專利名稱：甘菊微管蛋白基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種遺傳工程的DNA的分離、制備、純化和應(yīng)用，特別涉及一種編碼植物蛋白質(zhì)的基因的分離、制備純化和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)的遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch. ex Trautv. )Makino]又名巖香菊，甘野菊，是菊科菊屬的二倍體植物，為栽培菊花(c. Xmorifolium)的野生近緣種，是一種廣布于我國華北山地的短日照鹽生植物，目前已經(jīng)作為栽培菊花研究上的模式植物得到深入研究。探討其相關(guān)生物學(xué)問題，可以為解析栽培菊花主要觀賞性狀形成的機(jī)理提供參考資料，也為菊花分子育種研究奠定基礎(chǔ)。目前關(guān)于甘菊抗逆和成花分子機(jī)理的研究已取得了一定的進(jìn)展，但內(nèi)參基因只有肌動(dòng)蛋白基因Actin和^S rRNA基因可供使用。因此， 發(fā)掘甘菊更多的內(nèi)參基因，有利于提高基因表達(dá)模式研究的穩(wěn)定性、可靠性和重復(fù)性。在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行基因表達(dá)定量分析時(shí)，應(yīng)用看家基因(Housek^ping genes)作為內(nèi)參基因(Reference genes)對目標(biāo)基因表達(dá)量進(jìn)行校正是最為通用、可靠的方法。任何一種看家基因的所謂恒定表達(dá)都只是在一定類型的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)因素作用下恒定，理想的看家基因應(yīng)該是參與植物基礎(chǔ)新陳代謝過程中組成型表達(dá)的基因，如蛋白質(zhì)代謝途徑和糖代謝途徑中的基因。目前較多使用的主要有甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)、植物延伸因子基因(EF-Ia)、多聚泛素基因(p0lyubiquitin，p0lyUB)、肌動(dòng)蛋白基因(Actin)和微管蛋白中的α、β家族基因(α/β-tubulin)。微管蛋白(tubulin)是細(xì)胞的一種骨架蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)環(huán)流、形狀維持、運(yùn)動(dòng)、分裂、分化、物質(zhì)運(yùn)輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及極性建成等重要的生理活動(dòng)，可以分為α、β、Y、 δ、ε等多種亞家族，其中α-tubulin蛋白和β-tubulin蛋白組成一種異源二聚體蛋白， 其基因通常呈現(xiàn)組成型表達(dá)，但是，大量研究表明α-tubulin基因在多種植物不同器官中是非組成型表達(dá)，例如α-tubulin基因在高等植物中以小基因家族發(fā)揮作用，擬南芥、楊樹、葡萄和大麥中的數(shù)目分別為6、8、7、5，這些基因按照其編碼氨基酸C端的多態(tài)性可分為兩類(I和II)，此兩類α-tubulin基因在植物中的表達(dá)模式有很大差異，如歐洲山楊中的 I類α -tubulin基因，除PtTUA7(即ClTUA基因的同源基因)外，其余成員均在木質(zhì)部中表達(dá)豐度最高，而II類PtTUA基因在各器官中均表達(dá)豐度很低；擬南芥中的I類α -tubulin 基因(AtTUA2/4)在各器官中組成型表達(dá)，而II類基因中的AtTUAl只在花部表達(dá)；大麥中， HvTUA2/4基因在葉部分生組織表達(dá)，HvTUAl/5在有絲分裂后期表達(dá)，而HvTUA3只在分裂中期微絲形成時(shí)表達(dá)。目前，在甘菊抗逆和成花分子機(jī)理等基因表達(dá)分析的相關(guān)研究中通常選用肌動(dòng)蛋白基因rRNA基因作為內(nèi)參基因。然而，越來越多的研究證明僅使用Actin基因作為內(nèi)參會(huì)造成實(shí)驗(yàn)的精確性降低。此外，很多研究均已表明核糖體RNA不適合用于內(nèi)參在基因表達(dá)研究中使用，尤其是不同組織中的mRNA和rRNA含量比例不同，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果錯(cuò)誤，例如在有絲分裂期間，ISSrRNA明顯減少或停止表達(dá)。
有研究者進(jìn)行了菊屬植物候選內(nèi)參基因的篩選，如Gu等(參考文獻(xiàn)Gu C，Chen S Μ, Liu Z 1, et al. Reference gene selection for quantitative real-time PCR in Chrysanthemum subjected to biotic and abiotic stress. Mol Biotechnol, doi 10. 1007/sl2033-011-9394-6)研究表明EFl-α基因在研究菊花響應(yīng)生物脅迫時(shí)適用，而在水分脅迫過程中表達(dá)量變化較大；ΡΡ2Α基因則與之相反，在生物脅迫過程中表現(xiàn)較差， 在熱、水分脅迫過程中表達(dá)恒定；而廣泛使用的內(nèi)參基因Actin在上述脅迫過程中均表現(xiàn)較差。因此，發(fā)掘出更穩(wěn)定表達(dá)的甘菊內(nèi)參基因，將有利于提高甘菊基因表達(dá)分析研究的穩(wěn)定性、可靠性和重復(fù)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題提供一種在甘菊各生長發(fā)育階段及甘菊在各種生長環(huán)境下均能穩(wěn)定表達(dá)的甘菊α-tubulin同源基因、其基因序列片段以及它們作為內(nèi)存基因的應(yīng)用。本發(fā)明的甘菊α-tubulin同源基因不僅能在甘菊生長的各個(gè)階段一致性表達(dá)，而且能在各種不利環(huán)境中一致性表達(dá)，可用于分析甘菊的抗逆基因表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch. ex Trautv. )Makino]微管蛋白同源基因(α -tubulin 同源基因) 片段(EST系列片段)，其堿基為SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明首先以甘菊成年功能葉片為原料，提取總RNA，接著進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，然后根據(jù)已知的植物微管蛋白同源基因設(shè)計(jì)簡并引物，以合成的甘菊為模板，進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增；最后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，即得到甘菊微管蛋白同源基因(a-tubulin同源基因)序列片段(EST系列片段)。其中，設(shè)計(jì)的簡并引物如下CITUA-JBs 5' -TCTGTTGTYGAGCCYTACAACAGTGT-3‘ ；(SEQ ID NO 5)CITUA-JBx 5' -TAGTTRATWCCRCACTTGAAYCC-3‘。(SEQ ID NO :6)其中，Y、R、W為簡并堿基，Y = C/T(l 1) ；R = A/G(l 1) ；W = A/T(l 1)。另一方面提供一種甘菊微管蛋白基因系列片段作為菊屬植物內(nèi)參基因的用途，特別是作為甘菊內(nèi)參基因的用途。本發(fā)明再一方面提供一種甘菊微管蛋白基因(C1TUA基因)，其堿基為SEQ ID NO 4。又一方面提供一種甘菊微管蛋白基因(C1TUA基因)作為菊屬植物內(nèi)參基因的用途，特別是作為甘菊內(nèi)參基因的用途。本發(fā)明根據(jù)甘菊微管蛋白基因EST序列使用RACE技術(shù)獲得了該基因的全長序列， 命名為ClTUA基因，生物信息學(xué)分析表明，ClTUA基因全長cDNA序列為1580bp，其中開放閱讀框1350bp，編碼449個(gè)氨基酸。對其推測氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析證明其為植物 I類α-tubulin基因的同源序列。使用甘菊內(nèi)參基因ClActin和^S rRNA基因?yàn)殛栃詫φ?，利用RT-PCR研究ClTUA基因在鹽、干旱、冷、熱、脫落酸和水楊酸脅迫下及甘菊不同生長發(fā)育階段的樣本間的表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果表明C1TUA基因不僅在非生物脅迫下表達(dá)穩(wěn)定， 而且在不同生長發(fā)育階段樣本中穩(wěn)定表達(dá)；甘菊ClTUA基因的表達(dá)穩(wěn)定性優(yōu)于ClActin和甘菊^SrRNA基因，可以作為研究甘菊抗逆性和生長發(fā)育過程中基因表達(dá)的內(nèi)參基因。本發(fā)明的甘菊微管蛋白基因(C1TUA基因)以及其基因系列片段(EST系列片段) 的表達(dá)量在植物甘菊中具有較高的表達(dá)水平，發(fā)掘出更穩(wěn)定表達(dá)的甘菊內(nèi)參基因，將有利于提高甘菊基因表達(dá)分析研究的穩(wěn)定性、可靠性和重復(fù)性。


圖1是通過同源克隆技術(shù)獲得的甘菊α -tubulin同源基因序列片段的凝膠電泳圖；圖2是甘菊α -tubulin同源基因(C1TUA基因)3’末端擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；圖3是甘菊α -tubulin同源基因(C1TUA基因)5’末端擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；圖4是甘菊α -tubulin同源基因(C1TUA基因)全長擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；圖5是鹽脅迫處理后甘菊ActinJ6S rRNA及α-tubulin同源基因(C1TUA基因) 表達(dá)的凝膠電泳圖；圖6是水楊酸脅迫處理后甘菊Actin，26S rRNA及α -tubulin同源基因(C1TUA 基因)表達(dá)的凝膠電泳圖；圖7是干旱處理后甘菊Actin，26S rRNA及α -tubulin同源基因(C1TUA基因) 表達(dá)的凝膠電泳圖；圖8是冷脅迫處理后甘菊Actin，^S rRNA及α-tubulin同源基因(C1TUA基因) 表達(dá)的凝膠電泳圖；圖9是熱脅迫處理后甘菊Actin，^S rRNA及α-tubulin同源基因(C1TUA基因) 表達(dá)的凝膠電泳圖；圖10是脫落酸(ABA)誘導(dǎo)處理后甘菊Actin，26S rRNA及α -tubulin同源基因 (C1TUA基因)表達(dá)的凝膠電泳圖；圖11是甘菊各生長發(fā)育階段葉片ActinJ6S rRNA及α-tubulin同源基因 (C1TUA基因)表達(dá)的凝膠電泳圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。說明以下具體實(shí)施例中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實(shí)施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來進(jìn) ，包 舌Sambrook 等入，Molecular Cloning, ALaboratory Manual (^13 . Cold Spring Harbor Lab Press, 2001) 0王關(guān)林，方宏筠?！吨参锘蚬こ淘砼c技術(shù)》(第2版?？茖W(xué)出版社，2002)一、材料及試劑1、甘菊各生長階段試驗(yàn)材料的制備(1)種子材料于2009年12月份在北京林業(yè)大學(xué)苗圃內(nèi)采集甘菊種子作為種子材料，采種植株生長良好，種子成熟飽滿，種皮完好；種子材料在采集后迅速置于液氮中速凍，保存于_80°C超低溫冰箱中，備用。(2)幼葉、成年功能葉片、莖段材料、根系材料將甘菊種子浸泡于體積百分比濃度為2. 5%的次氯酸鈉溶液中，浸泡消毒IOmin 后用無菌水沖洗3-5次，用無菌干燥的濾紙上吸干表面水分，播種于蛭石草炭土(1 1) 的花盆中，置于人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)。人工氣候室的培養(yǎng)條件為相對濕度80%，恒溫20-240C，光照強(qiáng)度80-200umol/ M2/S，光照周期為1 黑暗/ 光照培養(yǎng)。分別采集種子萌發(fā)后長出的第一對真葉作為幼葉材料；待植株生長至10-12對真葉時(shí)，采集作為自上部頂芽向下數(shù)的第5-6對真葉作為成年功能葉片材料；采集10-12對真葉植株的莖段作為莖段材料；將植株小心從花盆中取出，洗凈培養(yǎng)土采集根系(包括主根、 須根一起采集)作為根系材料，此時(shí)根系長10-15厘米。幼葉材料、成年功能葉片、莖段、根系材料分別在采集后迅速置于液氮中速凍，保存于-80°C超低溫冰箱中，備用。(3)短日照誘導(dǎo)葉片、花蕾、花瓣、開花后衰老葉片采用與“幼葉材料”培養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)甘菊種子，待種子萌發(fā)后的植株生長至4-5對真葉時(shí)，將一部分植株移至短日照人工氣候室培養(yǎng)(條件為相對濕度80%， 恒溫20-24C，光照強(qiáng)度80-200umOl/M2/S，光照周期為12h黑暗/12h光照培養(yǎng)，且此時(shí)甘菊葉片已完成“童期”，可以感受短日照)，培養(yǎng)50d后，植株生長至10-12對真葉后，采集自頂芽向下數(shù)的第5-6對真葉作為短日照誘導(dǎo)葉片材料；待培養(yǎng)60d時(shí)，甘菊已現(xiàn)蕾，采集花蕾(直徑約5mm)；繼續(xù)培養(yǎng)約10-20d，甘菊的頭狀花序已完全開放，此時(shí)采集花瓣作為材料；繼續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)月后，甘菊已完成開花、結(jié)種，此時(shí)葉片趨于衰老(植株葉片數(shù)2014對真葉)，采集自頂芽向下數(shù)的第5-6對真葉作為衰老葉片葉片材料。上述各材料在采集后分別迅速置于液氮中速凍，然后保存于-80°C超低溫冰箱中，(4)各種脅迫處理材料采用與“成年功能葉片材料”培養(yǎng)條件相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)甘菊種子，待種子萌發(fā)后的植株生長至4-5對真葉時(shí)進(jìn)行各種脅迫處理，具體操作步驟如下(4-1)鹽脅迫處理材料用200mM的NaCl溶液澆灌穴盤苗進(jìn)行鹽脅迫處理，其中，NaCl溶液的澆灌量為 200ml/盆/次，每24h澆灌一次；采集NaCl溶液澆灌0h、2h、12h、Mh的自頂芽向下數(shù)的第 2-3對真葉葉片作為鹽脅迫處理材料，分別為鹽脅迫_1、2、3、4，各鹽脅迫材料，在采集后分別迅速置于液氮中速凍，保存于-80°C超低溫冰箱中，備用。(4-2)水楊酸脅迫處理材料用3mM的水楊酸溶液澆灌穴盤苗進(jìn)行脅迫處理，其中，澆灌量為IOOml/盆/次，每 24h澆灌一次；采集水楊酸溶液澆灌0h、2h、12h、Mh的自頂芽向下數(shù)的第2-3對真葉葉片作為水楊酸脅迫處理材料，分別為水楊酸脅迫_1、2、3、4，各脅迫材料，在采集后分別迅速置于液氮中速凍，保存于-80°C超低溫冰箱中，備用。(4-3)干旱脅迫處理材料將甘菊苗從花盆中取出，用蒸餾水洗凈根系，放置于含水率為50%的潤濕的脫脂棉中進(jìn)行干旱脅迫處理；采集干旱處理0h、2h、12h、24h后的真葉葉片作為干旱脅迫處理材料，分別為干旱脅迫-1，2，3和4，材料分別迅速置于液氮中速凍，保存于-80°C超低溫冰箱，(4-4)冷脅迫處理材料將甘菊苗置于4°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行冷脅迫處理；培養(yǎng)條件相對濕度80%，光照強(qiáng)度 80-200umOl/M2/S，光照周期為16h黑暗/8h光照培養(yǎng)；采集冷脅迫處理0h、2h、12h、24h后的真葉葉片作為冷脅迫處理材料，分別為冷脅迫-1，2，3和4，各材料迅速置于液氮中速凍， 然后保存于-80°C超低溫冰箱中，備用。(4-5)熱脅迫處理材料將甘菊苗置40°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱脅迫處理；培養(yǎng)條件相對濕度80%，光照強(qiáng)度 80-200umOl/M2/S，光照周期為16h黑暗/8h光照培養(yǎng)；采集熱脅迫處理0h、2h、12h、24h后的真葉葉片作為熱脅迫處理材料，分別為熱脅迫-1，2，3和4，各材料迅速置于液氮中速凍， 然后保存于-80°C超低溫冰箱中，備用。(4-6)脫落酸(ABA)誘導(dǎo)脅迫處理材料用200 μ M的ABA溶液噴施甘菊葉片，進(jìn)行ABA誘導(dǎo)脅迫處理，其中，噴施量為 50ml/盆/次，每24h噴施一次；采集ABA脅迫處理0h、2h、l i、24h后的真葉葉片作為ABA 誘導(dǎo)脅迫處理材料，分別為ABA脅迫-1，2，3和4，各材料迅速置于液氮中速凍，然后保存于_80°C超低溫冰箱中，備用。2、試劑M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Promega公司)；DNA回收試劑盒(Easy Pure Quick Gel Extraction Kit, TransGenBiotech 公司)；cDNA 末端快速擴(kuò)增試劑盒(BD SMART RACE cDNA Amplification Kit，Clontech公司)；pMD18_T vector載體(大連寶生物生物公司)； 大腸桿菌DH5-a感受態(tài)細(xì)胞CTransGenBiotech公司)；Trizol試劑(美國英俊公司)；RNA 助沉劑、RNase抑制劑(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)二、試驗(yàn)方法 1、甘菊材料總RNA的提取1)將采集的成年功能葉片從超低溫冰箱中取出后，立即置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮進(jìn)行快速研磨成粉末；2)在2ml離心管中加入800 μ ITrizol試劑，取上述研磨好的成年功能葉片粉末 lg，加入到離心管中，劇烈振蕩15s，使各甘菊材料的細(xì)胞裂解；裂解液在室溫下放置5min 后，于4°C，12000rpm下離心15min，得到上清液；3)將上清液轉(zhuǎn)移至2ml離心管后，向各離心管中分別加入水飽和酚(pH = 5. 0，北京拜爾迪公司)、氯仿和異戊醇的混合液，其中氯仿與異戊醇的體積比為M 1，水飽和酚的體積與氯仿和異戊醇的混合體積之比為1 3;將各離心管振蕩均勻，加入水飽和酚、氯仿和異戊醇的混合液的作用為去除材料中的蛋白質(zhì)和DNA;在室溫下放置2-aiiin即分為三層，下層為酚相(DNA溶解于酚相)，中層為蛋白相，上層為水相(RNA溶解于水相)。于4°C， 12000rpm下離心lOmin，得到上清液(含有RNA的水相)；4)將步驟幻制備的上清液分別轉(zhuǎn)移至2ml離心管后，向各離心管中分別加入體積比為M 1的氯仿與異戊醇的混合液重復(fù)抽提三次，用以去除細(xì)胞中不溶性的蛋白質(zhì)、多糖、多酚等大分子物質(zhì)，得到各甘菊 材料的總RNA提取液；5)分別向RNA提取液中加入(0. 7倍體積)異丙醇和10 μ IRNA助沉劑(RNAdown)， 于-70°C下靜置20min，使RNA沉淀；將靜置后的提取液在4°C，12000rpm下離心15min，棄
掉上清，得到沉淀；6)用70%乙醇洗滌沉淀后，再次用無水乙醇洗滌沉淀，將沉淀晾干，用50 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的雙蒸水(即DEPC ddH20)溶解沉淀，在溶解RNA沉淀的同時(shí)加入 1 μ IRNase抑制劑，以延長RNA保存時(shí)間，得到甘菊成年葉片的總RNA溶液；7)用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測甘菊材料總RNA，使用Smart Spec Pluss分光光度計(jì)測定濃度，將各甘菊材料總RNA溶液定量為IOOOng/ μ L，置于_70°C超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?、甘菊RNA的反轉(zhuǎn)錄用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒對各種甘菊材料總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，具體步驟為PCR管中分別加入上述甘菊材料總RNA 3μ 1, Oligo dT 3μ1，再加入 DEPC ddH20至15μ 1，在70°C水浴中變性5min，立即冰浴lmin，微離心，然后依次加入MLV 5Xbuffer 5. 0μ 1, IOmM dNTP 2· 5 μ 1，RNase 抑制劑 0· 5 μ 1，MMLVRTase 1. 0μ 1, DEPC ddH20 1· 0 μ 1，反應(yīng)體系為 25 μ 1 ；將PCR管放入PCR儀中，于42°C孵育90min，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放置于-20°C保存?zhèn)溆茫?、甘菊α -tubulin同源基因片斷擴(kuò)增根據(jù)GenBank已發(fā)表的相關(guān)同源基因的氨基酸保守序列和核苷酸序列(煙草 Nicotiana tabacum alpha-tubulin, AJ421413.1 ；茶樹 Camellia sinensis alpha tubulin 1，DQ340766. 2 ；龍目艮 Dimocarpus longan alpha-tubulin, FJ479617. 1 ；陸地豐帛 Gossypium hirsutum alpha-tubulin, EF151305. 1)，設(shè)計(jì)簡并引物，利用 RT-PCR技術(shù)，從步驟2得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中分離甘菊α-tubulin基因的同源序列，其中簡并引物序列為CITUA-JBs 5' -TCTGTTGTYGAGCCYTACAACAGTGT-3‘；CITUA-JBx 5' -TAGTTRATWCCRCACTTGAAYCC-3 ‘；其中 Y、R、W 為簡并堿基，Y = C/ T(1 1) ；R = A/G(l 1) ；W = A/T(l 1)。PCR反應(yīng)程序如表1所示表1甘菊α -tubulin同源片斷的RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序
權(quán)利要求
1.一禾中甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium(Fisch. ex Trautv. )Makino]微管蛋白同源基因片段，其特征在于其堿基為SEQ ID NO 1所示。
2.如權(quán)利要求1所述同源基因片段的制備方法，包括如下步驟1)提取甘菊葉片總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；2)設(shè)計(jì)簡并引物，對甘菊cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；3)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，即得。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟2)中所述的簡并引物分別為SEQID NO 5 和 SEQ ID NO 6 所示。
4.如權(quán)利要求1所述同源基因片段作為研究甘菊抗逆性中基因表達(dá)的內(nèi)參基因的用途。
5.如權(quán)利要求1所述同源基因序列片段作為研究甘菊生物發(fā)育過程中基因表達(dá)的內(nèi)參基因的用途。
6.一種甘菊微管蛋白同源基因，其特征是在于，其堿基為SEQ ID N0:4所示。
7.如權(quán)利要求6所述的甘菊微管蛋白同源基因作為研究甘菊抗逆性中基因表達(dá)的內(nèi)參基因的用途。
8.如權(quán)利要求6所述的甘菊微管蛋白同源基因作為研究甘菊生物發(fā)育過程中基因表達(dá)的內(nèi)參基因的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘菊中的α-tubulin同源基因(ClTUA基因)，通過對甘菊總RNA進(jìn)行提取和反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，并采用同源克隆技術(shù)得到了甘菊中的α-tubulin基因的同源序列(SEQ ID NO1)，對該序列進(jìn)行全長擴(kuò)增得到了甘菊中的α-tubulin同源基因(ClTUA基因)。本發(fā)明得到的甘菊α-tubulin同源基因(ClTUA基因)在甘菊各生長發(fā)育階段及各種非生物脅迫條件下均能穩(wěn)定表達(dá)，適合在甘菊基因表達(dá)研究中作為內(nèi)參基因；此外，α-tubulin基因的表達(dá)量豐度并未達(dá)到飽和狀態(tài)，作為內(nèi)參基因可以使表達(dá)分析結(jié)果更加準(zhǔn)確，適宜作為研究甘菊抗逆性和生長發(fā)育過程中基因表達(dá)的內(nèi)參基因。
文檔編號C12N15/10GK102304523SQ201110277718
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者戴思蘭, 黃河 申請人:北京林業(yè)大學(xué)