專利名稱：人卵巢癌細(xì)胞系uacc-1598中雙微體序列測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，屬于雙微體序列測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雙微體(double minute chromosomes，DMs)是腫瘤細(xì)胞內(nèi)成對存在、不含著絲粒、 可自主復(fù)制的環(huán)狀染色小體，是腫瘤細(xì)胞基因擴(kuò)增的主要表現(xiàn)形式之一。雙微體存在于腫瘤細(xì)胞和某些經(jīng)過化療藥物作用的細(xì)胞，在正常細(xì)胞中未見雙微體檢出。雙微體自1962年首次在人結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)以來，在絕大多數(shù)實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤中皆檢測到雙微體的存在。臨床標(biāo)本檢測結(jié)果顯示，18%的乳腺癌、的卵巢癌、44%的結(jié)腸癌、20% -30%的小細(xì)胞肺癌和12. 5%的血液系統(tǒng)腫瘤中存在著雙微體。同吋，雙微體的存在與腫瘤的惡性程度的增高和腫瘤耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)。研究顯示，通過雙微體擴(kuò)增的基因主要包括為細(xì)胞提供生存優(yōu)勢的癌基因和耐藥表型的耐藥基因。這些基因有的是ー個(gè)完整的基因，而另外ー些則是由兩個(gè)不同基因形成的融合基因。這些基因在腫瘤演進(jìn)和耐藥性形成過程中發(fā)揮重要作用，因此對雙微體上這些基因的確認(rèn)也就顯的格外重要?，F(xiàn)有研究雙微體的結(jié)構(gòu)主要采用細(xì)胞遺傳學(xué)手段，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、 原子力顯微鏡和熒光原位雜交(FISH)等對雙微體結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測。這些方法都是從宏觀上也就是染色體水平對雙微體進(jìn)行描述，不能提供雙微體的微觀信息(即DNA的序列特點(diǎn))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有研究雙微體的結(jié)構(gòu)主要采用細(xì)胞遺傳學(xué)手段，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡、原子力顯微鏡和熒光原位雜交等對雙微體結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測。這些方法都是從宏觀上也就是染色體水平對雙微體進(jìn)行描述，不能提供雙微體的微觀信息的問題，進(jìn)而提供ー種人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法。本發(fā)明ー種人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法步驟如下一、人卵巣癌細(xì)胞UACC-1598的培養(yǎng)及細(xì)胞完整雙微體的脈沖場凝膠電泳分離；1、樣品制備人卵巢癌細(xì)胞UACC-1598在含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于5% CO2,37°C 條件下進(jìn)行培養(yǎng)；收集對數(shù)生長期、匯合率為70% 80%的人卵巣癌細(xì)胞UACC-1598，計(jì)數(shù)后重懸于PBS，使細(xì)胞密度為1 2 X IO8細(xì)胞/mL，并在37°C水浴中孵育；加入等體積37°C 的1. 4%低熔點(diǎn)瓊脂糖，迅速混勻后倒入潔凈模具中，4°C放置10 15min使其凝固；將膠塊從模具中取出后置于3 5倍體積的細(xì)胞裂解液中于37°C水浴中震蕩孵育約90min至膠塊透明；棄細(xì)胞裂解液并用洗液(Washing buffer)反復(fù)洗膠塊3次后置于3 5倍體積的蛋白酶K溶液，37°C水浴中震蕩孵育6 12小時(shí)；Washing buffer洗滌三次后，置于貯存液中4°C保存；2、脈沖場凝膠電泳
將制備好的膠塊置于0. 5%瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔；在10°c的0. 5X TBE電泳緩沖液中適宜電泳條件下先進(jìn)行第一向FIGE模式電泳，電泳條件為正向電壓梯度(Forward Voltage Gradient) :3 5V/cm，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間(Int. Sw. Time) :50 70seconds，終止轉(zhuǎn)換時(shí)間(Fin. Sw. Time) :220 260seconds ；負(fù)向電壓梯度(Rev. Voltage Gradient) :2 4V/cm，負(fù)向起始轉(zhuǎn)換時(shí)間(Rev. Int. Sw. Time) :15 30seconds，負(fù)向終止轉(zhuǎn)換時(shí)間(Rev. Fin. Sw. Time) :50 70seconds ；總電泳時(shí)間(Total Run Time) :36 45hours.隨后調(diào)整方向進(jìn)行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子； 電泳條件為電壓梯度(Gradient) :3 6V/cm，脈沖角度(Included angle) :120，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間 Gnt. Sw. Tm) 100 130seconds，終止轉(zhuǎn)換時(shí)間(Fin. Sw. Tm) :270 320seconds， 電泳時(shí)間(Run time) :25 30hours.以商品化的H. wingi和S. cerevisiae染色體為分子重標(biāo)尺；3、瓊脂糖酶法回收DMs DNA對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進(jìn)行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，切成細(xì)塊并稱重，加入1/10體積(按凝膠重量Img = 1 μ L計(jì)算)的10 X瓊脂糖酶緩沖液用于平衡反應(yīng)體系；于70°C熔化低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠后，冷卻至60°C并靜置5min， 加入瓊脂糖酶60°C消化1小時(shí)，冰上放置15min后12000r/min離心15min，取上清液并加入 1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，混勻后_20°C冷卻6 12小吋，12000r/ min離心15min，棄上清用70%的冷異丙醇清洗沉淀兩次，干燥后加入TE溶解DNA沉淀，用 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大??；ニ、將獲得的卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598的雙微體，應(yīng)用Roche公司4M技術(shù)對人卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列進(jìn)行測定；1、待測DNA文庫的構(gòu)建把待測DNA用噴霧法(nebulization)打斷成300_800bp 的小片段并在小片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎y序列變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)増，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA(ssDNA)文庫；2,Emulsion PCR 將這些ssDNA與水油包被的直徑大約觀μ m的磁珠在一起孵育、 退火，由于磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的寡核苷酸序列，因此ssDNA會連接到磁珠上；同時(shí)孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，因此可以保證每ー個(gè)與磁珠結(jié)合的小片段都會在各自的孵育體系內(nèi)獨(dú)立擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上；反應(yīng)完成后，富集帶有DNA的磁珠；經(jīng)過擴(kuò)增反應(yīng)，每ー個(gè)小片段都將被擴(kuò)增大約100萬倍，從而達(dá)到下一步測序反應(yīng)所需的模板
里；3、測序測序反應(yīng)采用焦磷酸測序法，以磁珠上大量擴(kuò)增的ssDNA為模板，毎次反應(yīng)加入ー種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)；如果這種dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)，釋放的焦磷酸基團(tuán)會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化酶反應(yīng)形成ATP，生成的ATP和熒光素酶共同氧化反應(yīng)體系中的熒光素分子并發(fā)出熒光，測序反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號由CCD照相機(jī)記錄，再經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析轉(zhuǎn)換為測序結(jié)果；由于每種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來確定被測分子的序列；反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，導(dǎo)致熒光淬滅，從而使反應(yīng)體系再生；測序反應(yīng)共獲得巧4，294條序列，平均長度42^p，說明測序反應(yīng)成功，效果較好。所述的細(xì)胞裂解液由0. 01mol/L Tris-HCl pH8. 0,0. 05mol/L NaCl、l%十二烷基肌氨酸鈉、0. lmol/L EDTA和0. 2% SDS制成。所述的Washing buffer 由 0. 01mol/L Tris-HCl 和 0. lmol/L EDTA 制成。所述的蛋白酶K溶液由0. lmol/L EDTA、1 %十二烷基肌氨酸鈉、0. 2% SDS和Img/ HiL蛋白酶K制成。所述的C存液由0. 001mol/L Tris-HCl 和 0. 01mol/L EDTA 制成。所述的脈沖場凝膠電泳條件為0. 5%瓊脂糖凝膠、10°C的0. 5XTBE電泳緩沖液。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明脈沖分離出來的高純度DMs很大程度上保證了實(shí)驗(yàn)對象的完整性，由于雙微體序列的異質(zhì)性的存在，同時(shí)重復(fù)性較高，并且總大小只有幾十兆堿基的特點(diǎn)，更適合采用Roche的妨4高通量測序技術(shù)進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)對其序列全貌及特征的全面認(rèn)識，很大程度上保證了所得序列的真實(shí)性。本發(fā)明首次利用第二代測序技術(shù)對人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列進(jìn)行測定，從中發(fā)現(xiàn)了 157條不同染色體起源的序列。這說明這些序列是腫瘤細(xì)胞所特有的、 全新的、未被報(bào)道的序列。這些序列可能是卵巢癌或含雙微體腫瘤所特有的，具有成為卵巢癌和含雙微體腫瘤臨床診斷標(biāo)記物的潛能。這些序列中所包含的融合基因從序列到功能均未見報(bào)道，很有可能參與卵巣癌和含雙微體腫瘤的形成與發(fā)展。通過對其功能的研究將會為這些腫瘤的研究提供新的方向。


圖1是雙向脈沖場凝膠電泳分離DMs圖(圖中A:分子標(biāo)尺S. cerevisiae和 H. wingei示意圖；B 第一、ニ加樣孔中為分子量標(biāo)尺S. cerevisiae和H. wingei僅進(jìn)行縱向FIGE電泳，第三個(gè)加樣孔中為UACC-1598進(jìn)行縱向FIGE和橫向CHEF兩向電泳；C UACC-1598的雙向電泳，其中第一向縱向延長時(shí)間的FIGE電泳；第二向橫向延長時(shí)間的 CHEF電泳；D =UACC-1598的雙向電泳，其中第一向縱向FIGE電泳進(jìn)ー步延長時(shí)間；第二向橫向CHEF電泳時(shí)間同C)；圖2是切膠回收DMs DNA瓊脂糖電泳檢測圖；圖3是人卵巢癌細(xì)胞UACC-1598中期染色體(X 1000)圖；圖4是雙向脈沖場凝膠電泳分離所得DNA的FISH驗(yàn)證圖(圖中A =Cy3標(biāo)記DMs DNA為探針；B =DAPI染核；C 圖A，B的融合)；圖5是DMs染色體起源的FISH分析圖(圖中A，B，C和D，E，F(xiàn)分別為兩個(gè)細(xì)胞不同顏色熒光信號圖；A和D中紅色信號代表分離所得DMs DNA ；B和E中細(xì)胞核應(yīng)用藍(lán)色 DAPI復(fù)染；C和F兩圖分別為A，B和D，E的融合)；
具體實(shí)施例方式參見圖1 圖6，本實(shí)施方式ー種人卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一、人卵巣癌細(xì)胞UACC-1598的培養(yǎng)及細(xì)胞完整雙微體的脈沖場凝膠電泳分離1、樣品制備人卵巢癌細(xì)胞UACC-1598在含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于5% CO2,37°C 條件下進(jìn)行培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期、匯合率為70% 80%的人卵巣癌細(xì)胞UACC-1598，計(jì)數(shù)后重懸于適量的PBS，使細(xì)胞密度約為1 2 X IO8細(xì)胞/mL，并在37°C水浴中孵育。加入等體積37°C的1. 4%低熔點(diǎn)瓊脂糖，混勻后倒入潔凈模具中，4°C放置10 15min使其凝固。 將膠塊從模具中取出后置于3 5倍體積的細(xì)胞裂解液中(O.Olmol/L Tris-HCl pH8. 0， 0. 05mol/LNaCl，l%十二烷基肌氨酸鈉，0. lmol/L EDTA,0. 2% SDS)于 37°C水浴中震蕩孵育約90min至膠塊透明。棄細(xì)胞裂解液并用Washing buffer(0. 01mol/L Tris_HCl，0. Imo 1/ LEDTA)反復(fù)洗膠塊3次后置于3 5倍體積的蛋白酶K溶液(0. lmol/L EDTA，十二烷基肌氨酸鈉，0. 2% SDS，lmg/mL蛋白酶K)，37°C水浴中震蕩孵育過夜。Washing buffer洗滌三次后，置于貯存液(0. 001mol/L Tris-HCl,0. 01mol/L EDTA)中 4°C保存。2、脈沖場凝膠電泳將制備好的膠塊置于0. 5%瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔。在10°C的0.5XTBE電泳緩沖液中適宜電泳條件下先進(jìn)行第一向FIGE模式電泳，隨后調(diào)整方向進(jìn)行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子。以H. wingi和S. cerevisiae 為分子量標(biāo)尺。如果要進(jìn)行后續(xù)切膠回收DNA，則需要在預(yù)期電泳條帶所到位置換上濃度稍高(0. 8% )的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。完整未經(jīng)線性化的人卵巣癌細(xì)胞中全基因組DNA經(jīng)雙向電泳分離后，呈現(xiàn)為兩個(gè)不同形狀的DNA集聚區(qū)域(如圖1B、C、D)，其中之ー為垂直的條帶，而另ー DNA集聚條帶呈拋物線狀。并且兩條電泳條帶的分布特征提示兩區(qū)域所含DNA具有不同的超微結(jié)構(gòu)。由于線性DNA分子在雙向電泳中多呈斜線狀，因此我們認(rèn)為垂直條帶為雙微體DNA成分稱之為 DMs DNA，通過與脈沖場電泳分子量標(biāo)尺比較可見其大小分布從1Mb到大于3Mb的范圍，具有明顯的異質(zhì)性(圖1A、B)。3、瓊脂糖酶法回收DMs DNA對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進(jìn)行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，切成細(xì)塊并稱重，按說明書所示加入1/10體積(按凝膠重量Img = 1 μ L計(jì)算) 的10Χ瓊脂糖酶緩沖液用于平衡反應(yīng)體系。于70°C熔化低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠后，冷卻至60°C 并靜置5min。加入適量的瓊脂糖酶60°C消化1小時(shí)，冰上放置15min后12000r/min離心15min。取上清液并加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，充分混勻后-20°C冷卻過夜。12000r/min離心15min，棄上清用70%的冷異丙醇清洗沉淀兩次，干燥后加入適量的TE溶解DNA沉淀。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大小?？梢娀厥誅NA片段大小約為15Kb (圖2)。驗(yàn)證分離所得DMs DNA純度及染色體起源1、FISH 驗(yàn)證為進(jìn)ー步驗(yàn)證分離所得的DNA條帶為雙微體特異條帯，我們將分離所得的DNA標(biāo)記為FISH探針與UACC-1598細(xì)胞中期染色體雜交，結(jié)果顯示紅色的探針信號可特異地覆蓋中期標(biāo)本中幾乎所有的DMs。同時(shí)，應(yīng)用DMs邊界序列特異引物來驗(yàn)證DMs的特異性，結(jié)果顯示邊界內(nèi)引物可擴(kuò)增出產(chǎn)物，邊界外引物無擴(kuò)增產(chǎn)物或有少量擴(kuò)增產(chǎn)物，提示我們分離所得DMs具有較好的純度。FISH探針制備以分離所得DMs DNA為模板通過DOP-PCR標(biāo)記FISH探針，反應(yīng)體系如下表所示， 反應(yīng)條件為94°C 5min ；94°C lmin，56°C lmin，72°C 1. 5min, 30cycles ；72°C 5min。1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物片段大小后_20°C保存。
PCR reagentVolume(^L)
DMs DNA2μΙ
IOxPCR buffer5μΙ dNTP5ML
1 ΟΟμπιοΙ/L Biotin-16-dUTP1 μ
Ampli Taq LD1 U
Add H2O to5C^L卵巣癌細(xì)胞UACC-1598細(xì)胞染色體中期核型制備對人卵巣癌細(xì)胞UACC-1598進(jìn)行染色體分析可見細(xì)胞中期分裂相中存在大量 DMs (染色體之間成對或單個(gè)出現(xiàn)的點(diǎn)狀物，圖3)，并且這些DMs大小各異。FISH雜交及圖像采集將已制備好的中期染色體標(biāo)本放入65°C預(yù)熱的70%甲酰胺QXSSC配制)中， 1. 5 aiiin后取出轉(zhuǎn)入預(yù)冷的70%乙醇中退火2min，隨后在70%、90%、100%系列乙醇中分別脫水a(chǎn)nin，空氣干燥。同吋，取10 μ L探針放于0. 5mL的離心管中，混勻、短暫離心后放于PCR儀中，先 750C，IOmin,再37°C，至少30min退火后備用。將變性好的探針加到已變性的中期分裂相玻片上，蓋上22mmX22mm的蓋玻片，用橡膠水封片，然后放于ー濕盒中，并放在37°C的溫箱中雜交1 3天。雜交結(jié)束，撕掉橡膠泥后將玻片放入45 0C預(yù)熱的2 X SSC中5min脫蓋玻片，之后放入45 °C預(yù)熱的50%甲酰胺O X SSC配制)中洗兩次，每次5min ；隨后在2 X SSC中洗兩次， 每次5min。取出玻片置于濕盒中，迅速加入10(^し的0丫3-3バ肚11抗體，用？3儀打1111蓋片并放入37°C孵育20min后取出，揭掉ParafiIm膜，放入4XTGXSSC，0. 02% Tween-20)中洗三次，毎次5min。用加了 DAPI的封片液封片，蓋上蓋玻片后用指甲油封片。用安裝有CCD 攝像頭的ZEISS Axioskop熒光顯微鏡觀察熒光信號，通過Cyto Vision System軟件控制圖像拍攝并進(jìn)行圖像分析。應(yīng)用雙向脈沖場凝膠電泳技術(shù)從人卵巢癌細(xì)胞UACC-1598中分離出DMs，并經(jīng)瓊脂糖酶切膠回收后，將分離所得DMs DNA標(biāo)記為FISH探針。將標(biāo)記好的DMs特異性探針與 UACC-1598中期分裂相雜交，結(jié)果顯示分離所得DNA特異性的與細(xì)胞中的DMs雜交(圖4)， 表明分離所得DNA確實(shí)為DMs。應(yīng)用DMs DNA標(biāo)記探針與正常淋巴細(xì)胞中期染色體分裂相雜交可見UACC-1598中 DMs的起源比較復(fù)雜。提示雙微體基因組成和排列的復(fù)雜性。ニ、將獲得的高純度卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598的雙微體，應(yīng)用Roche公司妨4技術(shù)對人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列進(jìn)行測定。1、待測DNA文庫的構(gòu)建。把待測DNA用噴霧法(nebulization)打斷成300_800bp的小片段并在小片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎y序列變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò) ±曾，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA(ssDNA)文庫。2、Emulsion PCR。將這些ssDNA與水油包被的直徑大約28 μ m的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的寡核苷酸序列，因此ssDNA會連接到磁珠上。同時(shí)孵育體系中含有PCR反應(yīng)試劑，因此可以保證每一個(gè)與磁珠結(jié)合的小片段都會在各自的孵育體系內(nèi)獨(dú)立擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物仍可以結(jié)合到磁珠上。反應(yīng)完成后，富集帶有DNA的磁珠。 經(jīng)過擴(kuò)增反應(yīng)，每一個(gè)小片段都將被擴(kuò)增大約100萬倍，從而達(dá)到下一步測序反應(yīng)所需的模板量。3、測序。測序反應(yīng)采用焦磷酸測序法，以磁珠上大量擴(kuò)增的ssDNA為模板，每次反應(yīng)加入一種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)。如果這種dNTP能與待測序列配對，則會在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)。釋放的焦磷酸基團(tuán)會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化酶反應(yīng)形成ATP。生成的ATP和熒光素酶共同氧化反應(yīng)體系中的熒光素分子并發(fā)出熒光。測序反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號由CCD 照相機(jī)記錄，再經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析轉(zhuǎn)換為測序結(jié)果。由于每種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，因此可以根據(jù)熒光的顏色來確定被測分子的序列。反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，導(dǎo)致熒光淬滅，從而使反應(yīng)體系再生。測序反應(yīng)共獲得154，294 條序列，平均長度425bp，說明測序反應(yīng)成功，效果較好。三、UACC-1598細(xì)胞中雙微體序列的特征分析。應(yīng)用NextGene軟件對所獲得的序列進(jìn)行起源分析，發(fā)現(xiàn)序列主要來自4個(gè)不同的染色體位置，它們分別是lq212，2p24. 3，3q262和6p22. 3。進(jìn)一步利用Blast工具與人基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)157條不同染色體起源的序列。以下是157條不同染色體起源的序列見附件I
權(quán)利要求
1. ー種人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特征在干，步驟如下一、人卵巣癌細(xì)胞UACC-1598的培養(yǎng)及細(xì)胞完整雙微體的脈沖場凝膠電泳分離；1、樣品制備人卵巢癌細(xì)胞UACC-1598在含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于5% C02、37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)；收集對數(shù)生長期、匯合率為70% 80%的人卵巣癌細(xì)胞UACC-1598，計(jì)數(shù)后重懸于PBS，使細(xì)胞密度為1 2X IO8細(xì)胞/mL，并在37°C水浴中孵育；加入等體積37°C的 1.4%低熔點(diǎn)瓊脂糖，迅速混勻后倒入潔凈模具中，4°C放置10 15min使其凝固；將膠塊從模具中取出后置于3 5倍體積的細(xì)胞裂解液中于37°C水浴中震蕩孵育約90min至膠塊透明；棄細(xì)胞裂解液并用洗液反復(fù)洗膠塊3次后置于3 5倍體積的蛋白酶K溶液，37°C水浴中震蕩孵育6 12小時(shí)；洗滌三次后，置于貯存液中4°C保存；2、脈沖場凝膠電泳將制備好的膠塊置于0. 5%瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，用相同濃度的瓊脂糖封閉加樣孔； 在10°C的0. 5XTBE電泳緩沖液中適宜電泳條件下先進(jìn)行第一向FIGE模式電泳，電泳條件為正向電壓梯度3 5V/cm，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間50 70seconds，終止轉(zhuǎn)換時(shí)間220 260seconds ；負(fù)向電壓梯度；2 4V/cm，負(fù)向起始轉(zhuǎn)換時(shí)間15 30seconds，負(fù)向終止轉(zhuǎn)換時(shí)間50 70seconds ；總電泳時(shí)間36 45hours，隨后調(diào)整方向進(jìn)行第二向CHEF模式電泳，分離大片段DNA分子；電泳條件為電壓梯度3 6V/cm，脈沖角度120，起始轉(zhuǎn)換時(shí)間100 130seconds，終止轉(zhuǎn)換時(shí)間:270 320seconds,電泳時(shí)間25 30hours,以商品化的H. wingi和S. cerevisiae染色體為分子量標(biāo)尺；3、瓊脂糖酶法回收DMsDNA對電泳凝膠中的垂直DNA條帶進(jìn)行切膠回收，切取含有目的DNA片段的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，切成細(xì)塊并稱重，加入1/10體積的IOX瓊脂糖酶緩沖液用于平衡反應(yīng)體系；于 70°C IOmin熔化低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠后，冷卻至60°C并靜置5min，加入瓊脂糖酶于60°C消化 1小時(shí)，冰上放置15min后12000r/min離心15min，取上清液并加入1/10體積3mol/L乙酸鈉溶液和1倍體積的異丙醇，混勻后_20°C冷卻6 12小時(shí)，12000r/min離心15min，棄上清用70%的冷異丙醇清洗沉淀兩次，干燥后加入TE溶解DNA沉淀，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收所得DNA片段大??；ニ、將獲得的卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598的雙微體，應(yīng)用Roche公司4M技術(shù)對人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列進(jìn)行測定；1、待測DNA文庫的構(gòu)建把待測DNA用噴霧法打斷成300-800bp的小片段并在小片段兩端加上不同的接頭，或?qū)⒋郎y序列變性后用雜交引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，連接載體，構(gòu)建單鏈 DNA文庫； 2、EmulsionPCR 將這些ssDNA與水油包被的直徑^ym的磁珠在一起孵育、退火，磁珠表面含有與接頭互補(bǔ)的寡核苷酸序列，ssDNA會連接到磁珠上；同時(shí)孵育體系中含有PCR 反應(yīng)試劑，反應(yīng)完成后，富集帶有DNA的磁珠；經(jīng)過擴(kuò)增反應(yīng)，每ー個(gè)小片段都將被擴(kuò)增100 萬倍，從而達(dá)到下一步測序反應(yīng)所需的模板量； 3、測序測序反應(yīng)采用焦磷酸測序法，以磁珠上大量擴(kuò)增的ssDNA為模板，毎次反應(yīng)加入ー種dNTP進(jìn)行合成反應(yīng)；dNTP能與待測序列配對，會在合成后釋放焦磷酸基團(tuán)，釋放的焦磷酸基團(tuán)會與反應(yīng)體系中的ATP硫酸化酶反應(yīng)形成ATP，生成的ATP和熒光素酶共同氧化反應(yīng)體系中的熒光素分子并發(fā)出熒光，測序反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號由CCD照相機(jī)記錄，再經(jīng)過計(jì)算機(jī)分析轉(zhuǎn)換為測序結(jié)果；由于每種dNTP在反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光顏色不同，根據(jù)熒光的顏色來確定被測分子的序列；反應(yīng)結(jié)束后，游離的dNTP會在雙磷酸酶的作用下降解ATP，導(dǎo)致熒光淬滅，從而使反應(yīng)體系再生；測序反應(yīng)共獲得巧4，294條序列，平均長度425bp，測序反應(yīng)即告成功。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特征在于，所述的細(xì)胞裂解液由0. 01mol/L Tris-HCl pH8. 0、0. 05mol/L NaCl、l%十二烷基肌氨酸鈉、0. lmol/L EDTA 和 0. 2% SDS 制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特征在于，所述的 Washing buffer 由 0. 01mol/L Tris-HCl 和 0. lmol/L EDTA 制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特征在干，所述的蛋白酶K溶液由0. lmol/L EDTA、1%十二烷基肌氨酸鈉、0. 2% SDS和lmg/mL 蛋白酶K制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人卵巣癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，其特征在于，所述的貯存液由0. 001mol/L Tris-HCl和0. 01mol/L EDTA制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的卵巣癌細(xì)胞中雙微體的脈沖場凝膠電泳分離純化方法，其特征在干，所述的電泳條件為0. 5%瓊脂糖凝膠、10°C的0. 5XTBE電泳緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列測定方法，一、人卵巢癌細(xì)胞UACC-1598的培養(yǎng)及細(xì)胞完整雙微體的脈沖場凝膠電泳分離；二、將獲得的卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598的雙微體，應(yīng)用Roche公司454技術(shù)對人卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中雙微體序列進(jìn)行測定。本發(fā)明脈沖分離出來的高純度DMs很大程度上保證了實(shí)驗(yàn)對象的完整性，由于雙微體序列的異質(zhì)性的存在，同時(shí)重復(fù)性較高，并且總大小只有幾十兆堿基的特點(diǎn)，更適合采用Roche的454高通量測序技術(shù)進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)對其序列全貌及特征的全面認(rèn)識，很大程度上保證了所得序列的真實(shí)性。
文檔編號C12Q1/68GK102586414SQ20111034084
公開日2012年7月18日 申請日期2011年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者于旸, 傅松濱, 孫文靖, 孟祥寧, 張春玉, 朱靜 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)