專(zhuān)利名稱(chēng)：黑楊中具有抗蟲(chóng)效果的胰蛋白酶抑制劑基因及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種黑楊基因及用途。
背景技術(shù)：
林木植物是大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)中的主要生命形式，在所有陸地生態(tài)系統(tǒng)中具有最大的生物量和生物生產(chǎn)力，因此具有重要的經(jīng)濟(jì)及生態(tài)價(jià)值。目前僅我國(guó)每年由于森林病蟲(chóng)害導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失已達(dá)千億元，而通過(guò)化學(xué)殺蟲(chóng)劑控制森林病蟲(chóng)害不僅生產(chǎn)成本高， 且造成生態(tài)環(huán)境的惡化，同時(shí)對(duì)人畜也產(chǎn)生嚴(yán)重危害，利用基因工程培育抗病蟲(chóng)植物成為植物病蟲(chóng)害防治的重要手段。在利用基因工程提高森林物種抗病蟲(chóng)害能力的工作中，尋找安全、有效的目的基因以供轉(zhuǎn)化是工作的基礎(chǔ)。林木植物由于生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，總是面臨周?chē)h(huán)境中各種病蟲(chóng)害的侵犯，因此在長(zhǎng)期的演化過(guò)程中，他們自身已獲得了適度、有效的生物抗性機(jī)制，能夠最大限度地避免逆境的危害。通過(guò)深入挖掘并研究林木植物這種自身的病蟲(chóng)害防御機(jī)制，并在生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)行應(yīng)用，是當(dāng)前利用基因工程方法進(jìn)行林木植物病蟲(chóng)害防治研究中的首要任務(wù)。廣泛存在于植物組織中的蛋白酶抑制劑(protease inhibitor,PI)是一種多肽物質(zhì)，具有抑制病原微生物及某些昆蟲(chóng)體內(nèi)蛋白消化酶的活性，是植物自然防御體系的重要組成部分。由于來(lái)源于林木的植物蛋白酶抑制劑研究開(kāi)展較晚，木本植物中的植物蛋白酶抑制劑迄今為止僅在蘋(píng)果等薔薇科植物和楊柳科植物的歐洲白楊中發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黑楊中具有抗蟲(chóng)效果的胰蛋白酶抑制劑基因。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種黑楊中具有抗蟲(chóng)效果的胰蛋白酶抑制劑基因的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下黑楊中具有抗蟲(chóng)效果的胰蛋白酶抑制劑基因，其特征是用序列表SEQ ID NO. 1或 SEQ IDN0. 2 所示。黑楊中具有抗蟲(chóng)效果的胰蛋白酶抑制劑基因在防治植物蟲(chóng)害的應(yīng)用。本發(fā)明分離到黑楊Kimitz型胰蛋白酶抑制劑基因(PnKTIs)，它們對(duì)機(jī)械損傷以及蟲(chóng)咬兩種外界誘導(dǎo)刺激均具有高誘導(dǎo)特性，實(shí)驗(yàn)證明具有抗蟲(chóng)效果，顯著降低了鱗翅目昆蟲(chóng)的成活率。該發(fā)明能夠?yàn)閺氖驴瓜x(chóng)轉(zhuǎn)基因工程及生防相關(guān)研究人員提供新型抗蟲(chóng)基因，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展新的抗蟲(chóng)手段，降低農(nóng)藥使用及其對(duì)環(huán)境的惡性污染，維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡和可持續(xù)性發(fā)展。


圖1為黑楊蟲(chóng)咬后的KTI基因的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例11.從楊屬模式植物黑楊中分離出胰蛋白酶抑制劑基因。1. 1通過(guò)BLAST搜索基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的KTI基因，進(jìn)行多重序列比對(duì)。1.2設(shè)計(jì)基因特異性引物，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從黑楊中分離Kimitz型胰蛋白酶抑制劑基因家族中各成員基因。2.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和半定量法分析上述Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因的應(yīng)答特性。3.挑選具有高誘導(dǎo)性的Kimitz型胰蛋白酶抑制劑基因，克隆其全長(zhǎng)編碼序列 PnKTI A6 DNA 序列(SEQ ID NO. 1 所示)和 PnKTI D2 DNA 序列(SEQ ID NO. 2 所示)用黑楊蟲(chóng)咬以后M小時(shí)，收集葉子，進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)的結(jié)果，使用18S rRNA基因作為參考，計(jì)算轉(zhuǎn)入基因的相對(duì)表達(dá)量。其中對(duì)照組的表達(dá)水平按照1計(jì)算。見(jiàn)圖1。實(shí)施例2PnKTI A6 DNA 序列(SEQ ID NO. 1 所示)和 PnKTI D2 DNA 序列(SEQ ID NO. 2 所示)在人工機(jī)械損傷和春尺蠖蟲(chóng)咬誘導(dǎo)下的應(yīng)答特性。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)楊樹(shù)蛋白酶抑制劑基因可增強(qiáng)對(duì)小菜蛾的抗性1.用分離出的SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所示的已知序列，設(shè)計(jì)引物上游引物5，-ATGAAGATCACTAAAT-3，(SEQ ID N0. 3 所示)；下游引物5，-AATGGTGTCAGAATGA-3，(SEQ ID N0. 4 所示)；擴(kuò)增后片段經(jīng)酶切連入pCGN1548雙元載體后電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58供擬南芥轉(zhuǎn)化。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥將農(nóng)桿菌接種于IOml的YEB培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)過(guò)夜，之后按照1 50的比例轉(zhuǎn)接入200ml YEP培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至OD為0. 7時(shí)(也可以是0. 6或0. 8)，5000rpm 離心5分鐘，收集菌體。菌體懸于蔗糖溶液調(diào)OD值至0.8。將開(kāi)花的擬南芥倒置于裝有轉(zhuǎn)化液的容器中，使整個(gè)花序浸泡在菌液中15秒，取出擬南芥橫躺在托盤(pán)中，用塑料薄膜保濕，并暗處理Mh，然后在合適光照條件下使其距常生長(zhǎng)，直到種子成熟。3.擬南芥檢測(cè)與篩選將表面進(jìn)行過(guò)消毒的擬南芥種子均勻播種于含有50 μ g/ml卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，在合適的光照強(qiáng)度下生長(zhǎng)一周，篩選葉子為深綠色的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。待轉(zhuǎn)化植株長(zhǎng)到3-4片真葉時(shí)，移植到土壤中，收集種子為T(mén)l代轉(zhuǎn)化種子。從葉片中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，用實(shí)時(shí)定量方法分析獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株的目的基因表達(dá)量。選擇表達(dá)量高的Tl 植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，收集T3代種子，并篩選出純合體供抗性實(shí)驗(yàn)使用。4.抗蟲(chóng)性測(cè)定每種轉(zhuǎn)基因擬南芥選擇三個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行抗性試驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組飼養(yǎng)50只小菜蛾，每天加入相同重量的新葉，統(tǒng)計(jì)剩余舊葉，并且更換培養(yǎng)皿。一周后統(tǒng)計(jì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)小菜蛾的平均重量、死亡率、結(jié)繭率和化蛾率?？瓜x(chóng)性測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.黑楊中具有抗蟲(chóng)效果的胰蛋白酶抑制劑基因，其特征是用序列表SEQID NO. 1或SEQ IDN0. 2 所示。
2.權(quán)利要求1所述基因在防治植物蟲(chóng)害的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了黑楊中具有抗蟲(chóng)效果的胰蛋白酶抑制劑基因及用途，黑楊中具有抗蟲(chóng)效果的胰蛋白酶抑制劑基因，用序列表SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；本發(fā)明分離到黑楊Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因(PnKTIs)，它們對(duì)機(jī)械損傷以及蟲(chóng)咬兩種外界誘導(dǎo)刺激均具有高誘導(dǎo)特性，實(shí)驗(yàn)證明具有抗蟲(chóng)效果，顯著降低了鱗翅目昆蟲(chóng)的成活率。該發(fā)明能夠?yàn)閺氖驴瓜x(chóng)轉(zhuǎn)基因工程及生防相關(guān)研究人員提供新型抗蟲(chóng)基因，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展新的抗蟲(chóng)手段，降低農(nóng)藥使用及其對(duì)環(huán)境的惡性污染，維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡和可持續(xù)性發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N15/15GK102392027SQ201110326290
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者宋英今, 楊少輝, 王潔華, 陳姍 申請(qǐng)人:天津大學(xué)