專利名稱：外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因組學(xué)、生物信息學(xué)領(lǐng)域，涉及外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記(Conserved sequence of exon amplified polymorphism, CSEAP)及其分析方法。
背景技術(shù)：
分子標(biāo)記是以生物大分子(主要是遺傳物質(zhì)DNA)的多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標(biāo)記，具有數(shù)量多、多態(tài)性高、不受季節(jié)、環(huán)境影響、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單迅速等多種優(yōu)點(diǎn)。分子標(biāo)記已經(jīng)成為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域，廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性分析、遺連鎖圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、親緣關(guān)系分析、性別鑒定、基因組作圖、基因克隆、文庫(kù)構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇育種等多個(gè)方面。自1980年首次提出分子標(biāo)記的概念以來(lái)，分子標(biāo)記的研究不斷有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，特別是上世紀(jì)90年代以來(lái)，發(fā)展十分迅速。目前，可用于分子標(biāo)記的方法超過十種，在植物的分子遺傳研究中應(yīng)用比較多的有DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(Random amplified polymorphism，RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence R印eat，SSR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)和單核苷酸多態(tài)性(Sigle nucleotide polymorphisms, SNP)等，分子標(biāo)記體系類型多樣，應(yīng)用廣泛，但各自的技術(shù)復(fù)雜性、可靠性與提供的遺傳信息豐富度不同。1980 年Botstein 等提出了 RFLP 分子標(biāo)記技術(shù)(Botstein D, White R L, Skolnick Μ, Davis R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics,1980,32 314-331)，從此開創(chuàng)了利用DNA多態(tài)性進(jìn)行分子標(biāo)記的新階段。該方法的基本原理為將基因組DNA用已知的限制性內(nèi)切酶消化，電泳經(jīng)Southern印跡后，用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記探針，與轉(zhuǎn)移于支持膜上的DNA雜交，經(jīng)放射自顯影顯示出基因組DNA中與探針同源的DNA序列片段的大小。RFLP標(biāo)記呈共顯性，標(biāo)記準(zhǔn)確，不影響表型，數(shù)目也較多，但其分析程序復(fù)雜，有放射性污染，技術(shù)難度大，費(fèi)時(shí)，成本較高，需要的DNA量較大，難以大范圍推廣應(yīng)用。1990 年，Williams 等(Williams J G，Kubelik A R, Livak K J, Rafalski J A, Tingey S V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res,1990,18(22) :6531_6535)和 Welsh 等(Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primer. Nucleic Acids Res, 1990,18 (24) :7213_7218)幾乎同時(shí)將PCR技術(shù)應(yīng)用于分子標(biāo)記，發(fā)展出一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)RAPD，該方法是用短的(通常為IObp)隨機(jī)序列DNA作為引物，對(duì)目的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生多態(tài)性。RAPD技術(shù)快速、簡(jiǎn)便、成本低廉。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定的缺陷=RAPD為顯性標(biāo)記，不能提供完整的信息；易受實(shí)驗(yàn)條件影響；穩(wěn)定性差；結(jié)果不能區(qū)分純合體和雜合體。1989年Tautz提出了 SSR分子標(biāo)記方法(Rautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source forpolymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research, 1989，17 :6463_6471)，該方法是根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增每個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長(zhǎng)度多態(tài)性。SSR具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，DNA 用量少，重復(fù)性高。但要獲得SSR引物需要進(jìn)行大量克隆、測(cè)序和雜交驗(yàn)證工作。1992年， Vos等人把RAPD和RFLP技術(shù)結(jié)合起來(lái)，發(fā)明了新的分子標(biāo)記AFLP技術(shù)(Vos P, Hogers R， Bleeker M,Reijans M,van de Lee Τ, Hoernes Μ,Frijters A, Pot J, Peleman J, kuiper M,Zabeau M. AFLP :a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 1995, 23 =4407-4414)，該發(fā)明于1993年獲歐洲專利局專利，專利號(hào)為EP0534858A1。該法先設(shè)計(jì)針對(duì)某種限制性內(nèi)切酶的通用接頭，以及可與接頭序列和限制性酶切位點(diǎn)的序列配對(duì)的專用引物，用上述內(nèi)切酶消化基因組DNA，將通用接頭與限制性片段兩端連接，再用專用引物擴(kuò)增，最后電泳顯示結(jié)果。AFLP具有標(biāo)記多態(tài)性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好以及可用于沒有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的物種等優(yōu)點(diǎn)，很快被推廣到生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。但也存在明顯的缺點(diǎn)技術(shù)繁瑣、過程時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)的不是等位片段、費(fèi)用昂貴，且AFLP標(biāo)記是顯性標(biāo)記， 不能提供完整信息。1996 年，Lander 提出了 SNP 技術(shù)(Lander E S. The new genomics Global views of biology. Science，1996，274 :536_539)，SNP 數(shù)量最為豐富，其遺傳穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于SSR，可以進(jìn)行快速、規(guī)?；Y查，易于基因分型，正成為一種極具應(yīng)用潛力的新型分子標(biāo)記。SNP既可以用PCR，又可以用DNA芯片來(lái)檢測(cè)，但目前對(duì)SNP的檢測(cè)在技術(shù)上還顯得太復(fù)雜，難度較大，因而還難以廣泛應(yīng)用。近年來(lái)也發(fā)展了不少新的分子標(biāo)記技術(shù)。主要有中國(guó)專利CN200410084499. 5，一種分子標(biāo)記及其開發(fā)方法。該發(fā)明利用已完成測(cè)序的基因組及cDNA序列，將它們進(jìn)行聯(lián)配，得到每個(gè)基因的內(nèi)含子數(shù)量及長(zhǎng)度，對(duì)相應(yīng)的內(nèi)含子進(jìn)行比較，從而得到兩基因組間的長(zhǎng)度差異的內(nèi)含子，在該內(nèi)含子兩側(cè)的外顯子上或在其內(nèi)部差異位點(diǎn)兩側(cè)的保守序列上設(shè)計(jì)引物，利用設(shè)計(jì)和引物和基因組序列進(jìn)行電子 PCR，選擇只有一個(gè)PCR產(chǎn)物的標(biāo)記作為分子標(biāo)記。中國(guó)專利CN 200710026739. X，一種基于功能基因多態(tài)性的分子標(biāo)記方法。該方法是針對(duì)現(xiàn)有分子標(biāo)記技術(shù)，尤其是TRAP和SNP標(biāo)記技術(shù)的不足之處，利用已知物種的公用數(shù)據(jù)庫(kù)中的gDNA、cDNA或EST序列信息，設(shè)計(jì)不同基因的特異引物和高頻序列引物并配合其相應(yīng)的退火溫度，作為基于PCR的功能基因擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記方法。中國(guó)專利CN 200710150329. 6，保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法。該方法是根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽EST和內(nèi)含子的保守序列充計(jì)固定引物，設(shè)計(jì)隨機(jī)引物的核心序列為CACGC，所用的固定引物序列為El :5，ATTCAGCCGATTGCAAGAGA3，/CVl71606 ；E2 :5，TATCTTGACCAGGCGAGACCT3，/CV171904。隨機(jī)引物的序列如下Cl 5，GACTGCGTACGCACGCTGA3，，C2 5，GACTGCGTACGCACGCTGA3，，C3 5，GACTGCGTACGCACGCAAC3，。將上述固定引物和隨機(jī)引物組合進(jìn)行PCR檢測(cè)多態(tài)性。Bertrand 等提出了 SCoT 分子標(biāo)記方法(Bertrand C. Y.，Collard, David J.，Mackill.Start codon targeted (SCoT) polymorphism :a simple novel DNA marker technique for generating gene-targeted markers in plants. Plant Mol Biol Rep, 2009,27 :86-93)，該方法是通過在基因的起碼密碼子的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，對(duì)基因組DNA 進(jìn)行單引物擴(kuò)增產(chǎn)生多態(tài)性。綜上所述，除最早提出的RFLP技術(shù)外，其余的分子標(biāo)記方法都是以PCR為基礎(chǔ)，相對(duì)比較簡(jiǎn)單，被大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員所采用。但它們大部分都屬于傳統(tǒng)意義上的隨機(jī)DNA分子標(biāo)記，擴(kuò)增的片段可能是非編碼區(qū)域，也可能隨機(jī)在基因組中擴(kuò)增，得到的位點(diǎn)一般與目標(biāo)性狀基因距離較遠(yuǎn)，不能很好地與目標(biāo)性狀聯(lián)系起來(lái)，這使得分子標(biāo)記在應(yīng)用上與其目標(biāo)有一定的偏差，因而限制了它們的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)單、有效、重復(fù)性好、 與功能基因相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記技術(shù)十分必要，使分子標(biāo)記的分析結(jié)果與目標(biāo)性狀密切聯(lián)系，從而加快遺傳育種的進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供操作簡(jiǎn)便、有效、重復(fù)性好、減少引物篩選的時(shí)間和成本、能夠與目標(biāo)性狀聯(lián)系密切的一種外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性的分子標(biāo)記方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法，利用已知物種的公用數(shù)據(jù)庫(kù)中的mRNA序列信息，找出基因外顯子的5堿基寡聚核苷酸保守序列，以這個(gè)保守序列為核心，在其3’端連接6堿基隨機(jī)序列構(gòu)成11堿基序列，與5’端的固定序列共同組成20bp的引物。通過mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，初步篩選出11堿基序列出現(xiàn)頻率較高的引物，再用PCR對(duì)其進(jìn)行重復(fù)性篩選，得到作為基于FCR的外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記，主要技術(shù)步驟是(1)序列下載及分析從NCBI網(wǎng)站下載已公布的本物種或近緣物種mRNA序列，構(gòu)建 mRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)，用編程軟件 Delphi 7. O (Borland Software Corporation，USA)進(jìn)行編程， 將四種堿基(A、T、C、G)組合產(chǎn)生1024種5堿基寡聚核苷酸序列。通過編制的程序把這些寡聚核苷酸序列與mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的每一條記錄逐一進(jìn)行比較，得出在數(shù)據(jù)庫(kù)的mRNA序列中出現(xiàn)頻率較高的5堿基寡聚核苷酸序列；(2)引物設(shè)計(jì)引物由三個(gè)部分組成，即核心區(qū)域、3’端隨機(jī)序列及5’端序列。引物的核心區(qū)域?yàn)椴襟E(1)搜索得到的出現(xiàn)頻率較高的5堿基寡聚核苷酸序列，在核心區(qū)域外的3’端為6堿基隨機(jī)序列，與核心區(qū)域構(gòu)成11堿基序列，5’端固定為GTGTGCCAG，所有引物長(zhǎng)度為20bp;(3)引物初步篩選通過編制的程序，把11堿基序列與本物種或與其近緣物種的 mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的每一條記錄逐一進(jìn)行比較，篩選出11堿基序列在數(shù)據(jù)庫(kù)的核苷酸序列中出現(xiàn)頻率較高的引物；(4)引物的重復(fù)性篩選用步驟3篩選的出現(xiàn)頻率較高的引物進(jìn)行PCR篩選出重復(fù)性好的引物。以上所述出現(xiàn)頻率是指含5堿基寡聚核苷酸序列的mRNA序列數(shù)占數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNA 序列總數(shù)的比例。以上所述本物種是指要進(jìn)行分子標(biāo)記的物種。
以上近緣物種是指與要進(jìn)行分子標(biāo)記的物種在進(jìn)化上較近的物種。以上所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C初始變性5min，接下來(lái)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)進(jìn)行為95°C 30sec、50-55°C 30sec 和 72°C 1. 5_2min，最后一個(gè)循環(huán)延伸為 72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物采用8 %的聚丙烯酰胺膠電泳分離，用硝酸銀染色觀察。所述的外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性的分子標(biāo)記方法是在植物分類、植物種質(zhì)資源識(shí)別方面的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果 1、本發(fā)明的分子標(biāo)記方法CSEAP設(shè)計(jì)的弓丨物充分利用了已公布的mRNA序列，引物設(shè)計(jì)成本低，簡(jiǎn)單高效，擴(kuò)增條帶量多。2、本發(fā)明的分子標(biāo)記方法CSEAP的PCR退火溫度為50°C，在保證擴(kuò)增條帶數(shù)量的前提下，大大提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可靠性。3、本發(fā)明的CSEAP引物擴(kuò)增條帶的數(shù)量可用相關(guān)的mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)，大大地減少引物篩選的時(shí)間和成本。4、本發(fā)明的CSEAP引物的核心區(qū)域?yàn)橥怙@子的保守序列，因此其能夠與基因組 DNA中的外顯子特定位點(diǎn)匹配，擴(kuò)增片段就是目標(biāo)基因的一部分，這一特點(diǎn)為CSEAP法進(jìn)行遺傳多樣性分析的結(jié)果與性狀之間產(chǎn)生密切聯(lián)系提供可能。5、本發(fā)明的CSEAP引物的核心區(qū)域GAAGA序列在絕大多數(shù)mRNA序列都存在，因此，以CSEAP方法可以對(duì)不同的物種進(jìn)行分子標(biāo)記研究。另外，CSEAP方法也可以用于對(duì) mRNA的表達(dá)差異進(jìn)行研究。可廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因或QTL定位、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性分析、基因組研究和mRNA表達(dá)差異分析等多種領(lǐng)域。


圖1 查找基因外顯子保守序列程序流程圖。圖1的說(shuō)明序列程序流程是首先利用程序?qū)⑺姆N堿基(A、T、C、G)隨機(jī)組合，生成5堿基寡聚核苷酸序列，然后在數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的每一個(gè)記錄進(jìn)行自動(dòng)搜索，計(jì)算包含5堿基寡聚核苷酸序列的記錄數(shù)，再除以總記錄數(shù)，則得到5堿基寡聚核苷酸序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)的頻率，最后把這些數(shù)據(jù)寫進(jìn)文件進(jìn)行記錄。圖2 =CSEAP引物結(jié)構(gòu)示意圖。圖2的說(shuō)明CSEAP引物是由三個(gè)部分組成的20堿基引物核心區(qū)域、3’端6堿基隨機(jī)序列、5’端序列。核心區(qū)域是植物mRNA序列的保守寡聚核苷酸序列GAAGA ；5’端序列固定為GTGTGCCAG ；3，端是CSEAP引物產(chǎn)生多態(tài)性的基礎(chǔ)，它是由4種堿基(A、T、C、G)組合產(chǎn)生的6堿基序列，與CSEAP的核心序列構(gòu)成11堿基序列。圖3 CSEAP原理圖解。圖3的說(shuō)明圖3是在基因型A的一條DNA鏈的3’端有TCTTC序列，且5’端有 GAAGA序列，如果這兩個(gè)序列之間內(nèi)測(cè)的6個(gè)堿基能與CSEAP引物的6個(gè)隨機(jī)堿基配對(duì)，則能進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，在凝膠電泳上呈陽(yáng)性。相對(duì)應(yīng)的，基因型B的DNA鏈上的TCTTC和GAAGA 序列之間內(nèi)測(cè)的6堿基在遺傳過程中產(chǎn)生變異，而不能與CSEAP引物的6個(gè)隨機(jī)堿基配對(duì)， 從而不能進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)散，在凝膠電泳中呈陰性。圖4 部分CSEAP引物對(duì)甘蔗DNA擴(kuò)增結(jié)果。
圖 4 的說(shuō)明最左邊泳道為 100+2+3kb DNA Ladder-M(Sangon Biotech, cat. No SDM37)，泳道1-37分別為37個(gè)甘蔗品種。圖5 37個(gè)甘蔗品種間的UPGMA聚類樹狀圖。圖5的說(shuō)明A為CSEAP法，B為ISSR法。兩種分子標(biāo)記方法都能把37個(gè)甘蔗品種分成兩大類，一類包括GT28和GT99-107兩個(gè)品種，其他的品種屬于另一類群。另外對(duì)一些親緣比較近的品種，如YT55、HD28，YL6、GT02-833、GT02-619、LC03-1137等，兩種方法均把它們分別劃分為同一小類。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過以下實(shí)例進(jìn)一步詳述，下述實(shí)例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例是以甘蔗品種資源為材料，以擬南芥和水稻為近緣物種進(jìn)行外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性的分子標(biāo)記。1、選用37個(gè)甘蔗品種資源為材料，從甘蔗植株取心葉，去除中脈后剪取中間部分用于提取DNA，采用CTAB法提取DNA。2、從NCBI網(wǎng)站下載擬南芥、甘蔗和水稻的mRNA序列，分別構(gòu)建這幾種作物的mRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)，擬南芥mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)包含78301條記錄，其中的mRNA序列有完全序列和部分序列。 甘蔗和水稻的mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)分別由75和3990條mRNA完全序列組成。用編程軟件Delphi 7. 0 (Borland Software Corporation, USA)進(jìn)行編程，將四種堿基(Α、Τ、C、G)組合產(chǎn)生 1024種5堿基寡聚核苷酸序列。通過編制的程序把這些寡聚核苷酸序列與上面的三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的每一條記錄逐一進(jìn)行比較，得出在數(shù)據(jù)庫(kù)的mRNA序列中出現(xiàn)頻率較高的5堿基寡聚核苷酸序列GAAGA。3、依據(jù)查找到的外顯子保守序列來(lái)設(shè)計(jì)CSEAP引物，引物由三個(gè)部分組成，即核心區(qū)域、3’端隨機(jī)序列及5’端序列。CSEAP引物的核心區(qū)域?yàn)橥怙@子保守序列GAAGA，在核心區(qū)域外的3’端為6堿基隨機(jī)序列，與核心區(qū)域構(gòu)成11堿基序列，5’端固定為GTGTGCCAG， 所有引物長(zhǎng)度為20bp。通過編制的程序，把11堿基序列與擬南芥的mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的每一條記錄逐一進(jìn)行比較，計(jì)算出引物序列在數(shù)據(jù)庫(kù)的核苷酸序列中出現(xiàn)的頻率，選用出現(xiàn)頻率最高的引物序列進(jìn)行PCR篩選出重復(fù)性好的引物。4、貞_ CSEAPl弓L$Tprofession￡il Thermocycler PCRft (Biometra)
PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系的總體積為 25 μ 1，包括2. 5μ 1 IOXReaction buffer (BioFlux, withl5mM MgCl2)、0· 5 μ 1 dNTP 混合物(各 IOmM)、1U rTaq聚合酶(BioFlux)禾口 3 μ 1 CSEAP 引物(稀釋到10 μ Μ)。每個(gè)反應(yīng)的DNA模板濃度為50ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C初始變性 5min，接下來(lái)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)進(jìn)行95°C 30sec、50°C 30sec和72°C 2min，最后一個(gè)循環(huán)延伸為72°C 7min。所有的CSEAP產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺膠電泳分離，用硝酸銀染色觀察。5、擴(kuò)增的CSEAP產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫(kù)。在相同遷移位置，有帶(顯性)記為1，無(wú)帶(隱性)記為0，依此構(gòu)成0/1遺傳相似矩陣。僅記清晰、穩(wěn)定且可重復(fù)的條帶。 二元數(shù)據(jù)矩陣用NTSYS-PC 2. 1軟件中的UPGMA法進(jìn)行聚類分析，繪制樹狀聚類圖。
結(jié)果顯示，從擬南芥mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到的出現(xiàn)頻率最高的19條引物中，有18 條引物都出現(xiàn)很好的重復(fù)性，且擴(kuò)增的條帶數(shù)較多，說(shuō)明引物的設(shè)計(jì)是正確的和可行的。 用CSEAP法能夠把供試的37個(gè)品種區(qū)分開來(lái)，且其聚類分析結(jié)果與ISSR法基本一致，即 CSEAP法是用于對(duì)物種的遺傳多樣性分析的一種新的、有效的分子標(biāo)記方法。
權(quán)利要求
1.外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法，其特征在于利用己知物種的公用數(shù)據(jù)庫(kù)中的HiRNA序列信息，找出基因外顯子的5堿基寡聚核苷酸保守序列，以這個(gè)保守序列為核心，在其3’端連接6堿基隨機(jī)序列構(gòu)成11堿基序列，與5’端的固定序列共同組成20bp的引物。
2.通過mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)初步篩選出11堿基序列出現(xiàn)頻率較高的引物，再用PCR對(duì)其進(jìn)行重復(fù)性篩選，得到作為基于FCR的外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記，主要技術(shù)步驟是(1)序列下載及分析從NCBI網(wǎng)站下載已公布物種的mRNA序列，構(gòu)建mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，用編程軟件 Delphi 7.0 (Borland Software Corporation, USA)進(jìn)行編程，將四種堿基(A、 Τ、C、G)組合產(chǎn)生1024種5堿基寡聚核苷酸序列，通過編制的程序把這些寡聚核苷酸序列與mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的每一條記錄逐一進(jìn)行比較，得出在數(shù)據(jù)庫(kù)的mRNA序列中出現(xiàn)頻率較高的 5堿基寡聚核苷酸序列；(2)引物設(shè)計(jì)引物由三個(gè)部分組成，即核心區(qū)域、3’端隨機(jī)序列及5’端序列，引物的核心區(qū)域?yàn)椴襟E(1)搜索得到的出現(xiàn)頻率較高的5堿基寡聚核苷酸序列，在核心區(qū)域外的3’端為6堿基隨機(jī)序列，與核心區(qū)域構(gòu)成11堿基序列，5’端固定為GTGTGCCAG，所有引物長(zhǎng)度為20bp ；(3)引物初步篩選通過編制的程序，把11堿基序列與本物種或與其近緣物種的mRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)的每一條記錄逐一進(jìn)行比較，篩選出11堿基序列在數(shù)據(jù)庫(kù)的核苷酸序列中出現(xiàn)頻率較高的引物；(4)引物的重復(fù)性篩選用步驟3篩選的出現(xiàn)頻率較高的引物進(jìn)行PCR篩選出重復(fù)性好的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法，其特征在于所述出現(xiàn)頻率是指含5堿基寡聚核苷酸序列的mRNA序列數(shù)占數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNA序列總數(shù)的比例。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法，其特征在于所述本物種是指要進(jìn)行分子標(biāo)記的物種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法，其特征在于所述近緣物種是指與要進(jìn)行分子標(biāo)記的物種在進(jìn)化上較近的物種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C初始變性5min，接下來(lái)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)進(jìn)行為95°C 30sec、50-55°C 30sec 和 72°C 1. 5_2min，最后一個(gè)循環(huán)延伸為 72°C 1 Omin, PCR 產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺膠電泳分離，用硝酸銀染色觀察。
7.權(quán)利要求1所述的外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法在農(nóng)作物品種資源遺傳多樣性和識(shí)別方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記及其分析方法，能利用己知物種的公用數(shù)據(jù)庫(kù)中的mRNA序列信息，找出基因外顯子的5堿基寡聚核苷酸保守序列，以這個(gè)保守序列為核心，在其3’端連接6堿基隨機(jī)序列構(gòu)成11堿基序列，與5’端的固定序列共同組成20bp的引物。通過mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)初步篩選出11堿基序列出現(xiàn)頻率較高的引物，再用PCR對(duì)其進(jìn)行重復(fù)性篩選，得到作為基于FCR的外顯子保守序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記。本方法操作簡(jiǎn)便、有效、重復(fù)性好、減少引物篩選的時(shí)間和成本。這是遺傳多樣性分析的一種新的、有效的分子標(biāo)記方法?？蓮V泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因或QTL定位、標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性分析、基因組研究和mRNA表達(dá)差異分析等多種領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102443583SQ20111034165
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月2日
發(fā)明者何海旺, 何龍飛, 李創(chuàng)珍, 許春燕, 韋善清 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)