用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基及其制備方法。該培養(yǎng)基以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，針對(duì)微囊化細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn)，加入成分明確的小分子物質(zhì)鐵鹽、鋅鹽、亞砸酸鈉、乙酸鈉、谷氨酰胺、葡萄糖。本發(fā)明培養(yǎng)基不影響微膠囊的穩(wěn)定性，不存在傳統(tǒng)無血清培養(yǎng)基中的胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白，減少了下游工藝和成本，并且產(chǎn)物表達(dá)接近價(jià)格昂貴的特定培養(yǎng)基培養(yǎng)水平，而價(jià)格不到后者十分之一。說明本發(fā)明的無蛋白培養(yǎng)基可以用于微囊化重組CH0細(xì)胞的培養(yǎng)和蛋白表達(dá)，并大幅降低培養(yǎng)成本。
【專利說明】用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基及 其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary，CH0)細(xì)胞培養(yǎng)的無蛋白培養(yǎng)基和相應(yīng)的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微囊化細(xì)胞培養(yǎng) 1964 年由 Chang TMS (文獻(xiàn) I. Chang TMS, 1964. Semipermeable microcapsules. Science 146, 524-525)最先提出，是一種應(yīng)用廣泛的培養(yǎng)技術(shù)，已開始用 于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)、重組蛋白生產(chǎn)等領(lǐng)域。微膠囊可以調(diào)高細(xì)胞對(duì)物理和化學(xué)環(huán)境所造成 的脅迫耐受性，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)（文獻(xiàn)2，Rokstad AM, 2002. Microencapsulation of celIs producing therapeutic proteins:Optimizing cell growth and secretion. Cell Transplant 11:313-324)，顯著提高產(chǎn)物表達(dá)（文獻(xiàn) 3. Zhang Y，2008. Optimization of microencapsulated recombinant CHO cell growth,endostatin production, and stability of microcapsule in vivo. J Biomed Mater Res B Appl 8101^^1^.84(1):79-881中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO)是一種成纖維細(xì)胞，也是哺乳動(dòng)物細(xì)胞 生產(chǎn)重組蛋白的主要細(xì)胞系，具有準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能和重組基因的高效擴(kuò)增和表達(dá)能 力，表達(dá)的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近天然蛋白分子。 現(xiàn)在已經(jīng)有多種重組蛋白藥物在CHO細(xì)胞中得到高效表達(dá)并投入市場(chǎng)，例如促紅細(xì)胞生成 素（Erythropoietin),依那西普（Enbrel)。因此，采用微囊化CHO細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白具有 廣闊的應(yīng)用前景。
[0003] 傳統(tǒng)的微囊化培養(yǎng)重組CHO培養(yǎng)基中含有血清，通常是在DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 添加5-10%的小牛血清或胎牛血清。血清為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)成分，并且提供了細(xì)胞增殖 必須的生長(zhǎng)因子，促使細(xì)胞DNA的合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖。但是，哺乳動(dòng)物的血清不僅價(jià)格昂 貴不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，并且作為動(dòng)物來源的補(bǔ)加物存在很多問題。無血清培養(yǎng)基要 求找到適當(dāng)?shù)木哂醒骞δ艿囊蜃?，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白幾乎是所有細(xì)胞株在無血清培養(yǎng) 時(shí)需要的必需補(bǔ)充因子。但生長(zhǎng)過程中使用了含有動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較 復(fù)雜，最終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨 勢(shì)而出現(xiàn)的。如Gibco公司生產(chǎn)的無蛋白培養(yǎng)基⑶OptiCHO價(jià)格昂貴，每升1000元，用于 培養(yǎng)重組CHO細(xì)胞時(shí)占據(jù)生產(chǎn)的大部分成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足之處，提供一種適于微囊化培養(yǎng)重 組CHO細(xì)胞培養(yǎng)和重組蛋白表達(dá)的無蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明需要解決的問題是提供一種 低成本的可用于重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞微囊化培養(yǎng)的無蛋白培養(yǎng)基來有效生產(chǎn)重組蛋白。
[0005] 本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于所述無蛋白 培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入無機(jī)鹽類、小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的小分子物質(zhì)， 所述培養(yǎng)基中無蛋白成分。
[0007] 如所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其中所述無蛋 白培養(yǎng)基含有DMEM/F12培養(yǎng)基和鐵鹽及鋅鹽。
[0008] 如所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其中所述無蛋 白培養(yǎng)基中無機(jī)鹽類是鐵鹽檸檬酸鐵。
[0009] 如所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其中所述無蛋 白培養(yǎng)基中無機(jī)鹽類是鋅鹽硫酸鋅。
[0010] 如所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其中所述無蛋 白培養(yǎng)基添加的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是葡萄糖和谷氨酰胺。
[0011] 如所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其中所述無蛋 白培養(yǎng)基中含有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的小分子物質(zhì)是乙酸鈉和亞硒酸鈉。
[0012] 如所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其中所述無蛋 白培養(yǎng)基中含有DMEM/F12培養(yǎng)基和以下基本成分：
[0013]

【權(quán)利要求】
1. 用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其特征在于：所述無蛋白 培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入無機(jī)鹽類、小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的小分子物質(zhì)， 所述培養(yǎng)基中無蛋白成分。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其特 征在于：所述無蛋白培養(yǎng)基含有DMEM/F12培養(yǎng)基和鐵鹽及鋅鹽。
3. 如權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其特 征在于：所述無蛋白培養(yǎng)基中無機(jī)鹽類是鐵鹽檸檬酸鐵。
4. 如權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其特 征在于：所述無蛋白培養(yǎng)基中無機(jī)鹽類是鋅鹽硫酸鋅。
5. 如權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其特 征在于：所述無蛋白培養(yǎng)基添加的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是葡萄糖和谷氨酰胺。
6. 如權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其特 征在于：所述無蛋白培養(yǎng)基中含有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的小分子物質(zhì)是乙酸鈉和亞硒酸鈉。
7. 如權(quán)利要求1所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基，其特 征在于：所述無蛋白培養(yǎng)基中含有DMEM/F12培養(yǎng)基和以下基本成分：
8. 權(quán)利要求1-7中所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基在 制備根據(jù)聚電解質(zhì)絡(luò)合原理制備的含有重組CHO細(xì)胞的生物微膠囊，以及微囊化重組CHO 細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，其中所述微膠囊為海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉APA微膠囊。
9. 權(quán)利要求1-7中所述的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基在 制備APA微囊化重組CHO細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于：將適量細(xì)胞懸于無菌的海藻酸鈉溶 液，利用微囊制備儀將細(xì)胞懸液滴入CaCl 2溶液形成海藻酸鈣膠珠，鈣化20分鐘后海藻酸 鈣凝膠珠與適量的聚賴氨酸溶液發(fā)生電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)形成微膠囊膜，成膜后的海藻酸鈣凝 膠珠用檸檬酸鈉溶液液化微囊內(nèi)的海藻酸鈣凝膠，形成液化核心的微膠囊，用生理鹽水洗 去微膠囊和細(xì)胞碎屑，制備出微囊化重組CHO細(xì)胞；微囊化重組CHO細(xì)胞在37°C，5% CO2培 養(yǎng)箱，在本發(fā)明的用于培養(yǎng)微囊化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天測(cè)定 DSPA表達(dá)量，與對(duì)照例對(duì)比。
10. 如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于：將適量細(xì)胞懸于無菌的1.5% (w/v)海藻 酸鈉溶液，細(xì)胞密度為2X106/ml，利用微囊制備儀將細(xì)胞懸液滴入1. 1% (WZV)CaCl2溶液 形成海藻酸鈣膠珠，鈣化20分鐘后海藻酸鈣凝膠珠與適量的聚賴氨酸溶液發(fā)生電解質(zhì)絡(luò) 合反應(yīng)形成微膠囊膜，成膜后的海藻酸鈣凝膠珠用55mmol/l的檸檬酸鈉溶液液化微囊內(nèi) 的海藻酸鈣凝膠，形成液化核心的微膠囊，用生理鹽水洗去微膠囊和細(xì)胞碎屑，制備出實(shí)驗(yàn)
所需的微囊化重組CHO細(xì)胞；微囊化細(xì)胞在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱，在本發(fā)明的用于培養(yǎng)微囊 化重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞的無蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天測(cè)定DSPA表達(dá)量，與對(duì)照例對(duì)比。
【文檔編號(hào)】C12N11/04GK104212768SQ201410482949
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】馬小軍, 王雨, 張英, 李娜, 陳立, 于煒婷, 李珅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所