專利名稱：一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法
技術領域：
本發(fā) 明涉及醫(yī)學量值溯源領域，特別是涉及一種人體血清的處理方法。
背景技術：
量值溯源是近年檢驗醫(yī)學領域的熱點問題，其目的是解決臨床常規(guī)方法測量的準確可比，核心問題在于臨床常規(guī)方法的校準品應具有溯源性和與測量樣本良好的互通性。 2005年后中國已逐步建立起參考體系，校準品的溯源性問題從技術角度已基本解+決，互通性問題仍是困擾臨床常規(guī)方法測量準確可比的難題。由于人血清樣本的高度復雜性和不穩(wěn)定性，尋找并建立與人血清具有很好互通性并符合穩(wěn)定性要求的校準品是解決臨床酶學項目量值溯源的核心問題。互通性是指制備物與待測量樣本在相同分析系統(tǒng)中進行測量時表現出的與待測量樣本在分析系統(tǒng)中的反應一致的特性。在檢驗醫(yī)學定量分析領域，待測量樣本為人血清， 由于其成分的高度復雜性、儲存的不穩(wěn)定性、來源的局限性等多種原因導致在醫(yī)學實驗室使用人血清基質樣本為校準品進行人血清樣本測量的理想測量狀況無法實現，產品制造業(yè)不得不采用與人血清具有某些相似特性的易獲取的牛血清白蛋白溶液作校準品的基質或直接對一些分子結構簡單的無機小分子采用水溶液作校準品的基質。但對于一些生物大分子類物質尤其是具有空間結構的蛋白質如酶的測量采用上述基質校準品時，常導致校準品中酶與待測量樣本人血清中同種酶在同一分析系統(tǒng)中表現出不一致的特性，即校準品的基質效應。這是目前醫(yī)學實驗室酶學定量測量中導致實驗室間測量變異大，缺乏準確可比性的重要原因；也是北京市政府提出檢驗結果統(tǒng)一、互認的最大技術障礙之一。酶是人體內最重要的蛋白質之一，其具有復雜的空間結構，它的催化活性通過其分子結構中的催化活性中心暴露并與其催化底物結合實現催化人體內各種復雜代謝反應的作用。由于酶本質是蛋白質，多種因素如溫度、PH、離子濃度、滲透壓等變化均可致其變性，導致酶催化活性的改變或消失，實驗室通過對酶催化活性的測量可監(jiān)測酶的變性與失活。因此，校準品中酶的穩(wěn)定性對酶的準確測量至關重要。由于酶本身易變性和實驗室的酶測量絕大多數是基于催化活性測量的特性，校準品的基質即酶的載體對酶活性的穩(wěn)定作用明顯。既往的研究有二類一類是基于牛血清白蛋白基質的血清酶校準品和標準物質。此類校準品特點是校準品(酶活性)穩(wěn)定期長，但通常有明顯的基質效應，常導致不同分析系統(tǒng)測量結果變異大、缺乏可比性，以此類校準品校準的各常規(guī)方法測量結果多不具有溯源性，即與國際公認的參考方法的測量結果不一致；另一類是基于人血清的校準品，此類校準品的最大問題是不穩(wěn)定。目前，國內外均還沒有關于立足于采用與測量樣本基質相同的人血清有效地解決互通性問題的人血清中酶活性穩(wěn)定的研究成果。

發(fā)明內容
通過研究發(fā)現人血清中含有多種蛋白質、代謝物、離子和微量元素等物質，這些物質在離體后仍會發(fā)生不斷變化，變化程度與處理過程、保存條件密切相關。某些因素的變化不導致酶活性的改變，但某些因素的微小變化都有可能導致酶活性的明顯改變或完全喪失。因此在人血清處理與保存過程中，對可能引起人血清中酶活性變化的關鍵因素進行控制是解決酶活性穩(wěn)定的核心。本發(fā)明的目的在于提供一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，立足于采用與測量樣本基質相同的人血清來有效地解決互通性問題。為實現上述目的，本發(fā)明的及技術方案為，一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法， 包括以下步驟步驟一，血清收集收集血液采集當日新鮮人血清，放置在密閉容器中，凍至-20— 一-80°C以下，在冰柜中保存；步驟二，不穩(wěn)定成分去除 (1)將裝有人血清的容器從冰柜取出，在室溫下自然放置4-8小時，至肉眼觀察容器中塊狀冰凍血清完全溶解后，在-20--80°C以下冷凍2小時以上；(2)將裝有人血清的容器在2-10°C下放置10小時以上，至肉眼觀察容器中塊狀冰凍血清完全溶解后，再在-20--80°C以下冷凍2小時以上；(3)用10——20°C水沖洗裝有人血清容器的外表面，沖至肉眼觀察容器中塊狀冰凍血清完全溶解。使人血清中引起酶活性不穩(wěn)定的各種蛋白質、凝血因子、離子、代謝物等物質由易變狀態(tài)轉化為處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)；由于人血清成分相當復雜，不僅含有K、Na等多種穩(wěn)定的電解質，也含有葡萄糖、 尿素等小分子代謝物，同時還含有大量蛋白質、蛋白質屬性的各種代謝中間產物、各型維生素、甾體化合物等，通常認為蛋白質及具有蛋白質屬性的各種代謝中間產物是引起人血清不穩(wěn)定的重要因素。經冷凍、快速溶解、自然溶解和緩慢溶解四個物理過程，血清中絕大多數蛋白質及具有蛋白質屬性的各種代謝中間產物空間結構發(fā)生變化，在采用以保護酶活性為主要目的的多種復溶方式復溶后后，人血清中酶活性的穩(wěn)定性明顯提高。既往采用單一凍融方式時仍表現為部分酶活性的不穩(wěn)定，實質是致酶易變因素去除不完全。步驟三、纖維蛋白等雜質去除，采用濾紙濾除血清中的纖維蛋白絲、各種抗原抗體復合物和蛋白復合顆粒等雜質。步驟四、無菌處理，經步驟三處理過的人血清在常規(guī)無菌條件下使用微孔濾膜進行無菌過濾。步驟五、分裝保存，包括以下步驟；(1)選用可密閉、防凍、不易破損的血清存儲容器分裝血清樣本。(2)對血清存儲容器進行無菌處理。(3)在無菌狀態(tài)下檢查各血清存儲容器是否密閉。(4)無菌處理后的血清樣本在無菌條件下采用各種移液裝置如吸管、移液器、連續(xù)或不連續(xù)樣品分配器、自動化分配裝置或儀器等進行分裝，分裝過程應控制在3小時以內 (實施例)。(5)密閉各血清存儲容器并確認。(6)標記。(7)存儲于-80°C以下冰柜儲存。步驟六、無菌狀態(tài)檢查，分別取分裝過程的開始、中間、最后三支人血清樣品進行血液培養(yǎng)，驗證人血清是否 處于無菌狀態(tài)；如果三支人血清樣品均為無菌狀態(tài)，則表明血清制備無菌過程合格，操作步驟結束；如果一個或多個人血清樣品未處于無菌狀態(tài)，則重復操作步驟四、步驟五和步驟六，直至血清制備無菌過程合格為止。進一步，如上所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其中，步驟一中新鮮人血清冷凍保存溫度范圍為-20 -80°C。進一步，如上所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其中，步驟二中第(2) 步血清的放置溫度為2-10°C。進一步，如上所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其中，步驟三中使用的濾紙為低——高速# 15-30cm定性濾紙。進一步，如上所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其中，步驟四中使用的微孔濾膜為# 50-2000mm、孔徑0. 20-0. SOum的微孔濾膜無菌過濾。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明立足于采用與測量樣本基質相同的人血清來有效解決互通性問題，將收集的人血清通過一系列技術處理，使人血清中酶活性在一定時期內穩(wěn)定， 以滿足臨床使用需求，采用上述方案制備的人血清中酶活性至少能夠穩(wěn)定一年以上。
具體實施例方式實施例步驟一、收集實驗當日的新鮮人血清放置到封閉的凍融管中，將其凍至-60°C以下，至收集至約1000ml。步驟二、將血清從冰柜取出，在室溫下自然放置4個小時，至肉眼觀察完全溶解， 在-60°C以下冷凍2小時以上；再將血清在4°C下放置10小時，至肉眼觀察完全溶解，然后在-60°C以下冷凍2小時；再用10°C的水沖洗裝血清的凍融管，沖至肉眼觀察完全溶解。步驟三、采用低——高速# 15-30cm定性濾紙濾除血清中的纖維蛋白絲、各種抗原抗體復合物和蛋白復合顆粒等雜質。步驟四、初濾后的人血清在常規(guī)無菌條件下進行無菌過濾，使用# 50-2000mm、孔徑0. 20-0. SOum的微孔濾膜，濾菌使用天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產的autoscience
濾圉器。步驟五、在無菌狀態(tài)下檢查1. Oml的凍溶管的密閉性，對能夠密閉的容量為1. Oml 的凍溶管采用紫外線照射30分鐘方法消毒，進行無菌處理，然后用液體分配器進行血清分裝、標記，并存儲于-80°C以下的冰柜中。步驟六、無菌狀態(tài)檢查取分裝過程開始、中間、最后三支樣品進行血液培養(yǎng)，經驗證，人血清皆處于無菌狀態(tài)，無菌狀態(tài)檢查采用現有技術進行。試驗例針對上述實施例中制備的人血清樣品，進行Y-谷氨酰基轉移酶(GGT)、肌酸激酶 (CK)和淀粉酶(AMY)的穩(wěn)定性試驗，試驗中的穩(wěn)定性評價方法、測量參數、數據有效性判斷標準均為現有技術。試驗結果和結論如下
權利要求
1.一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，包括以下步驟步驟一，血清收集收集血液采集當日新鮮人血清，放置在密閉容器中，凍至-20—— -80°C以下，在冰柜中保存；步驟二，不穩(wěn)定成分去除(1)將裝有人血清的容器從冰柜取出，在室溫下自然放置4-8小時，至肉眼觀察容器中塊狀冰凍血清完全溶解后，在-20--80°C以下冷凍2小時以上；(2)將裝有人血清的容器在2-10°C下放置10小時以上，至肉眼觀察容器中塊狀冰凍血清完全溶解后，再在-20--80°C以下冷凍2小時以上；(3)用10——20°C水沖洗裝有人血清容器的外表面，沖至肉眼觀察容器中塊狀冰凍血清完全溶解，使人血清中引起酶活性不穩(wěn)定的各種蛋白質、凝血因子、離子、代謝物等物質由易變狀態(tài)轉化為處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)；步驟三、纖維蛋白等雜質去除，采用濾紙濾除血清中的纖維蛋白絲、各種抗原抗體復合物和蛋白復合顆粒等雜質。步驟四、無菌處理，經步驟三處理過的人血清在常規(guī)無菌條件下使用微孔濾膜進行無菌過濾。步驟五、分裝保存，包括以下步驟；(1)選用可密閉、防凍、不易破損的血清存儲容器分裝血清樣本。(2)對血清存儲容器進行無菌處理。 (3)在無菌狀態(tài)下檢查各血清存儲容器是否密閉。(4)無菌處理后的血清樣本在無菌條件下采用移液裝置進行分裝，分裝過程應控制在 3小時以內(實施例)。(5)密閉各血清存儲容器并確認。(6)標記。(7)存儲于-80°C以下冰柜儲存。步驟六、無菌狀態(tài)檢查，分別取分裝過程的開始、中間、最后三支人血清樣品進行血液培養(yǎng)，驗證人血清是否處于無菌狀態(tài)；如果三支人血清樣品均為無菌狀態(tài)，則表明血清制備無菌過程合格，操作步驟結束；如果一個或多個人血清樣品未處于無菌狀態(tài)，則重復操作步驟四、步驟五和步驟六，直至血清制備無菌過程合格為止。
2.如權利要求1所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其特征在于步驟一中新鮮人血清冷凍保存溫度范圍為-20 -80°C。
3.如權利要求1所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其特征在于步驟二第 (2)步中人血清的放置溫度為2-10°C。
4.如權利要求1所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其特征在于步驟三中使用的濾紙為低——高速# 15-30cm定性濾紙。
5.如權利要求1所述的一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，其特征在于步驟四中使用的微孔濾膜為# 50-2000mm、孔徑0. 20-0. SOum的微孔濾膜無菌過濾。
全文摘要
一種人血清中酶活性穩(wěn)定的處理方法，包括以下步驟步驟一，血清收集；步驟二，不穩(wěn)定成分去除；步驟三、纖維蛋白等雜質去除；步驟四、無菌處理；步驟五、分裝保存；步驟六、無菌狀態(tài)檢查。本發(fā)明立足于采用與測量樣本基質相同的人血清來有效解決互通性問題，將收集的人血清通過一系列技術處理，使人血清中酶活性在一定時期內穩(wěn)定，以滿足臨床使用需求，采用上述方案制備的人血清中酶活性至少能夠穩(wěn)定一年以上。
文檔編號G01N1/34GK102221490SQ20101014882
公開日2011年10月19日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權日2010年4月16日
發(fā)明者孫慧穎, 李月玲, 李玲, 胡濱, 邵燕, 陳寶榮, 陳琦 申請人:北京航天總醫(yī)院