專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低溫α-半乳糖苷酶AgaAGN14及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種低溫α -半乳糖苷酶AgaAGNH及其基因。
背景技術(shù)：
α -半乳糖苷酶(α -galactosidase, EC 3. 2. 1. 22)又叫密二糖酶(Melibiase)， 是一種外切糖苷酶類(lèi)，能特異性水解密二糖、棉籽糖、水蘇糖和毛蕊花糖等低聚糖底物及半乳甘露聚糖等多聚糖底物中的α-半乳糖苷鍵。這些低聚糖和多聚糖廣泛存在于食品和飼料原料中，尤以豆科類(lèi)植物種子含量最高(Karr-Lilienthal et al.，Livest Prod Sci, 2005，97: 1 - 12.)。α-半乳糖苷酶可應(yīng)用于飼料、食品和醫(yī)療等行業(yè)中。在飼料行業(yè)中，α-半乳糖苷酶制劑作為一種促生長(zhǎng)類(lèi)酶制劑，可以去除或減少α-半乳糖苷寡糖類(lèi)抗?fàn)I養(yǎng)因子(棉籽糖等低聚糖)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化的副作用，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化，提高飼料利用率； 在食品行業(yè)中，α -半乳糖苷酶制劑可以減少棉籽糖等在豆奶中的含量，增加人類(lèi)對(duì)豆類(lèi)營(yíng)養(yǎng)的吸收；在醫(yī)療行業(yè)中，α -半乳糖苷酶可將B型紅細(xì)胞改造成0型紅細(xì)胞及治療Fabry 疾病(Yoshimitsu et al. , Mol Biol Rep, 2011，38: 3145 - 3152.)等。具有低溫活性的酶制劑可應(yīng)用于低溫生境和低溫加工過(guò)程。水產(chǎn)動(dòng)物終生或大部分時(shí)間生活于水中，體溫隨水溫或氣溫變化而變化，一般在10-20°C (Zhou et al. , Appl Microbiol Biotechnol, 2009，85: 323 - 333.)。因此，水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用酶需要在此低溫(10 - 20°C)環(huán)境下具有催化活性。另一方面，大多水產(chǎn)動(dòng)物消化道環(huán)境呈中性(如鯉科魚(yú)類(lèi))或偏堿性，水產(chǎn)飼料中添加的外源酶還需在中性或偏堿性等條件下具有催化活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種低溫α -半乳糖苷酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述α -半乳糖苷酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明所述α -半乳糖苷酶AgaAGNH可得自節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)。 AgaAGNH的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明的α -半乳糖苷酶AgaAGNH總共含702個(gè)氨基酸，理論分子量為77. 5kDa。 該酶的最適PH值為6. 5，在pH6. 0-9.0的范圍內(nèi)維持50%以上的酶活性；經(jīng)pH5. 0 - 10. 0 的緩沖液處理lh，該酶酶活剩余達(dá)80%以上；該酶最適溫度為45°C，在10°C和20°C分別具有28%和30%以上的酶活；在pH 6. 5及37°C下，該酶對(duì)0. 5% (w/v)棉籽糖的比活為 0.69士0.01 U mg_1，對(duì)1%的密二糖、菜粕和棉籽粕的比活分別為34. 45士2. 15，2.94士0. 27 和 2. 65士0. 22 U mg_1。本發(fā)明提供了編碼上述α-半乳糖苷酶的基因么該基因序列如SEQ IDNO. 2所示。本發(fā)明通過(guò)PCR的方法分離克隆了 α-半乳糖苷酶AgaAGNH的編碼基因 agaAGNM,其全長(zhǎng)2109bp，起始密碼為ATG，終止密碼為T(mén)GA。經(jīng)BLAST比對(duì)，該α -半乳糖苷酶基因 agaAGNM 編碼的氨基酸序列與 GenBank 中 Arthrobacter phenan threnivorans Sphe3來(lái)源的潛在α -半乳糖苷酶(ADX74417)具有最高的一致性，為53. 7% ；與確證活性的 Streptomyces sp. S27來(lái)源α -半乳糖苷酶(ADK91095)的一致性為50. 0%。說(shuō)明α -半乳糖苷酶AgaAGNH是一種新的α-半乳糖苷酶。本發(fā)明還提供了包含上述α-半乳糖苷酶基因^^^^^^的重組載體，優(yōu)選為 m~agaAGN140將本發(fā)明的α -半乳糖苷酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，將本發(fā)明的α-半乳糖苷酶基因插入到質(zhì)粒ρΕΤ48ει ( + )上的歷ii/III和損ol限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-a^^GW么本發(fā)明還提供了包含上述α -半乳糖苷酶基因^^^^^^的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株見(jiàn)力必萬(wàn)力本發(fā)明制備α -半乳糖苷酶AgaAGNH的方法按以下步驟進(jìn)行
1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組α-半乳糖苷酶表達(dá)；
3)回收并純化所表達(dá)的α-半乳糖苷酶AgaAGN14。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3 )，得到重組菌株BL21 (DE3) /agaAGNM.本發(fā)明提供了一個(gè)新的α-半乳糖苷酶基因，其編碼的α-半乳糖苷酶最適 ρΗ6. 5 ；在10°C和20°C下分別具有28%和30%以上的酶活；經(jīng)0. IM pH5. O - 10. O緩沖液在 25°C下處理lh，仍能保持 85%的活性；較好的水解各種自然底物的能力；可作為一種飼料或食品添加劑應(yīng)用于飼料與食品行業(yè)。


圖1 在大腸桿菌中表達(dá)的重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的SDS-PAGE分析，其中， M 低分子量蛋白質(zhì)Marker ；1 純化的重組α -半乳糖苷酶AgaAGN14。圖 2圖 3圖 4圖 5
重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的最適ρΗ。 重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的ρΗ穩(wěn)定性。 重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的最適溫度。 重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑
1、菌株及載體節(jié)桿菌MriAro如cter sp.)來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心 CGMCC 1. 1525 ；大腸桿菌fecAericAia coli BL21 (DE3)和表達(dá)載體 pET48a ( + )購(gòu)于 Novagen 公司。2、酶類(lèi)及其它生化試劑限制性?xún)?nèi)切酶、DNA聚合酶、連接酶和dNTP購(gòu)自TaKaRa公司；/ NPG (/？-nitrophenyl-a-d-galactopyranoside)和密二糖購(gòu)自 Sigma 公司；其它都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買(mǎi)得到)。3、培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基=Peptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g，加蒸餾水至 1000ml，pH 自然 (約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2. 0% (w/v)瓊脂。說(shuō)明以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書(shū)中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)施例1 α -半乳糖苷酶基因agaAGNM的克隆
提取節(jié)桿菌基因組DNA 將液體培養(yǎng)2d的菌液離心取菌體，加入ImL溶菌酶，37°C處理 60min,再加入裂解液，70°C水浴裂解60min，每隔IOmin混勻一次，在4°C下IOOOOrpm離心 5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min 后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量 TE溶解，置于_20°C備用。表1. α-半乳糖苷酶基因agaAGNM的克隆與表達(dá)引物
引物名稱(chēng)引物序列(5’ 一-3’ )引物長(zhǎng)度(bp)GH36FTGTTCRTCCTNGAYGAYKGNTGG23GH36RGGGYTTAYSATYTCNGGYTCCC22usplAGGCCGAATTCCATGCCCA19usp2ACGTGGCTGATCAGCGGATCAA22dsplGGGGCTTGATCCGCTGATCA20dsp2GGGCATGGAATTCGGCCTTTG21dsp3AATTGGTGGGCCAGCACATCG21dsp4GCTCTTTGGGCACTTCGGGATG22agaAGNM CCCAAGCTTGCATGAGCAGCGTMTACTCGAMG34agaAGNM^CCGCTCGAGTGCACCCTCCGTTCGGCGGGCA31
根據(jù)糖苷水解酶第36家族的保守序列([F/L/V] - [L/V] - [L/M/V] -D-D-G-W-F和 E-P-E-M-[V/I]-[N/S]-[P/E])設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并引物GH36F和GH36R (表1)。以節(jié)桿菌總 DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C變性5min ；然后94°C變性30sec，43°C退火30seC，72°C延伸30seC，30個(gè)循環(huán)后72°C保溫lOmin。PCR結(jié)果得到一約172bp片段，將該片段回收后與PMD 18-T載體相連，然后送北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的核甘酸序列，設(shè)計(jì)熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR (簡(jiǎn)稱(chēng)TAIL-PCR)上游特異性引物2條，并將它們分別命名為uspl和usp2 ；另設(shè)計(jì)下游特異性引物4條，并將它們分別命名為dspl、dsp2、dsp3、dsp4 (表1)。特異性引物設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向， sp2的位置設(shè)計(jì)在spl的內(nèi)側(cè)，sp4的位置設(shè)計(jì)在sp3的內(nèi)側(cè)。每?jī)蓚€(gè)引物之間的距離沒(méi)有嚴(yán)格規(guī)定，引物長(zhǎng)度為19-22壯，引物退火溫度在60 - 701。通過(guò)TAIL-PCR得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴(kuò)增產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司廣州分公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與已知基因序列片段相拼接，得到α-半乳糖苷酶基因^識(shí)^？擬么該基因序列如SEQ ID Ν0. 2 所示。實(shí)施例2 重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的制備
以agaAGNMY和agaAGNl救為引物對(duì)(表1)，節(jié)桿菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C變性5min ；然后94°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸^iiin 30sec, 30個(gè)循環(huán)后72°C保溫lOmin。PCR結(jié)果得到α -半乳糖苷酶的基因agaAGNM,并在該基因5’和3’端分別引入了/Ζ /ΙΙΙ和損0I酶切位點(diǎn)。將編碼α-半乳糖苷酶的基因 agaAGN14進(jìn)行雙酶切(Mindm和損ol )，同時(shí)將表達(dá)載體pET18a ( + )進(jìn)行雙酶切(Mindm 和損ol)。將上述酶切的α-半乳糖苷酶與表達(dá)載體pET18a( + )相連接，獲得含有α-半乳糖苷酶基因^識(shí)^；擬^的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)， 獲得重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3) /agaAGNM.取含有重組質(zhì)粒的五 co/i BL21 (DE3)菌株和只含有pET_28a (+ )空質(zhì)粒的五coli BL21 (DE3)菌株，以0. 1%的接種量接種于LB (含5(^g/mL Kan)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩16h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB (含50μβ/ mL Kan)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2 - 3h (OD600達(dá)到0.6-1. 0)后，加入終濃度0. 7mM的 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，于20°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h或振蕩培養(yǎng)約他。12000rpm離心5min， 收集菌體。用適量的PH7.0 Tris-HCl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。 以上胞內(nèi)濃縮的初酶液經(jīng)13，OOOrpm離心IOmin后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果(圖1)表明，重組α-半乳糖苷酶在大腸桿菌中得到了表達(dá)，經(jīng) Nickel-NTA Agarose純化后為單一條帶。實(shí)施例3 純化的重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的性質(zhì)測(cè)定
1、重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的活性分析
實(shí)施例2純化的重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的活性測(cè)定方法采用/ NPG法將^NPG 溶于0. IM緩沖液中，使其終濃度為2mM ；反應(yīng)體系含100 μ L適量酶液，900 μ L的2mM底物； 底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后，加入酶液再反應(yīng)lOmin，然后加1.5mL IM Na2CO3終止反應(yīng)， 冷卻至室溫后在405nm波長(zhǎng)下測(cè)定釋放出的/7NP ； 1個(gè)酶活單位(U)定義為每分鐘分解^NPG 產(chǎn)生1 μ mol/7NP所需的酶量。對(duì)底物棉籽糖、棉籽粕和菜粕的活性測(cè)定方法采用DNS法將底物溶于0. IM緩沖液中，使其終濃度為0. 5%或1. 0%(w/v);反應(yīng)體系含100 μ L適量酶液， 900yL底物；底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后，加入酶液后再反應(yīng)120min，然后加1.5mL DNS 終止反應(yīng)，沸水煮5min，冷卻至室溫后在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值；1個(gè)酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生1 μ mol半乳糖所需的酶量。對(duì)底物密二糖的活性測(cè)定方法采用葡萄糖氧化酶法將底物溶于0. IM緩沖液中，使其終濃度為0. 5% (w/v)；反應(yīng)體系含100 μ L適量酶液，900 μ L底物；底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后，加入酶液后再反應(yīng) lOmin，然后根據(jù)葡萄糖氧化酶試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司CAT361590)說(shuō)明書(shū)測(cè)定酶活性；1個(gè)酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生1 μ mol葡萄糖所需的酶量。2、重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的最適ρΗ和ρΗ穩(wěn)定性測(cè)定
酶的最適PH測(cè)定將α-半乳糖苷酶AgaAGNH在37 °C下和0. IM pH5. 0-11.0的緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的PH穩(wěn)定性測(cè)定將純化的酶液置于0. IM pH4. 0-11.0的緩沖液中，在37°C下處理lh，然后在pH6. 5及37°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對(duì)照。 緩沖液為0. IM McIlvaine buffer (pH4. 0-8. 0)和 0. IM glycine-NaOH (pH9. 0 - 11. 0)。 以pNPG為底物，反應(yīng)lOmin，測(cè)定純化的AgaAGNH的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明AgaAGN14的最適ρΗ為6.5，在pH6. 0-9.0的范圍內(nèi)維持50%以上的酶活性(圖2)；經(jīng)pH5. 0 - 10. 0的緩沖液處理lh，仍能保持、5%的活性(圖3)。3、重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定
酶的最適溫度測(cè)定在ΡΗ6. 5的緩沖液中，于0 - 60°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定將同樣酶量的酶液置于37°C和50°C中，處理0 - 60min后，在pH6. 5及37°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對(duì)照。以PNPG為底物，反應(yīng)lOmin，測(cè)定純化的AgaAGNH的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明AgaAGN14的最適溫度為45°C，在10°C和20°C分別具有28%和30%以上的酶活(圖4)；在37°C下酶AgaAGNH很穩(wěn)定(圖5)。4、重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定
酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)一級(jí)反應(yīng)時(shí)間測(cè)定在ΡΗ6. 5及45°C下，以0. 5mM pNPG為底物，依次在酶促反應(yīng)的1 -30min內(nèi)終止反應(yīng)并測(cè)定酶活性，計(jì)算出酶活性與反應(yīng)時(shí)間的比值，若在一定時(shí)間內(nèi)該比值保持穩(wěn)定，則此時(shí)間為一級(jí)反應(yīng)時(shí)間。用0.1-4. OmM /7NPG為底物，在 pH6. 5、45°C和一級(jí)反應(yīng)時(shí)間下，根據(jù)Lineweaver-Burk方法測(cè)定夂、Kmax和先at。經(jīng)測(cè)定，在 450C pH6. 5 條件下，AgaAGNH 對(duì)/ NPG 的丨、廠(chǎng)max 和先at 分別為 0. 41 mM"\l8. 28Mmol min"1 mg_1 禾口 25. 36 s_1。5、不同金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)重組AgaAGNH活力的影響
在酶促反應(yīng)體系中加入IOmM的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對(duì)酶活性的影響。在 37°C、pH6. 5條件下，以/7NPG為底物測(cè)定酶活性。結(jié)果(表2)表明，IOmM的Ag+、Hg2+及SDS 可完全或幾乎完全抑制 AgaAGNH ；K+、Ca2+、Mn2+、Fe3\ Ni2+、Cu2+ 和 β -mercaptoethanol 對(duì) AgaAGNH具一定的抑制作用，剩余酶活飛0% ；其余金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)AgaAGNH的影響較小。表2.金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)重組α-半乳糖苷酶AgaAGNH活力的影響
試劑相對(duì)酶活(%)CK100. 0±3. 9Co2+94. 7±2. 8Pb2+87. 2±8. 7Zn2+76. 5±1. 7Mg2+74. 3±0. 9Na+68. 1±3. 4K+58. 7±0. 8n 2+ La57. 7±1. 5Mn2+57. 5±5. 9Fe3+56. 8±4. 1Ni2+55. 0±2. 2Cu2+52. 2±4. 2Ag+0Hg2+0EDTA83. 0±4. 1β—mercaptoethanol58. 7±1. 6SDS0. 4±0. 2
6、重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH對(duì)底物的降解
在ρΗ 6. 5及37°C下，重組α -半乳糖苷酶AgaAGNH對(duì)0. 5% (w/v)棉籽糖的比活為 0.69士0.01 U mg_1，對(duì)1%的密二糖、菜粕和棉籽粕的比活分別為34. 45士2. 15，2.94士0. 27 和 2. 65士0. 22 U mg_1。
權(quán)利要求
1.一種α-半乳糖苷酶AgaAGN14，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的α-半乳糖苷酶AgaAGNH的α-半乳糖苷酶基因么其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種包含權(quán)利要求2所述α -半乳糖苷酶基因agaA(m4的重組載體。
4.一種包含權(quán)利要求2所述α -半乳糖苷酶基因agaAGNM的重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種α-半乳糖苷酶AgaAGN14及其基因。本發(fā)明提供了一種來(lái)源于節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)的α-半乳糖苷酶AgaAGN14，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，且本發(fā)明提供了上述α-半乳糖苷酶的編碼基因agaAGN14，α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的重組載體和α-半乳糖苷酶基因agaAGN14的重組菌株。本發(fā)明的α-半乳糖苷酶具有以下性質(zhì)最適pH6.5；最適溫度45℃，在10℃和20℃下分別具有28%和30%以上的酶活；經(jīng)0.1MpH5.0–10.0緩沖液在25℃下處理1h，仍能保持~85%的活性；較好的水解各種自然底物的能力；可作為一種飼料或食品添加劑應(yīng)用于飼料與食品行業(yè)。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102321599SQ20111032625
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者周峻沛, 唐湘華, 李俊俊, 潘璐, 許波, 高雅潔, 黃遵錫 申請(qǐng)人:云南師范大學(xué)