專利名稱：Fgf-21活性測定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，更具體的說，本發(fā)明提供了成纖維生長因子-21 (FGF-21)的葡糖糖攝取激活活性的體外測定方法。
背景技術(shù)：
成纖維生長因子-21(Fibroblast Growth Factor-21，簡稱為 FGF-21)是一種不依賴胰島素調(diào)節(jié)血糖的代謝調(diào)節(jié)因子，作為一個(gè)有效的葡糖糖攝取激活劑。體內(nèi)檢測方法(包括用動(dòng)物模型進(jìn)行檢測)成本高，必要時(shí)還需要經(jīng)過人道審批， 因此體外測定是FGF-21葡糖糖攝取激活活性的最主要前期檢測方式。有文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)行 FGF-21活性檢測時(shí)使用[3H]或[14C]等放射性元素作標(biāo)記，獲得檢測結(jié)果，進(jìn)行分析。這樣， 監(jiān)測儀器的要求和放射性物質(zhì)的善后工作非常復(fù)雜和繁瑣，不適合作為生產(chǎn)中批產(chǎn)品的常規(guī)活性監(jiān)測方法。例如，中國專利申請(qǐng)200480035794記載了用[14C]標(biāo)記的葡萄糖進(jìn)行累積測定 FGF-21活性的方法；中國專利申請(qǐng)200580029480記載了用[14C]標(biāo)記的葡萄糖進(jìn)行累積測定FGF-21活性的方法，并利用成本更高的小鼠肥胖癥動(dòng)物模型來進(jìn)行體內(nèi)測定；中國專利 200810223501記載了用[14C]標(biāo)記的葡萄糖測定人重組FGF-21針對(duì)葡萄糖的活性的方法； 中國專利申請(qǐng)20080009653記載了用[3H]標(biāo)記的葡萄糖進(jìn)行測定FGF-21活性的方法；中國專利申請(qǐng)200910104653記載了用[14C]標(biāo)記的葡萄糖測定Exendin-4與FGF-21的融合蛋白針對(duì)葡萄糖的活性的方法。另外，由于FGF-21具有刺激細(xì)胞增殖的作用，因此有部分方法通過測定細(xì)胞增殖的程度來推算葡糖糖攝取激活活性。但是，這種方法的最大缺陷是沒有直接檢測葡萄糖攝取激活的活性，定性推測結(jié)果還差強(qiáng)人意，定性推算的結(jié)果就誤差較大了。例如，中國專利200810102542公開了用MTT法測定BaF3細(xì)胞增殖，從而表征 FGF-21生物活性的方法；中國專利申請(qǐng)200880017036公開了測定內(nèi)皮細(xì)胞增殖來表征 FGF-21生物活性的方法；中國專利申請(qǐng)200980130476公開了 ELK-用螢光素酶測定法針對(duì) 293T腎細(xì)胞測定FGF-21的生物活性。本發(fā)明根據(jù)長期研究和實(shí)踐，從大量的現(xiàn)有細(xì)胞系中，令人意外地發(fā)現(xiàn)了 HL-7702 人肝細(xì)胞和L6大鼠成肌細(xì)胞，基于它們進(jìn)行非放射性直接檢測FGF-21的葡糖糖攝取激活活性，結(jié)果在一定范圍內(nèi)使得FGF-21標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)值與葡糖糖攝取量呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，可以用于體外檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的成纖維細(xì)胞生長因子-21 (FGF-21)的葡糖糖攝取激活活性的體外測定方法。具體而言，本發(fā)明提供了成纖維細(xì)胞生長因子-21 (FGF-21)的葡糖糖攝取激活活性的體外測定方法，其依次包括
(a)培養(yǎng)HL-7702人肝細(xì)胞或者L6大鼠肌肉細(xì)胞；(b)任選使細(xì)胞分化；(C)細(xì)胞饑餓處理；(d)加入含F(xiàn)GF-21的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；和(e)檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖含量，優(yōu)選所述檢測不是放射性檢測。盡管現(xiàn)有大量的細(xì)胞系，但是經(jīng)測試，大量的細(xì)胞系在進(jìn)行上述檢測方法中，難以得到良好的線性關(guān)系的結(jié)果，這可能是各種細(xì)胞的代謝水平的差異化所決定的。由于大量細(xì)胞系中與FGF-21和葡萄糖代謝相關(guān)的細(xì)節(jié)并未很好地被揭示，因此難以形成規(guī)律化的指導(dǎo)。本發(fā)明人經(jīng)過艱苦研究，從大量細(xì)胞系中獲得了 HL-7702人肝細(xì)胞和L6大鼠肌肉細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們適于以上的方法中。優(yōu)選在本發(fā)明中，步驟(a)中的培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明人優(yōu)化了針對(duì)HL-7702人肝細(xì)胞和L6大鼠肌肉細(xì)胞的完全培養(yǎng)基。優(yōu)選在本發(fā)明中，步驟(b)中的分化所使用的培養(yǎng)基是分化液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明人優(yōu)化了針對(duì)HL-7702人肝細(xì)胞和L6大鼠肌肉細(xì)胞的分化液。優(yōu)選在本發(fā)明中，步驟(C)中的饑餓處理所使用的培養(yǎng)基是饑餓培養(yǎng)基。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明人優(yōu)化了針對(duì)HL-7702人肝細(xì)胞和L6大鼠肌肉細(xì)胞的饑餓培養(yǎng)基。優(yōu)選在本發(fā)明中，步驟(d)中的培養(yǎng)基是饑餓培養(yǎng)基。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明人優(yōu)化了針對(duì)HL-7702人肝細(xì)胞和L6大鼠肌肉細(xì)胞的饑餓培養(yǎng)基。優(yōu)選在本發(fā)明中，步驟(a)中培養(yǎng)的細(xì)胞是HL-7702人肝細(xì)胞，而且不進(jìn)行步驟 (b)。優(yōu)選其中，步驟(d)中培養(yǎng)基中的FGF-21濃度為0 100yg/mL。因?yàn)樵诖朔秶鷥?nèi)， 呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。優(yōu)選在本發(fā)明中，步驟(a)中培養(yǎng)的細(xì)胞是L6大鼠肌肉細(xì)胞，而且進(jìn)行步驟(b)。 優(yōu)選其中，步驟(d)中培養(yǎng)基中的FGF-21濃度為4 250yg/mL。因?yàn)樵诖朔秶鷥?nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。優(yōu)選在本發(fā)明中，步驟(e)中的檢測是用葡萄糖測定試劑盒進(jìn)行的檢測。本發(fā)明的有益效果在于，提供了替代現(xiàn)有技術(shù)的新測定方法，直接測定FGF-21的葡糖糖攝取激活活性，實(shí)施方便而廉價(jià)，測量的線性效果好。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)也是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本發(fā)明進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本發(fā)明說明書中重復(fù)敘述過一樣。


圖1顯示了用HL-7702人肝細(xì)胞測定FGF21的葡糖糖攝取激活活性的測定曲線。圖2顯示了用L6大鼠成肌細(xì)胞測定FGF21的葡糖糖攝取激活活性的測定曲線。
具體實(shí)施例方式以下本文將通過具體的實(shí)施例來描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國，2001年)等手冊(cè)和相關(guān)試劑的廠商說明來實(shí)施。另外，實(shí)施例中所使用的材料除有特別說明外，均可通過商業(yè)途徑從市場上購買。實(shí)施例1用HL-7702人肝細(xì)胞測定FGF21生物活性1、試劑和細(xì)胞株
基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI-1640 培養(yǎng)基，購自 Hyclone 公司(cat no. SH30809. 018)血清胎牛血清(FBS)，購自 Hyclone 公司(cat no. SV3087. 02)消化液0. 25%胰蛋白酶溶液，購自 Hyclone 公司(cat no. SH30042. 01)雙抗青霉素/鏈霉素溶液(100X)，購自HYclone公司(cat no. SV3OOlO)完全培養(yǎng)基79%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%血清+1%雙抗饑餓培養(yǎng)基99%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1%血清葡萄糖測定試劑盒，購自長春匯力生物技術(shù)有限公司(cat no. K077c)。HL-7702人肝細(xì)胞，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。2、培養(yǎng)過程取HL-7702人肝細(xì)胞，接種在5mL完全培養(yǎng)基中，于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長，隔天更換完全培養(yǎng)基，待至培養(yǎng)瓶內(nèi)的細(xì)胞匯合到80%左右(約培養(yǎng) 2天)，處于對(duì)數(shù)生長期，即可進(jìn)行活性測定。取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗三次后，加ImL 0. 25%胰酶溶液，鏡下觀察細(xì)胞間連接松散后，吸走胰酶溶液，再加入ImL完全培養(yǎng)基終止消化，用槍頭輕輕觸打混勻，取1(^1^細(xì)胞液計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋到5\104/!^。600 μ L/孔加入M孔板，于37°C ,5% CO2培養(yǎng)24h后，吸去培養(yǎng)基，加600 μ L饑餓培養(yǎng)基培養(yǎng)24h ；將 FGF-21標(biāo)準(zhǔn)品用饑餓培養(yǎng)基從100 μ g/mL開始2倍梯度稀釋。培養(yǎng)后，吸去培養(yǎng)基，每孔加各稀釋度FGF-21的培養(yǎng)基600 μ L，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行孔，對(duì)照組3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24h 后，取培養(yǎng)基上清液，用葡萄糖測定試劑盒測定培養(yǎng)基中葡萄糖含量。取無細(xì)胞的培養(yǎng)孔培養(yǎng)基作空白對(duì)照。酶標(biāo)儀510nm，37°C測定吸光度，按如下公式計(jì)算葡萄糖吸收率根據(jù)公式葡萄糖吸收率=(空白對(duì)照組葡萄糖含量-樣品組葡萄糖含量)/空白對(duì)照組葡萄糖含量X 100%。結(jié)果如圖1所示，在FGF-21濃度為0 100 μ g/mL的范圍內(nèi)，葡萄糖吸收率與 FGF-21濃度的以2為底的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。實(shí)施利2用L6大鼠成肌細(xì)胞測定TOF21生物活性1、試劑和細(xì)胞株
權(quán)利要求
1.成纖維細(xì)胞生長因子-21(FGF-21)的葡糖糖攝取激活活性的體外測定方法，其依次包括(a)培養(yǎng)HL-7702人肝細(xì)胞或者L6大鼠肌肉細(xì)胞；(b)任選使細(xì)胞分化；(c)細(xì)胞饑餓處理；(d)加入含F(xiàn)GF-21的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；和(e)檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖含量。
2.權(quán)利要求1所述的體外測定方法，其中步驟(a)中的培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基。
3.權(quán)利要求1所述的體外測定方法，其中步驟(b)中的分化所使用的培養(yǎng)基是分化液。
4.權(quán)利要求1所述的體外測定方法，其中步驟(c)中的饑餓處理所使用的培養(yǎng)基是饑餓培養(yǎng)基。
5.權(quán)利要求1所述的體外測定方法，其中步驟(d)中的培養(yǎng)基是饑餓培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求1所述的體外測定方法，其中步驟(a)中培養(yǎng)的細(xì)胞是HL-7702人肝細(xì)胞， 而且不進(jìn)行步驟(b)。
7.權(quán)利要求6所述的體外測定方法，其中步驟(d)中培養(yǎng)基中的FGF-21濃度為 0-100μ g/mL。
8.權(quán)利要求1所述的體外測定方法，其中步驟(a)中培養(yǎng)的細(xì)胞是L6大鼠肌肉細(xì)胞， 而且進(jìn)行步驟(b)。
9.權(quán)利要求8所述的體外測定方法，其中步驟(d)中培養(yǎng)基中的FGF-21濃度為 4-250 μ g/mL。
10.權(quán)利要求1所述的體外測定方法，其中步驟(e)中的檢測是用葡萄糖測定試劑盒進(jìn)行的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及成纖維細(xì)胞生長因子-21(FGF-21)的葡糖糖攝取激活活性的體外測定方法，其包括培養(yǎng)HL-7702人肝細(xì)胞或者L6大鼠肌肉細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12Q1/54GK102352407SQ201110315550
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者李婷婷, 李校堃, 王曉杰 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院