專利名稱：腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-fq-pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腐敗希瓦氏菌的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
腐敗希瓦氏菌(徹薩putrefaciens, MacDonell and Colwell)，曾名腐敗假單胞菌，系希瓦氏菌屬，屬革蘭氏陰性、兼性厭氧、非發(fā)酵型菌，其為冷藏魚的主要腐敗菌，也是海洋陸源排污口的優(yōu)勢(shì)菌。腐敗希瓦氏菌廣泛分布于食品、污泥、淡水及海水中，是水生動(dòng)物和富含蛋白食品相關(guān)的典型腐敗菌，其腐敗活性強(qiáng)，它能把氧化三甲胺(TMAO)還原為三甲胺(TMA)，產(chǎn)生揮發(fā)性硫，腐敗時(shí)出現(xiàn)硫化氫味或酸臭味。0°C、5°C冷藏的養(yǎng)殖大黃魚的優(yōu)勢(shì)菌即為腐敗希瓦氏菌；南美白對(duì)蝦在冰溫條件下貯藏4 d就產(chǎn)生希瓦氏菌，它也引起仿刺參“腐皮綜合癥”。熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)是一項(xiàng)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的利用熒光技術(shù)對(duì)核酸進(jìn)行絕對(duì)定量的新興技術(shù)。該技術(shù)是通過(guò)向 PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料，通過(guò)受體發(fā)色團(tuán)之間偶極_偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)，整個(gè)PCR進(jìn)程中利用熒光信號(hào)的累積進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)模板進(jìn)行定量分析。與常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)相比，它具有特異性更強(qiáng)、準(zhǔn)確定量、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。在眾多現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)中脫穎而出，成為細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域中一種重要的快速檢測(cè)手段。如專利號(hào)為ZL200710031324，名稱為熒光定量PCR檢測(cè)綠膿桿菌的試劑盒的發(fā)明專利就公開(kāi)了由DNA提取液、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰、陽(yáng)性質(zhì)控品等試劑組成的試劑盒，其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中有耐熱DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸、特異性的正、反向引物和探針；可以檢測(cè)含綠膿桿菌的血液、尿液、痰液、膿汁、水、氣特物。磁珠(Fe3O4)作為吸附和結(jié)合各種分子的載體，與含有相應(yīng)抗原的抗體結(jié)合形成免疫磁珠，使免疫磁珠上抗體與樣品中抗原結(jié)合，通過(guò)磁性分離，得到濃縮、純凈的含相應(yīng)抗原的待測(cè)樣品，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率和靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)時(shí)間較低短、檢測(cè)效率和靈敏度較高的腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測(cè)方法，包括下述步驟
1、抗體制備將濃度為IO9Cfu /mL的腐敗希瓦氏菌液0.20mL注射于小鼠腹腔內(nèi)首次免疫，間隔一周相同劑量的腐敗希瓦氏菌液加強(qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)免疫三次，每次加強(qiáng)免疫的腐敗希瓦氏菌液濃度為IOltlCfu /mL，最后一次加強(qiáng)免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37°C下溫育0. 5h，4°C下3000 r / min離心15min，取上清，得到腐敗希瓦氏菌抗體溶液；該腐敗希瓦氏菌抗體溶液可以利用考馬斯亮濫法檢測(cè)蛋白含量；2、免疫磁珠制備取48mg的Fe3O4磁株先后用乙醇和雙蒸水超聲清洗干凈，用二次水定容至20mL得磁珠溶液，在IOmL磁株溶液中，加入質(zhì)量濃度為10%戊二醛溶液2mL，室溫下攪拌3h，固液分離后用磷酸吐溫緩沖液(PBST)清洗磁株，所述磷酸吐溫緩沖液中由磷酸緩沖液與吐溫20配制而成，所述磷酸吐溫緩沖液中所述吐溫20的體積百分濃度為0. 03 0. 07%，再將清洗后的磁株懸浮于2mL磷酸緩沖液(PBS)中，所述磷酸緩沖液的pH為7 7. 5，然后加入50 μ L上述腐敗希瓦氏菌抗體溶液，4°C下輕輕攪拌12h，得到腐敗希瓦氏菌免疫磁珠溶液，4°C保存?zhèn)溆茫?br> 3、待測(cè)樣品富集在盛有0.ImL的上述腐敗希瓦氏菌免疫磁珠溶液中加入ImL待測(cè)樣品液，室溫輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩30min，將試管置于磁性細(xì)胞分離架上3min，移出管中液體，每次用1. OmL上述磷酸緩沖液清洗腐敗希瓦氏菌免疫磁珠，重復(fù)清洗3 5次，清洗完畢，加入 0. 5 ImL無(wú)菌水，磁性分離，取出腐敗希瓦氏菌免疫磁珠后，得到富集的待檢樣品溶液；
4、模板DNA制備將上述待檢樣品溶液，在100°C溫度下煮沸10min，12000 r / min離心5min，取上清，得到模板DNA溶液；
5、PCR反應(yīng)取上述模板DNA溶液5μ L，加入到由含有熒光染料的Ti^TM II混合液(大連寶生生物有限公司)10 μ L、引物濃度為10 μ M的FQF引物溶液0. 5 μ L、引物濃度為10 μ M 的FQR引物溶液0. 5μ L的反應(yīng)體系中，用無(wú)菌水無(wú)菌水定容至20 μ L，反應(yīng)程序95°C預(yù)變性5min ；94°C變性5s、50°C退火15s、72°C延伸15s，共45個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)中若有熒光信號(hào)響應(yīng)，則待檢樣品溶液含有腐敗希瓦氏菌；所述FQF引物溶液含有序列為GTGAAACTCA TTTGGGTTGT AT的特有性引物，所述FQR引物溶液含有序列為CCGTTCGGAA ATCGTTAG的特有性引物。上述FQF、FQR引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)結(jié)束后，也可以進(jìn)行溶解曲線分析，再用Rotor-Gene的軟件進(jìn)行CT值分析，根據(jù)樣品目的基因與標(biāo)準(zhǔn)例的濃度梯度接近狀況，進(jìn)行樣品中腐敗希瓦氏菌的含量分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測(cè)方法，通過(guò)腐敗希瓦氏菌抗體溶液制備，再與磁珠制備成免疫磁珠，可以對(duì)含有腐敗希瓦氏菌的樣品進(jìn)行細(xì)菌富集，使得腐敗希瓦氏菌濃縮、純凈，然后進(jìn)行煮沸分解得到模板DNA溶液，與由含有熒光染料的TaqTW II混合液、FQR引物溶液和FQF引物溶液反應(yīng)體系中進(jìn)行 PCR反應(yīng)，根據(jù)PCR反應(yīng)中的熒光信號(hào)有無(wú)響應(yīng)，判斷待檢樣品溶液是否含有腐敗希瓦氏菌，該反應(yīng)是對(duì)腐敗希瓦氏菌特異性引物進(jìn)行的FQ-PCR熒光反應(yīng)，檢測(cè)簡(jiǎn)便，靈敏，定性檢測(cè)時(shí)間較低短，檢測(cè)效率高，因此本發(fā)明是一種檢測(cè)時(shí)間較低短、檢測(cè)效率和靈敏度較高的腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測(cè)方法。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。 實(shí)施例1、將濃度為IO9 cfu/mL的腐敗希瓦氏菌液0. 20mL注射于小鼠腹腔內(nèi)首次免疫， 間隔一周相同劑量的腐敗希瓦氏菌液加強(qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)免疫三次，每次加強(qiáng)免疫的腐敗希瓦氏菌液濃度為IO1tlCfu /mL，最后一次加強(qiáng)免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37°C溫育0. 5h，4°C下3000 r / min離心15min，得上清，即為腐敗希瓦氏菌抗體溶液；
2、免疫磁珠制備取48 mg Fe3O4磁株先后用乙醇和雙蒸水超聲清洗干凈，用二次水定容至20mL得磁珠溶液，取IOmL磁株溶液，加入質(zhì)量濃度為10%戊二醛溶液2mL，室溫下攪拌 3h,固液分離后用PBST溶液(由pH為7 7. 5的PBS緩沖液與吐溫20配制，其中吐溫20 的體積百分濃度為0. 03 0. 07%)清洗磁株，再將清洗后的磁株懸浮于2mL PBS緩沖液(pH 為7 7. 5，可以自配，也可以市售)中，然后加入50 μ L上述腐敗希瓦氏菌抗體溶液，4°C下輕輕攪拌12h，得到腐敗希瓦氏菌免疫磁珠溶液，4°C保存?zhèn)溆茫?br> 3、待測(cè)樣品富集在盛有0. ImL的上述腐敗希瓦氏菌免疫磁珠溶液中加入ImL待測(cè)樣品液，室溫輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩30min，將試管置于磁性細(xì)胞分離架上3min，移出管中液體，每次用1. OmL PBS緩沖液清洗免疫磁珠，重復(fù)清洗3 5次，清洗完畢，加入0. 5 ImL無(wú)菌水， 磁性分離，取出免疫磁珠后，得到富集的待檢樣品溶液；
4、模板DNA制備將上述待檢樣品溶液，在100°C溫度下煮沸l(wèi)Omin，12000r / min離心5min，取上清，得到模板DNA溶液；
5、PCR反應(yīng)取上述模板DNA溶液5μ L，加入到由含有熒光染料的Ti^TM II混合液 (SYBR Premix Ex TaqllA II) 10 μ L、引物濃度為10 μ M的FQF引物溶液0. 5 μ L、引物濃度為10 μ M的FQR引物溶液0. 5 μ L的反應(yīng)體系中，用無(wú)菌水無(wú)菌水定容至20 μ L，反應(yīng)程序 95°C預(yù)變性5min ；94°C變性5s、50°C退火15s、72°C延伸15s，共45個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)中若有熒光信號(hào)響應(yīng)，則待檢樣品溶液含有腐敗希瓦氏菌。PCR反應(yīng)結(jié)束后，也可以進(jìn)行溶解曲線分析，再用Rotor-Gene的軟件進(jìn)行CT值分析，分析出樣品目的基因與標(biāo)準(zhǔn)例的濃度梯度接近狀況。 標(biāo)準(zhǔn)例
標(biāo)準(zhǔn)溶解曲線及CT值建立腐敗希瓦氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC)標(biāo)準(zhǔn)菌株活化后，在100°C 溫度下煮沸l(wèi)Omin，12000 r / min離心5min，取上清，得到菌液模板DNA，DNA模板的菌液濃度分別為=S^XlO1-S. 2X IO8Cfu /μ L，用無(wú)菌水做10倍比稀釋，得到5.4X10° -5. 4X IO7 copies / u L 8個(gè)梯度的模板，并做陰性對(duì)照；按照下列反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增 菌液DNA模板或陰性對(duì)照5 μ L，與SYBR Premix Ex TaqllA II 10 μ L、引物濃度為10 μ M 的上述FQF引物溶液0. 5 μ L、引物濃度為10 μ M的上述FQR引物溶液0. 5 μ L的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，用無(wú)菌水無(wú)菌水定容至20 μ L，反應(yīng)程序95°C預(yù)變性5min ；94°C變性5s、 50°C退火15s、72°C延伸15s，共45個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)結(jié)束后，首先進(jìn)行溶解曲線分析，再用 Rotor-Gene的軟件進(jìn)行CT值分析，軟件可以分析出DNA模板的看家基因Ct(Comparative Delta-delta)法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以及基因的濃度相對(duì)于對(duì)照組的比值；其相關(guān)系數(shù)為 0. 989，斜率為-3. 32，截距為40. 29，從而可以得出菌株數(shù)與CT之間的線性關(guān)系表達(dá)式為 CT= -3. 32 X log (菌數(shù))+ 40.291。
權(quán)利要求
1.腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟1)、抗體制備將濃度為IO9CfuAiL的腐敗希瓦氏菌液0.20mL注射于小鼠腹腔內(nèi)首次免疫，間隔一周相同劑量的腐敗希瓦氏菌液加強(qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)免疫三次，每次加強(qiáng)免疫的腐敗希瓦氏菌液濃度為IOltlCfu /mL，最后一次加強(qiáng)免疫后第四天，摘除小鼠眼球取血，血液置于37°C下溫育0. 5h，4°C下3000 r / min離心15min，取上清，得到腐敗希瓦氏菌抗體溶液；2)、免疫磁珠制備取48mg的Fe3O4磁株先后用乙醇和雙蒸水超聲清洗干凈，用二次水定容至20mL得磁珠溶液，在IOmL磁株溶液中，加入質(zhì)量濃度為10%戊二醛溶液2mL，室溫下攪拌3h，固液分離后用磷酸吐溫緩沖液清洗磁株，所述磷酸吐溫緩沖液中由磷酸緩沖液與吐溫20配制而成，所述磷酸吐溫緩沖液中所述吐溫20的體積百分濃度為0. 03 0. 07%, 再將清洗后的磁株懸浮于2mL磷酸緩沖液中，所述磷酸緩沖液的pH為7 7. 5，然后加入 50 μ L上述腐敗希瓦氏菌抗體溶液，4°C下輕輕攪拌12h，得到腐敗希瓦氏菌免疫磁珠溶液， 4°C保存?zhèn)溆茫?)、待測(cè)樣品富集在盛有0.ImL的上述腐敗希瓦氏菌免疫磁珠溶液中加入ImL待測(cè)樣品液，室溫下輕緩旋轉(zhuǎn)振蕩30min，將試管置于磁性細(xì)胞分離架上3min，移出管中液體， 每次用1. OmL上述磷酸緩沖液清洗腐敗希瓦氏菌免疫磁珠，重復(fù)清洗3 5次，清洗完畢， 加入0.5 ImL無(wú)菌水，磁性分離，取出腐敗希瓦氏菌免疫磁珠后，得到富集的待檢樣品溶液；4)、模板DNA制備將上述待檢樣品溶液，在100°C溫度下煮沸l(wèi)Omin，12000r / min離心5min，取上清，得到模板DNA溶液；5)、PCR反應(yīng)取上述模板DNA溶液5μ L，加入到由含有熒光染料的TaqTW II混合液10 μ L、引物濃度為IOyM的FQF引物溶液0. 5yL、引物濃度為IOyM的FQR引物溶液 0. 5μ L的反應(yīng)體系中，用無(wú)菌水無(wú)菌水定容至20 μ L，反應(yīng)程序95°C預(yù)變性5min ；94°C變性5s、50°C退火15s、72°C延伸15s，共45個(gè)循環(huán)；PCR反應(yīng)中若有熒光信號(hào)響應(yīng)，待檢樣品溶液含有腐敗希瓦氏菌；所述FQF引物溶液含有序列為GTGAAACTCA TTTGGGTTGT AT的特有性引物，所述FQR引物溶液含有序列為CCGTTCGGAA ATCGTTAG的特有性引物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測(cè)方法，通過(guò)腐敗希瓦氏菌抗體溶液制備，再與磁珠制備成免疫磁珠，可以對(duì)含有腐敗希瓦氏菌的樣品進(jìn)行細(xì)菌富集，使得腐敗希瓦氏菌濃縮、純凈，然后進(jìn)行煮沸分解得到模板DNA溶液，與由含有熒光染料的TaqTMII混合液、FQR引物溶液和FQF引物溶液反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)PCR反應(yīng)中的熒光信號(hào)有無(wú)響應(yīng)，判斷待檢樣品溶液是否含有腐敗希瓦氏菌，該反應(yīng)是對(duì)腐敗希瓦氏菌特異性引物進(jìn)行的FQ-PCR熒光反應(yīng)，檢測(cè)簡(jiǎn)便，靈敏，定性檢測(cè)時(shí)間較低短，檢測(cè)效率高，因此本發(fā)明是一種檢測(cè)時(shí)間較低短、檢測(cè)效率和靈敏度較高的腐敗希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102382888SQ20111034928
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者周君, 應(yīng)琪, 張春丹, 李成華, 李曄, 蘇秀榕 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)