專利名稱：耐壓希瓦氏菌及其在抑藻上的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，尤其涉及一種海洋耐壓希瓦氏細菌及其在抑制赤潮藻生長中的應用。
背景技術(shù)：
赤潮是指在海洋中浮游生物(尤指藻類)在短時間內(nèi)爆發(fā)性增殖或高度聚集、弓丨起水色異常的生態(tài)現(xiàn)象(多呈紅色或褐色)，被稱之為“藻華”或喻為“紅色幽靈”。近海環(huán)境的日益污染和海洋資源的不合理開發(fā)，給生態(tài)環(huán)境帶來了巨大的承載壓力，導致局域赤潮的頻繁發(fā)生，造成海洋環(huán)境的生態(tài)災難。該生態(tài)災害造成了水源的污染、能源的消耗、以及水體中溶氧的降低，對生物的生存環(huán)境構(gòu)成嚴重威脅。部分赤潮生物還伴有毒素產(chǎn)生，直接毒殺水生生物，給海岸經(jīng)濟和養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。我國是一個赤潮多發(fā)國，且有害赤潮的發(fā)生呈逐年上升趨勢。據(jù)國家海洋局統(tǒng)計，從20世紀70年代以來，我國赤潮發(fā)生頻率以每10年3倍的速度增長，2000伊始，年均有超過30次左右的較大規(guī)模赤潮，2001年發(fā)生41起、2006年93起、2009年68起。據(jù)《2010年中國海洋災害公報》顯示，2010年中國沿海共發(fā)生赤潮69次，累計面積1.09萬平方公里，直接經(jīng)濟損失2.06億元?；诮陙沓喑睘暮Πl(fā)生次數(shù)日益增多、范圍日益擴大、危害日益加劇的趨勢，對赤潮(或赤潮藻)的發(fā)生進行有效防控是保護海洋環(huán)境的首要前提。以往的研究中雖已開發(fā)出一些赤潮的控制技術(shù)，如物理方法、化學方法和部分生物治理方法，但這些方法都各自存在一定的缺陷，治理水華的效果不甚理想。例如物理方法中的黃泥漿絮凝法需要較大的劑量才能起到抑制的效果，這在一定程度上增加了操作的難度和成本的投入；化學方法如殺藻劑，在殺滅藻類的同時，也給其他生物帶來了直接或間接的危害，不能體現(xiàn)環(huán)境友好型特性；生物學方法如投放攝食藻類的大型生物(魚類)，也存在打破食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)，破壞生物網(wǎng)穩(wěn)定的生態(tài)風險。`近年來人們越來越多的認識到，藻類的生消與共生微生物有著密不可分的關系，因此越來越多的將赤潮的防治方法轉(zhuǎn)向微生物治理，且這一類方法已日益得到關注和認可。在這一領域中已篩選和培養(yǎng)了多種殺藻、溶藻的微生物，包括放線菌、變形桿菌、假單胞菌、粘細菌等。共生微生物中存在的溶藻或抑藻個體，可以通過直接或間接的作用抑制藻類的生長。這一功能的行駛要依賴于一定的生物量，而細菌生物量的調(diào)控由群體感應信號(quorum sensing, QS)來調(diào)節(jié)。QS信號是細菌間存在獨特的語言通訊方式,這種信號可實現(xiàn)種內(nèi)傳遞(inter-transfer)和種間傳遞(intra-transfer)。在微生物之間，QS可引發(fā)微生物一系列的生理生化反映，表現(xiàn)出群體的感應行為。在藻菌共生系統(tǒng)中，溶藻細菌能在QS的調(diào)控下實現(xiàn)自身的快速繁殖，形成優(yōu)勢種群，在藻-菌共生系統(tǒng)中表現(xiàn)出競爭優(yōu)勢，對藻類生長產(chǎn)生抑制。溶藻細菌作為赤潮防治的潛在微生物，已引起越來越多的關注。以往的研究中對溶藻細菌的篩選是沒有嚴格區(qū)分赤潮發(fā)生期和非發(fā)生期，使得篩選的菌株缺乏針對性；另外，對溶藻細菌是否具有分泌群體感應信號的屬性研究也未曾涉及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一株耐壓希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans) 34#。本發(fā)明提供的耐壓希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans) 34#,其保藏號為CGMCCN0.6490。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述耐壓希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans) 34#的應用，其特征在于用于胞外產(chǎn)群體感應信號(QS)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，胞外產(chǎn)QS包括如下步驟:I)發(fā)酵耐壓希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans) 34#,離心收集上清液；2)用乙酸乙酯萃取所述上清液，收集有機相，即得到QS粗體物。上述方法中，步驟I)中，所述發(fā)酵的溫度為30°C，所述發(fā)酵的時間為48h ;所述離心的轉(zhuǎn)速為8000r/min,所述離心的時間為20min,所述離心半徑為13.5cm ；步驟2)中，所述上清液和乙酸乙酯萃取體積比為1: 2，所述萃取的時間為3h。上述方法中，所述發(fā)酵的溫度為30°C，所述發(fā)酵的時間為48小時，所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為2216E海水液體培養(yǎng)基(配方:蛋白胨5.0g，酵母膏1.(^，磷酸鐵0.018，陳海水IOOOmL,調(diào) pH 至 7.8)；上述方法中，在步 驟2)中，在所述收集有機相后還依次包括去除所述有機相中的乙酸乙酯和溶解的步驟；上述去除所述有機相中的乙酸乙酯具體為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所述有機相，收集產(chǎn)物I ;上述溶解具體為用甲醇溶解所述產(chǎn)物I ;在所述步驟I)和步驟2)之間還包括過濾所述上清液的步驟；上述過濾具體采用的濾膜孔徑為0.22 μ m。由上述方法制備的所述耐壓希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans) 34#CGMCCN0.6490胞外QS提取物也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明另一方面還涉及上述的耐壓希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans) 34#在防治赤潮中的應用。上述應用中，所述防治赤潮通過抑制赤潮藻生長實現(xiàn)。上述抑制赤潮藻生長體現(xiàn)在如下I) -4)中4種或者其中任意一種:I)降低赤潮藻密度；2)降低赤潮藻的葉綠素含量；3)降低赤潮藻的光合效率；4)改變赤潮藻藻際微生物的組成。上述應用為向赤潮藻的生長體系中加入上述的耐壓希瓦氏菌34#,以抑制赤潮藻生長；所述赤潮藻具體為亞歷山大藻(Alexandrium sp.)。在本發(fā)明的實施例中，具體抑制赤潮藻生長的方法為向赤潮藻的生長體系中加入上述的耐壓希瓦氏菌34#，以抑制赤潮藻生長。上述赤潮藻的生長體系為人工培育體系；上述人工培育體系為將赤潮藻在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到人工培育體系；上述人工培育體系中的培養(yǎng)液為f/2培養(yǎng)液；上述耐壓希瓦氏菌34#在所述人工培育體系中的終濃度具體為1.0X 104cells/ML-l.0X 106cells/ML。上述方法中，所述赤潮藻為亞歷山大藻(Alexandrium sp.)。本發(fā)明的第三個目的是提供一種赤潮藻抑制生物。本發(fā)明提供的赤潮藻抑制生物，分為上述的耐壓希瓦氏菌34#;所述赤潮藻具體為亞歷山大藻(Alexandrium sp.)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種耐壓希瓦氏菌(ShewanelIapiezotolerans.) 34#,該細菌具有產(chǎn)長鏈QS (13個碳鏈長度,分子量301)的能力；且菌自身具有抑藻 的功能，可以用來抑制赤潮；該細菌具有如下優(yōu)點:1)篩選的抑藻細菌來自赤潮發(fā)生的海域，利于重新投放到自然環(huán)境中使用；2)胞外產(chǎn)物證明了該菌產(chǎn)QS能力的存在，是一種環(huán)境適應性較強的菌；3)藻類抑制赤潮的方法，遵循了生物“生物相生相克”的原理，不會產(chǎn)生二次污染，是一種環(huán)境友好型方法。


圖1:不同劑量菌株濃對亞歷山大藻密度影響；其中，*表示差異顯著(P < 0.05)；**表示差異極顯著(P < 0.01)圖2:不同劑量菌濃對亞歷山大藻葉綠素含量的影響；其中，*表示差異顯著(P
<0.05) 表示差異極顯著(P < 0.01)。圖3:不同劑量菌濃對亞歷山大藻光合效率的影響；其中，*表示差異顯著(P
<0.05) 表示差異極顯著(P < 0.01)。微生物保藏信息上述耐壓希瓦氏菌34#菌株為細菌界(Bacteria);變形桿菌門(Proteobacteria) ; Y -變形桿菌綱(Gammaproteobacterium),交替單胞菌目(Alteromonadales),希瓦氏菌科(Shewanellaceae),希瓦氏菌屬(Shewanella)菌株，已于2012年9月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN0.6490,其分類命名為耐壓希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans)
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。f/2培養(yǎng)液具體配方如下(每升海水中含無機鹽質(zhì)量):NaN0337.5mg,NaH2P042.5mg，F(xiàn)e-EDTA2.5mg(FeCl3L 6g+EDTA0.9g)，鹽酸硫銨素 5yg，BiotinVH0.025 μ g, VB120.025 μ g, CuSO4.5Η200.00 98 μ g, ZnSO4.7Η200.022 μ g,CaCl2.6Η200.0lyg，MgCl2.4Η200.180 μ g, Na2MoO4.2Η20,0.0063 μ g。亞歷山大藻(Alexandrium catenella)(香港株，中國科學院海洋研究所提供,產(chǎn)品目錄號:Algae20060309)實施例1、耐壓氏菌(Shewanella piezotolerans) 34#的篩選、鑒定及特性一、耐壓氏菌(Shewanella piezotolerans) 34# 的篩選2011年4月21日，南中國海近岸(深圳蛇口港)發(fā)生局域赤潮(深圳蛇口港赤潮發(fā)生區(qū)表層)，此次赤潮的原因藻為彎角藻(Eucampia zoodiacus Ehrenberg),屬于娃藻門 BaciIIariophyceae,脆桿藻科 Fragilariaceae Schroder,海線藻屬 ThalassionemaGrunow。從該區(qū)域取回水樣,水樣帶回實驗室后經(jīng)紗布過濾,除掉水中雜質(zhì)和大型顆粒物；隨后經(jīng)100 y m金屬網(wǎng)格過濾，除掉水中碎屑；最后經(jīng)10 u m濾膜過濾除去藻細胞，濾液進行涂布和篩菌。將上述準備好的濾液進行倍比稀釋，取30 y L涂布于2216E海水固體培養(yǎng)基上(配方:蛋白胨5.0g，酵母膏1.(^，磷酸鐵0.01§，陳海水1000ml，瓊脂20g，調(diào)pH至7.8)，過夜培養(yǎng)，直至長出清晰的單克隆。共挑選出200株可培養(yǎng)細菌。隨后挑取單克隆在2216E液體培養(yǎng)基中(ImL)，搖床上30°C培養(yǎng)12小時，備用。將挑選的單克隆菌株以I X IO4個/mL的量加入亞歷山大藻培養(yǎng)液(將亞歷山大藻在f/2培養(yǎng)液中培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液)中作為實驗組，連續(xù)監(jiān)測兩周內(nèi)對藻類生長的抑制情況，以不加入單克隆菌株為對照組，在雙筒顯微鏡下計數(shù)(4X10倍)檢測藻密度，每個樣品計數(shù)3次，結(jié)果取平均值。實驗結(jié)果顯示，添加菌液2天后即能抑制藻類的生長，4天后實驗組的藻細胞密度下降為對照組的50%，至6天時，實驗組的藻類基本停止生長與分裂，80%以上的藻類生長被抑制，藻類生物量與對照組相比顯示極顯著差異(P < 0.01)。因此，認為初步篩選得到菌株34#。二、34#菌株的鑒定1、生理生化特征鑒定1.1形態(tài)觀察采用2216E固體培養(yǎng)基，將純化后的34#單克隆菌株于30°C下培養(yǎng)24h，并進行革蘭氏染色及菌體形態(tài)的顯微鏡觀察(油鏡，放大倍數(shù)1000倍)。染色方法參照《微生物學檢驗實驗指導》的方法進行 (作者:桂芳，出版社:中國醫(yī)藥科技出版社，出版時間:2009年8月，ISBN =9787506742238)。實驗結(jié)果表明菌株為革蘭氏陰性菌；形態(tài)為兩端鈍圓的棒狀菌，具鞭毛，菌體大小為(0.3 0.4) X (2.0 3.0) u m。1.2生理生化特征生理生化特征的檢測采用變形桿菌套裝生化鑒定管進行(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號:SHBG05)。實驗結(jié)果顯示硫化氫陽性，苯丙氨酸脫氫酶陰性，脲酶陽性。2、分子鑒定提取菌株34#的DNA，利用細菌16SrRNA通用引物(正向引物:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ;反向引物:CTGAGCCAGGATCAAACTCT) PCR 擴增出 PCR 產(chǎn)物即為16S-rRNA的編碼基因，將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，將得到條帶大小為1500bp的產(chǎn)物送去測序，結(jié)果該PCR產(chǎn)物(16S-rRNA的編碼基因)具有序列表中序列I所示的核苷酸。經(jīng)序列比對后證明，菌株34#的16S_rRNA的編碼基因與變形桿菌門(Proteobacteria)，Y -變形桿菌綱(Gammaproteobacterium),交替單胞菌目(Alteromonadales),希瓦氏菌科(Shewanellaceae),希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)的16S-rRNA的編碼基因有99%的相似性(GenBank:AJ551090)。因此上述菌株34#為變形桿菌門(Proteobacteria), Y _變形桿菌綱(Gammaproteobacterium),交替單胞菌目(Alteromonadales)，希瓦氏菌科(Shewanellaceae),希瓦氏菌屬(Shewanella sp.)菌株，已于2012年4月I日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路
I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN0.6490，其分類命名為希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans)。實施例2:耐壓瓦氏菌(Shewanella piezotolerans) 34#產(chǎn)QS能力的檢測I 希瓦氏菌的制備。將鑒定的34#菌株在1.5毫升的eppendof管中的培養(yǎng)6-8小時，eppendof管裝液量為0.5毫升，培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，似(:11(^，調(diào)？11至7.0。用去離子水定容至1L。在15psi高壓下蒸汽滅菌20min)。培養(yǎng)好的希瓦氏菌液經(jīng)可見光分光光度計檢測其濃度，其濃度值大約為0D_=0.35。該制備的菌液置于4°C冰箱備用。2.檢測菌株的制備及檢測。用特異性檢測QS的報告菌株CV026和A136對34#菌株所產(chǎn)的QS進行檢測，其中CV026報告菌株適用于檢測短鏈QS (4-6個碳鏈)，A136適用于檢測長鏈QS (6-14碳鏈)。短鏈QS的檢測方法如下:先將CV026菌株加入LB半固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，似(:11(^，瓊脂0.5克，調(diào)？11至7.0。用去離子水定容至1L)制成終濃度為I X IO6個/ML的平板；隨后將直徑為4毫米的白色濾紙片置于平板上；最后在濾紙片上點上34#菌株(點樣量為2ul)，于30°C培養(yǎng)12小時以上，根據(jù)濾紙片上有無紫色色圈存在判斷34#菌株是否具有短鏈QS生產(chǎn)能力。有紫色色圈表示有短鏈QS生產(chǎn)能力，無紫色色圈則表示不具有短鏈QS生產(chǎn)能力。從本次發(fā)明專利的結(jié)果來看，結(jié)果均為陰性，未見顯色反應，因此初步斷定34#菌株不具有短鏈QS的生產(chǎn)能力。長鏈QS的檢測方法如下:先將A136菌株加入LB半固體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg,瓊脂0.5克，調(diào)pH至7.0。用去離子水定容至1L)制成終濃度為IX IO6個/ML的平板；隨后將直徑為4毫米的白色濾紙片置于平板上；再將2ul20mg/ml的X_gal點加到濾紙片上；最后在濾紙片上點上34#菌株(點樣量為2ul)，于30°C培養(yǎng)12小時以上，根據(jù)濾紙片上有無藍色色圈存在判斷34#菌株是否具有長鏈QS生產(chǎn)能力。有藍色色圈表示有 長鏈QS生產(chǎn)能力，無藍色色圈則表示不具有長鏈QS生產(chǎn)能力。根據(jù)實驗結(jié)果來看，結(jié)果顯示陽性，呈現(xiàn)顯色反應，因此斷定34#菌株具有長鏈QS的生產(chǎn)能力。實施例3、耐壓希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans) 34#在抑藻中的應用一、耐壓希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans) 34# 抑藻的方法1、耐壓希瓦氏菌(Shewanella piezotolerans) 34#的高密度培養(yǎng)將由實施例1得到的耐壓希瓦氏菌34#在IOmL三角瓶中進行一級培養(yǎng)(2216E液體培養(yǎng)基，配方:蛋白胨5.0g，酵母膏1.(^，磷酸鐵0.01§，陳海水IOOOmL,調(diào)ph至7.8)，培養(yǎng)條件為30°C，轉(zhuǎn)速200r/min，時間6h，待菌株密度接近OD6tltl = 0.5時，轉(zhuǎn)入IOOmL三角瓶中進行二級培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)18小時，至菌株密度達到I X IO9個/ML濃度，備用。2、實驗用藻細胞的培養(yǎng)實驗所用藻種為亞歷山大藻(Alexandrium catenella)(香港株)。取實驗室傳代培養(yǎng)的藻種(初始密度為0.2X104個/mL)，分裝于15個300mL的三角瓶中(每瓶裝液IOOmL)，分裝后培養(yǎng)連續(xù)監(jiān)測，待藻處于對數(shù)生長期前期時，即藻密度在0.4X IO4個/mL(藻在藻培養(yǎng)液中的密度)時，進行如下分組試驗，試驗設五個實驗組，每組3個平行。藻的培養(yǎng)條件如下:溫度為21±1°C，光照時間L: D = 12h: 12h，光照強度3000Lxo五個實驗組分別如下:空白組(不含34#菌液、不含用于菌株培養(yǎng)的培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)；對照組(含菌株培養(yǎng)基，不含34#菌液)，培養(yǎng)液的終濃度為0.05 % (v/v)，繼續(xù)培養(yǎng);菌密度1.0X IO4個/ML組:向三角瓶中加由上述I得到的細菌培養(yǎng)液，使細菌密度的終濃度為1.0X IO4個/ML，繼續(xù)培養(yǎng)；菌密度1.0X IO5個/ML組:向三角瓶中加由上述I得到的細菌培養(yǎng)液，使細菌密度的終濃度為1.0X IO5個/ML，繼續(xù)培養(yǎng)；菌密度1.0X IO6個/ML組:向三角瓶中加由上述I得到的細菌培養(yǎng)液，使細菌密度的終濃度為1.0X IO6個/ML，繼續(xù)培養(yǎng)。將上述各組加入各種物質(zhì)，記作繼續(xù)培養(yǎng)的第0天。二、檢測1、細菌的添加對藻的抑制效果將上述5組培養(yǎng)產(chǎn)物在雙筒顯微鏡下(4X 10倍)進行藻細胞計數(shù)，每個樣品計數(shù)3次，結(jié)果取平均值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 空白組和對照組中，藻細胞均勻分布，藻培養(yǎng)液較為清亮、呈淺黃色；而當有高濃度34#菌株加入，至培養(yǎng)到46天時，藻細胞培養(yǎng)液開始呈現(xiàn)混濁狀、部分藻細胞溶解、沉底。圖1為不同劑量細菌對藻密度影響的效果曲線，可以看出，空白組在0、2、4、6、8、10、12、14 天的藻密度(個/mL)分別為 4000、4066、4200、4534,5734,8000,10000 和 10256。對照組在0、2、4、6、8、10、12、14 天的藻密度(個/mL)分別為 4066、4100、4134、4466、5534、7333、9000 和 8520。菌密度1.0父104個/]^組在0、2、4、6、8、10、12、14天的藻密度(個/mL)分別為4033、4106、4200、4533、4800、5933、6400 和 6314。菌密度1.0父105個/]^組在0、2、4、6、8、10、12、14天的藻密度(個/mL)分別為4133、4134、3600、2800、2000、1666、1002 和 762。菌密度1.0父106個/^1^組在0、2、4、6、8、10、12、14天的藻密度(個/mL)分別為4166、3466、2000、800、668、668、586、370?？梢钥闯?，從0天顯微鏡檢開始,希瓦氏菌(Shewanella sp.) 34#對藻細胞的殺滅作用呈現(xiàn)劑量關系，隨著濃度的提高殺滅效果更顯著，第六天殺滅率達80%以上，抑藻效果達到峰值。2、希瓦氏菌(Shewanella sp.)對亞歷山大藻葉綠素和光合效率的影響檢測上述5組繼續(xù)培養(yǎng)的藻的葉綠素、光合效率，具體方法如下:各組赤潮藻的葉綠素和光合效率測量采用浮游植物分類熒光儀(PHYT0-PAM)進行，具體操作如下，取3mL藻液(連續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)產(chǎn)物)裝入測量杯置于暗盒內(nèi)，對藻體進行20min暗適應，打開Phyto-PAM調(diào)制脈沖熒光儀波長為520nm強度為0.1 u mol/(m2 s)的綠色檢測光。測量過程由Phytowin軟件控制，開啟測量光(ML)，待光信號穩(wěn)定后打開飽和脈沖鍵，記下Fv/Fm值，即為光合效率yield值。葉綠素水平的(ChI)測定也使用該儀器進行。結(jié)果如圖2和圖3所示，其中，圖2為34#菌株對亞歷山大藻葉綠素含量的影響，圖3為34#菌株對亞歷山大藻光合效率的影響；從圖2中可以看出，空白組在0、2、4、6、8、10、12、14天的葉綠素含量(U g/L)分別為15.21,18.78,28.14,34.64,34.07,38.92,36.50,37.20。對照組在0、2、4、6、8、10、12、14天的葉綠素含量(u g/L)分別為16.57,19.42,27.64,34.14,35.50,39.35,38.90,37.60。菌密度1.0X IO4個/ML組在O、2、4、6、8、10、12、14天的葉綠素含量(U g/L)分別為 15.85,19.07,27.50,34.57,34.35,38.00,36.50,37.19。菌密度1.0X IO5個/ML組在O、2、4、6、8、10、12、14天的葉綠素含量(U g/L)分別為 15.64,16.71,12.00,10.92,11.35,11.28,9.50,7.21。菌密度1.0父106個/^1^組在0、2、4、6、8、10、12、14天葉綠素含量(U g/L)分別為16.42,15.78,8.07,7.57,7.42,7.0,5.60,4.11?？梢钥闯?，高劑 量菌濃(菌密度1.0X IO6個/ML組)相比于對照組，從第4天開始，其葉綠素水平明顯低于對照組，其值只有對照組的15.533.6% (P < 0.05)。從圖3中可以看出，空白組在0、2、4、6、8、10、12、14天的光合效率(Fv/Fm)分別為0.45,0.47,0.46,0.57,0.60,0.61,0.63,0.62。對照組在0、2、4、6、8、10、12、14 天的光合效率(Fv/Fm)分別為 0.46、0.48、0.47、0.56、0.63、0.64、0.64、0.65。菌密度1.0父104個/^1^組在0、2、4、6、8、10、12、14天的光合效率(Fv/Fm)分別為0.45、0.46、0.50、0.58、0.63、0.64、0.58、0.60。菌密度1.0父105個/^1^組在0、2、4、6、8、10、12、14天的光合效率(Fv/Fm)分別為0.47,0.47,0.48,0.35,0.35,0.38,0.34,0.34。菌密度1.0\106個/^1組在0、2、4、6、8、10、12、14天光合效率(Fv/Fm)分別為0.46、0.40、0.40、0.30、0.31、0.31、0.29、0.30。可以看出，外源添加高劑量的細菌(IO6個/ML)，藻細胞光合效率水平較低，而對照組則有一個明顯的上升過程。這表明，細菌的存在，給藻的生理帶來了應激壓力，藻類自身的能量被用于應對環(huán)境脅迫，從而降低了其對光能捕獲的能力。
權(quán)利要求
1.耐壓希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)34#,其保藏號為 CGMCC N0.6490。
2.權(quán)利要求1所述耐壓希瓦氏菌34#在制備QS中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其中制備QS的方法包括如下步驟: 1)發(fā)酵耐壓希瓦氏菌34#，離心收集上清液； 2)用乙酸乙酯萃取所述上清液，收集有機相，即得到QS提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于: 步驟I)中，所述發(fā)酵的溫度為30°C，所述發(fā)酵的時間為48h;所述離心的轉(zhuǎn)速為8000r/min,所述離心的時間為20min,所述離心半徑為13.5cm ； 步驟2)中，所述上清液和乙酸乙酯萃取體積比為1: 2，所述萃取的時間為3h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應用，其特征在于: 在步驟2)中，在所述收集有機相后還依次包括去除所述有機相中的乙酸乙酯和溶解的步驟； 在所述步驟1)和步驟2)之間還包括過濾所述上清液的步驟。
6.由權(quán)利要求3-5任意一項所述的方法所制備的QS提取物。
7.權(quán)利要求1所述的耐壓希瓦氏菌34#在防治赤潮中的應用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于:所述防治赤潮通過抑制赤潮藻增殖實現(xiàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應用，其特征在于:所述抑制赤潮藻生長體現(xiàn)在如下I)-4)中4種或者其中任意一種: 1)降低赤潮藻密度； 2)降低赤潮藻的葉綠素含量； 3)降低赤潮藻的光合效率； 4)改變赤潮藻藻際微生物的組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的應用，其特征在于:所述應用為向赤潮藻的生長體系中加入權(quán)利要求1所述的耐壓希瓦氏菌34#，以抑制赤潮藻生長；優(yōu)選的，所述赤潮藻包含或者大部分為亞歷山大藻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐壓希瓦氏菌及其在抑制赤潮藻生長中的應用。本發(fā)明提供的耐壓希瓦氏菌(Shewanellapiezotolerans)34#，其保藏號為CGMCC NO.6490，該細菌具有產(chǎn)長鏈QS的能力，并具有抑藻的功能。本發(fā)明提供的方法對赤潮原因藻有很好的抑制效果，可用于赤潮生物的有效防治，實現(xiàn)“以菌治藻”的生物相克防控理念，具有野外推廣的價值。
文檔編號C12R1/01GK103173383SQ20121059627
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者周進, 銀鵬 申請人:清華大學深圳研究生院