專利名稱：一種人卵巢癌多藥耐藥細胞株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細胞工程技術領域，涉及一種人類細胞株，具體涉及一種人卵巢癌多藥耐藥細胞株及其建立方法。
背景技術：
在女性生殖器官惡性腫瘤中，卵巢癌發(fā)病率居第3位，病死率居第I位。這是因為大多數(shù)卵巢癌發(fā)病隱匿，且缺乏有效準確的早期診斷方法，約70% 80%患者一經(jīng)確診已屬晚期?；瘜W藥物是治療人類惡性腫瘤的重要手段之一，然而由于腫瘤細胞耐藥性常常限制了療效進一步提高，并最終使治療失敗。腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是腫瘤細胞免受藥物攻擊的重要細胞防御機制，是指腫瘤細胞對一種化療藥物耐藥的同時也對與其結構無關、作用機制不同的其他藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象?？朔[瘤多藥耐藥性，尋找逆轉惡性腫瘤細胞多藥耐藥的新途徑，提高腫瘤細胞對化療的敏感性是當前腫瘤領域的重要課題之一。成功建立耐藥腫瘤細胞模型是開展此研究的前提和基礎。瘤細胞耐藥株的建立·方法通常有兩種，一是逐步增加藥物濃度、持續(xù)誘導法，二是大劑量沖擊法。通過耐藥細胞株的建立可以進一步構建體內(nèi)外腫瘤耐藥模型，從而深入研究MDR耐藥機制，甚至發(fā)現(xiàn)其他新的耐藥機制。通過耐藥細胞株的建立的體內(nèi)外腫瘤耐藥模型，可以用于抗腫瘤藥物的篩選。通過檢索發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)外還沒有關于以人卵巢癌細胞株H0-8910為誘導對象，建立人卵巢癌多藥耐藥細胞株H0-8910/VP16的文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種人卵巢癌多藥耐藥細胞株及其建立方法。本發(fā)明的細胞株具有典型多藥耐藥特性，為進一步研究耐藥逆轉途徑提供了實驗基礎。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:本發(fā)明采用人卵巢癌細胞株H0-8910為誘導對象，前期誘導采用大劑量沖擊法，后期誘導采用持續(xù)誘導法，建立了人卵巢癌多藥耐藥細胞株H0-8910/VP16。該細胞株已經(jīng)于2012年12月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CGMCC N0.7052。具體地，本發(fā)明涉及的人卵巢癌多藥耐藥細胞株H0-8910/VP16是按照如下方法
建立獲得:(I)人卵巢癌細胞株H0-8910用培養(yǎng)液(含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液)，5% C02，37°C條件下，培養(yǎng)至70% 90%貼壁率時，去上清，加入VP161000ng/ml沖擊培養(yǎng)I小時，去VP16100ng/ml培養(yǎng)液，空白RPM1-1640培養(yǎng)液洗滌2次后，更換增殖培養(yǎng)液培養(yǎng)72-96h擴增存活細胞。至存活細胞擴增至70% 90%貼壁率時，再重復用VP161000ng/ml培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時9次，即總共完成10次氟尿嘧啶1000ng/ml紫杉醇培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時，進一步以此細胞為基礎，1000ng/ml持續(xù)培養(yǎng)7天。(2)重復上述操作，將篩選條件依次改為VP16200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培養(yǎng)液。本發(fā)明通過細胞形態(tài)學觀察、生長曲線和群體倍增時間測定、藥物敏感試驗、細胞內(nèi)Rh-123研究及細胞周期的測定，評價人卵巢癌多藥耐藥細胞株H0-8910/VP16的生物學特性，結果成功建立了 H0-8910/VP16耐藥株，耐藥指數(shù)為81.602，對順鉬(cDPP)、紫杉醇(Taxol)、長春新堿(YCR)、氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素(Adr)產(chǎn)生了明顯的交叉耐藥性。


圖1為H0-8910、H0-8910/VP16的細胞生長曲線圖。圖2為H0-8910細胞株的細胞周期3為H0-8910/VP16細胞株的細胞周期4為羅丹明123在H0-8910細胞內(nèi)的含量5為羅丹明123在H0-8910/VP16細胞內(nèi)的含量6為本發(fā)明H0-8910/VP16細胞株的顯微圖。
具體實施例方式下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。本發(fā)明的實施例僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構思前提下對本發(fā)明方法的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例1人卵巢癌多藥耐藥細胞株H0-8910/VP16的誘導建立采用逐步遞增VP16濃度、間歇作用的體外誘導法建立人卵巢癌多藥耐藥細胞株H0-8910/VP16，具體步驟如下:(I)人卵巢癌細胞株H0-8910用培養(yǎng)液(含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液)，5% C02，37°C條件下，培養(yǎng)至70% 90%貼壁率時，去上清，加入VP161000ng/ml沖擊培養(yǎng)I小時，去VP16100ng/ml培養(yǎng)液，空白RPM1-1640培養(yǎng)液洗滌2次后，更換增殖培養(yǎng)液培養(yǎng)72-96h擴增存活細胞。至存活細胞擴增至70% 90%貼壁率時，再重復用VP16100ng/ml培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時9次，即總共完成10次氟尿嘧啶1000ng/ml紫杉醇培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)I小時，進一步以此細胞為基礎，100ng/ml持續(xù)培養(yǎng)7天。(2)重復上述操作，將篩選條件依次改為VP16200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培養(yǎng)液。(3)敏感細胞逐漸死亡，而耐藥細胞繼續(xù)生長。如此反復誘導、換液、傳代，歷時約6月，最終得到在800ng / mL VP16中穩(wěn)定生長增殖的耐藥株，命名為H0-8910/VP16。將該細胞凍存2月后復蘇，在不含5-FU的培養(yǎng)液中反復傳代2月以上仍基本保持原來的耐藥性。實施例2耐藥株形態(tài)學觀察取對數(shù)生長期的人卵巢癌多藥耐藥細胞株H0-8910/VP16，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，結果如圖6所示:細胞形態(tài)變大，核皺縮，細胞易堆積成團。實施例3細胞生長曲線測定

細胞消化、計數(shù)、配制成濃度為5X103個/mL的細胞懸液，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 u L細胞懸液(每孔500個細胞);6孔細胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2d、4d、6d、8d、IOd ;將96孔板進行MTT染色，入=490nm,測定OD值；每孔加入20 u L MTT(5mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時；棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 u L DMSO溶解，搖床10分鐘輕輕地混勻；入=490nm,酶標儀讀出每孔的OD值以時間為橫坐標、OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。H0-8910、H0-8910/VP16的細胞生長曲線見圖1。實施例4、PI染色法檢測細胞周期用0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為2 X 105/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h ；0.25%胰酶消化，收取細胞；用4°C保存的0.0lM PBS洗滌細胞3次，70%乙醇冰上固定5min, 2000rpm室溫離心5min,重懸于冷PBSlml,備用；用流式細胞儀檢測,激發(fā)波長為488nm，接收波長為575nm。結果顯示，H0-8910G1期、S期、G2期細胞分別為58.31%、23.64%、18.05%, H0-8910/VP16G1 期、S 期、G2 期細胞分別為 55.99%,36.51%、14.39%,H0-8910/VP16G1期、G2期細胞減少，S期細胞增多，結果見圖2、圖3。實施例5流式細胞儀檢測羅丹明123蓄積用0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為2 X 105/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h ；0.25%胰酶消化，收取細胞；用4°C保存的0.0lM PBS洗滌細胞3次，收集并調(diào)整細胞濃度為1父1071111，每管加入濃度為5呢/1111的羅丹明123500uL，37°C保溫30min，500rpm離心2min，去除培養(yǎng)液，再用新培養(yǎng)液洗去細胞外的羅丹明染料，在37 °C保溫IOmin,使P-gp糖蛋白功能得以發(fā)揮，把藥物泵出，再用培養(yǎng)液洗I次，放在冰冷的培養(yǎng)液中待檢測，流式細胞儀用488nm的激發(fā)光，測試細胞熒光強度。結果見圖4、圖5。H0-8910細胞熒光強度為7105，H0-8910/VP16細胞熒光強度為105，H0-8910/VP16細胞內(nèi)的細胞羅丹明123比H0-8910減少。實施例6藥物敏感試驗細胞消化、計數(shù)、 配 制成濃度為I X IO5個/ml的細胞懸液，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入IOOul細胞懸液(每孔IX IO4個細胞)；96孔細胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；用完全培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入IOOii L相應的含藥培養(yǎng)基，(4)96孔細胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；將96孔板進行MTT染色，A =490nm,測定OD值；計數(shù)各組別抑制率及藥物IC50。試驗結果參見表I。根據(jù)表I的結果可以看出，H0-8910/VP16對依托泊苷、氟尿嘧啶、順鉬、紫杉醇、長春新堿、阿霉素的耐藥指數(shù)是81.602,5.370,5.746、1.959、16.346、3.153。表I細胞株對各種化療藥物的I C50和耐藥指數(shù)
權利要求
1.一種人卵巢癌多藥耐藥`細胞株H0-8910/VP16，保藏號為CGMCC N0.7052。
全文摘要
本發(fā)明采用人卵巢癌細胞株HO-8910為誘導對象，采用大劑量沖擊法，后采用逐步遞增VP16濃度、間歇作用的體外誘導法，建立了人卵巢癌多藥耐藥細胞株HO-8910/VP16。該細胞株已經(jīng)于2012年12月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO.7052。本發(fā)明的細胞株具有典型多藥耐藥特性，為進一步研究耐藥逆轉途徑提供了實驗基礎。
文檔編號C12N5/09GK103224910SQ201310149009
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月25日 優(yōu)先權日2013年4月25日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:南京凱基生物科技發(fā)展有限公司