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明針對(duì)家禽中流行較為廣泛、危害較大的H9亞型禽流感病毒的血凝素基因建立了 RT-LAMP檢測(cè)方法，該方法對(duì)H9AIV RNA的最小檢測(cè)限為0. 1PFU，其敏感性較常規(guī)的RT-PCR高10倍，可同時(shí)用于高致病力和低致病力H9亞型AIV的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)16個(gè)AIV亞型病毒和其他禽病毒病病原RNA的檢測(cè)，表明該方法只能特異性擴(kuò)增H9亞型AIV，具有良好的特異性。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒具有用樣少、特異性強(qiáng)、敏感性高、快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，為H9亞型禽流感的防控預(yù)警機(jī)制提供了簡(jiǎn)捷、有效的早期快速診斷途徑。


圖1為不同濃度底物進(jìn)行RT-LAMP以及RT-PCR的敏感性擴(kuò)增結(jié)果；圖IA為H9-RT-LAMP擴(kuò)增結(jié)果；圖IB為H9-RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；1-8所對(duì)應(yīng)的病毒 RNA 濃度為分別為 1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、0. 001PFU、0. 000IPFU圖2為不同濃度的底物濃度進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)控圖顯示結(jié)果；1-8 所對(duì)應(yīng)的病毒 RNA 濃度為分別為 1000PFU、1OOPFU, 10PFU、1PFU、0. 1PFU、 0.01PFU、0. 001PFU、0. 000IPFU圖3為用RT-LAMP檢測(cè)Hl H16亞型禽流感病毒的實(shí)時(shí)監(jiān)控圖顯示結(jié)果；1. MD/HLJ/390/06 (HlNl) ；2. MD/HLJ/135/06 (H2N2) ；3. MD/HLJ/90/06 (H3N2)； 4.MD/HLJ/499/06 (H4N6) ；5.DK/AH/1/06 (H5N1) ；6.MD/HLJ/87/06 (H6N1)； 7.CK/HeB/1/02(H7N2) ；8.A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04(H8N1) ；9.CK/ HuN/33/08 (H9N2) ；10.MD/HLJ/108/06 (H10N2) ；11.MD/HLJ/80/06 (H11N2) ；12.A/ Duck/Alberta/60/76(H12N5) ；13.A/gull/Maryland/704/77(H13N6) ；14.A/mallard/ Gurjer/263/82 (H14N5) ； 15.A/duck/AUST/34/83 (H15N8) ； 16.A/cormonant/ Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；圖4為用RT-LAMP檢測(cè)Hl H16亞型禽流感病毒的特異性試驗(yàn)結(jié)果；1. MD/HLJ/390/06 (HlNl) ；2. MD/HLJ/135/06 (H2N2) ；3. MD/HLJ/90/06 (H3N2)； 4.MD/HLJ/499/06 (H4N6) ；5.DK/AH/1/06 (H5N1) ；6.MD/HLJ/87/06 (H6N1)； 7.CK/HeB/1/02(H7N2) ；8.A/wigeon/Denmark/77-66157-G8/04(H8N1) ；9.CK/ HuN/33/08 (H9N2) ；10.MD/HLJ/108/06 (H10N2) ；11.MD/HLJ/80/06 (H11N2) ；12.A/ Duck/Alberta/60/76(H12N5) ；13.A/gull/Maryland/704/77(H13N6) ；14. A/mallard/ Gurjer/263/82 (H14N5) ； 15.A/duck/AUST/34/8 3 (H15N8) ； 16.A/cormonant/ Denmark/74-68899-G2/02(H16N3)；圖5為用RT-LAMP檢測(cè)其它禽病病毒核酸的特異性試驗(yàn)結(jié)果；M :DL2000DNAMarker ；1 :H9N2 ；2 雞新城疫病毒(NDV) ；3 雞傳染性支氣管炎病毒 (IBV) ；4:雞傳染性法氏囊病毒(IBDV) ；5:雞馬立克氏病病毒(MDV) ；6 雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV) ；7 雞傳染性貧血病毒(CIAV) ；8 雞白血病病毒(ALv)；圖6為用RT-LAMP檢測(cè)其它禽病病毒核酸的實(shí)時(shí)監(jiān)控圖顯示結(jié)果。1 :H9N2 ；2 雞新城疫病毒(NDV) ；3 雞傳染性支氣管炎病毒(IBV) ；4 雞傳染性法氏囊病毒(IBDV) ；5 雞馬立克氏病病毒(MDV) ；6 雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV) ；7 雞傳染性貧血病毒(CIAV) ；8 雞白血病病毒(ALV)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例11試驗(yàn)材料和方法

1.1毒株和試劑本試驗(yàn)所用禽流感病毒Hl H16亞型標(biāo)準(zhǔn)參考毒株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；H9亞型禽流感病毒及其雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)、雞白血病病毒(ALV)(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。RNA Amplification Kit (RT—LAMP)禾口 Fluorescent Detection Reagent 購(gòu)自日本榮研公司；RNAgents Total RNA Isolation 系統(tǒng)和 Access RT-PCR系統(tǒng)均購(gòu)自 Promega 公司。10日齡SPF雞胚、6周齡SPF雞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有SPF雞都在負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。1. 2LAMP引物的設(shè)計(jì)和合成分析了流感數(shù)據(jù)庫(kù)中H9亞型流感病毒HA基因序列的同源性，找出HA基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)了 6個(gè)引物，分別是外引物(H9-F3(SEQ ID No. 1所示)和H9-B3 (SEQ ID No. 2 所示))，內(nèi)引物H9-FIP(SEQ ID No. 3所示)和H9-BIP (SEQ ID No.4所示))和環(huán)引物 (H9-LF (SEQ ID No. 5 所示)和 H9_LB(SEQ ID No. 6 所示))(表 1)。表1 RT-LAMP引物序列
長(zhǎng)度
引物名稱類型序列(5’ to 3’) _(s)_
H9-F3 正向外引物 18-mer CAGTTCGGCTTTCTGCTG ( SEQID No. 1 )
H9-B3 反向外引物 18-mer AATGGAACACCCAACTCA ( SEQID No.2)
AGTGCAAATTGATAACATTTACCGGGGGACATTTGGGTGACAAG
「00481 H9-FIP 正向內(nèi)引物 44-mer
(SEQ ID No.3 )
TGGACAACAAACACTCAAATGGCTTCATTAAAAGGGTTCGATGAG
H9-BIP 反向內(nèi)引物 45-mer
(SEQ ID No.4 )
H9-LB 正向環(huán)引物 18-mer ACAATACATGATAGAATC ( SEQID No.5) H9-LF 反向環(huán)引物 22-mer ATCACATGACACATAAGGTTCT ( SEQ ID No.6)1.3RNA 提取RNA的提取采用Trizol LS試劑盒(inVitrogen公司)。病毒尿囊液或口咽泄殖腔拭子按常規(guī)處理后，取樣品250ul，加750ul Trizol LS裂解液，混合震蕩5分鐘(盡量保證裂解后的液體透明)，加200ul氯仿，12000轉(zhuǎn)，4°C離心15分鐘，取上清，加500ul異丙醇， 室溫沉淀10-15分鐘，12000轉(zhuǎn)，4°C離心15分鐘，棄上清，緩慢加入75%乙醇洗沉淀一次， 倒置濾紙吸干管壁余液，真空抽干或37°C烘干，加入無(wú)RNA酶的水20ul，-70°C保存?zhèn)溆谩?
1. 4RT-LAMP 和 RT-PCR 的反應(yīng)體系 H9-RT-LAMP 反應(yīng)總體積為 25 μ L,組成成分如下=Reaction Mix 12. 5 μ L ；IOOpmol H9 FIP 0.4 μ L、100p mol H9 BIP 0.4 μ LUOp mol H9 F3 0. 5 μ LUOp mol H9 B30. 5μ L, IOOp mol Η9 LF 0. 2 μ L, IOOp mol Η9 LB 0. 2 μ L, Enzyme Mix 1 μ L，加入 5. OyL抽提獲得的RNA到體系中，加Distilled Water至25 μ L，置于濁度儀、PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為62. 5°C反應(yīng)lh，80°C作用IOmin結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)物中加入1. 0μ L 的 Fluorescent Detection Reagent,艮口可直接 示結(jié)果陽(yáng)性反應(yīng)發(fā)出綠色熒光，陰性反應(yīng)保持原黃色不變；或用2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)特有的梯狀條帶，陰性反應(yīng)則無(wú)條帶出現(xiàn)。H9-RT-PCR的弓|物序列為H9Up :5， TCAACAAACTCCACCGAAACTGT3，；H9Low 5' TCCCGTAAGAACATGTCCATACCA3，；擴(kuò)增片段大小為732bp。反應(yīng)總體積為25 μ L，組成成分如下5. 0 μ L 5Χ反應(yīng)緩沖液、0.5yL 10M dNTPU. 0μ L 15Μ 硫酸鎂、0· 25 μ L 20pmol H9 Up,0. 25 μ L20p mol Η9 Low.O. 5μ L A MV反轉(zhuǎn)錄酶、0. 5yL Taq DNA聚合酶、14 μ L DEPC處理的滅菌雙蒸水。加入2. 5μ L RNA到體系，置于PCR儀反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)為45°C逆轉(zhuǎn)錄45min，94°C預(yù)變性2min， 94°C 30s,52°C 45s,68°C 45s，；35 個(gè)循環(huán)，最后 68°C延伸 &iiin。PCR 產(chǎn)物用 1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析(Hongmei, et al，2009)。1. 5敏感性試驗(yàn)對(duì)測(cè)定病毒含量的H9亞型標(biāo)準(zhǔn)參考毒株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)(Garten et al,1985)的尿囊液提取核酸，將抽提所得的H9AIV總RNA進(jìn)行10倍倍比稀釋(分別為 1000PFU、100PFU、10PFU、1PFU、0. 1PFU、0. 01PFU、0. 001PFU、0. 0001PFU)。對(duì)上述各濃度 RNA 用H9-RT-LAMP和H9-RT-PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。1. 6特異性試驗(yàn)用該H9-RT-LAMP方法分別檢測(cè)Hl H16亞型禽流感標(biāo)準(zhǔn)參考毒株，檢測(cè)不同亞型病毒之間是否存在非特異性擴(kuò)增。檢測(cè)雞新城疫病毒(NDV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、雞傳染性貧血病毒(CIAV)、雞白血病病毒(ALV)等其他7種禽病病原，檢測(cè) H9-RT-LAMP方法的特異性。H9AIV毒株作為陽(yáng)性對(duì)照。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. IRT-LAMP的敏感性結(jié)果由病毒含量為IO3PFU的H9RNA，進(jìn)行10倍倍比稀釋后用本發(fā)明的RT-LAMP檢測(cè)試劑盒和RT-PCR方法進(jìn)行平行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RT-PCR方法可檢測(cè)IPFU滴度的病毒(圖IB所示)，RT-LAMP反應(yīng)的特征性階梯狀條帶亮度隨濃度減少有漸暗的改變(圖IA所示)，最終病毒在0. IPFU時(shí)仍然可以擴(kuò)增出明顯的階梯狀目的條帶(圖IA和B)，即可敏感地檢測(cè)到 0. IPFU的病毒核酸，比常規(guī)RT-PCR方法(圖1B)敏感10倍，RT-LAMP擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)控圖顯示(如圖2所示)，隨著稀釋度的增加，反應(yīng)曲線的起始點(diǎn)向后逐漸推移，表明該方法對(duì)濃度的變化很敏感。2. 2RT-LAMP的特異性結(jié)果為了檢測(cè)H9-RT-LAMP的引物的特異性，用RT-LAMP檢測(cè)Hl H16亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考毒株，結(jié)果表明僅對(duì)H9亞型禽流感病毒擴(kuò)增出特征性階梯狀條帶和呈現(xiàn)綠色熒光(如圖4所示)。H9-RT-LAMP擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)控圖也顯示僅有H9亞型禽流感病毒有擴(kuò)增曲線，其它亞型病毒則呈陰性結(jié)果(如圖3所示)。同時(shí)對(duì)雞新城疫等其他7種禽病也進(jìn)行了檢測(cè)，其他禽病核酸也沒(méi)有擴(kuò)增出特征性階梯狀條帶和顯示出綠色熒光(如圖5所示)。，H9-RT-LAMP擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)控圖也顯示僅有H9亞型禽流感病毒有擴(kuò)增曲線，其它禽病病毒核酸 則呈陰性結(jié)果(如圖6所示)。表明本發(fā)明RT-LAMP檢測(cè)試劑盒能特異性擴(kuò)增 H9亞型禽流感病毒，而不與其它亞型的AIV和其它禽病病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。另外，通過(guò)對(duì)加入環(huán)引物的前后進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，環(huán)引物的加入可以大大縮短反應(yīng)時(shí)間，由原來(lái)的60min 可縮短為30min。
權(quán)利要求
1.一種用于H9亞型禽流感病毒檢測(cè)的RT-LAMP引物組，其特征在于所述的RT-LAMP引物組由一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物組成；所述外引物對(duì)序列分別為SEQ ID No. 1 和SEQ ID No. 2所示，所述內(nèi)引物對(duì)序列分別為SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，所述環(huán)引物對(duì)序列分別為SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示。
2.一種檢測(cè)H9亞型禽流感病毒的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1所述的引物組對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的擴(kuò)增反應(yīng)是將反應(yīng)管置于PCR儀或恒溫水浴槽中，循環(huán)參數(shù)為62. 5°C反應(yīng)lh，80°C作用IOmin結(jié)束反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1所述的RT-LAMP引物組在制備檢測(cè)或診斷H9亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途。
5.一種用于H9亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測(cè)的試劑盒，包括Reaction Mix、Enzyme Mix和Distilled Water，其特征在于還包括熒光檢測(cè)試劑及權(quán)利要求1所述的引物組。
6.按照權(quán)利要求5所述的H9亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的熒光檢測(cè)試劑是Fluorescent Detection Reagent，購(gòu)自日本榮研公司。
7.權(quán)利要求5或6所述的H9亞型禽流感病毒RT-LAMP檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)或診斷 H9亞型禽流感病毒的生物試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一組用于H9亞型禽流感病毒檢測(cè)的RT-LAMP引物組、檢測(cè)方法及應(yīng)用，所述的引物組由一對(duì)外引物，一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物組成；所述外引物對(duì)序列分別如SEQ ID No.1、2所示，內(nèi)引物對(duì)序列分別如SEQ ID No.3、4所示，環(huán)引物對(duì)序列分別如SEQ ID No.5、6所示。本發(fā)明的引物組可用于制備H9亞型禽流感病毒檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包括Reaction Mix；Enzyme Mix；DistilledWater；熒光檢測(cè)試劑以及本發(fā)明的引物組。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒具有用樣少、特異性強(qiáng)、敏感性高、快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，為H9亞型禽流感的防控預(yù)警機(jī)制提供了簡(jiǎn)捷、有效的早期快速診斷途徑。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102329891SQ201110255250
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者包紅梅, 王秀榮, 陳化蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所