一種從次等紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從次等紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，從新鮮次等紫菜中先提取藻紅蛋白，再從提取了藻紅蛋白的殘?jiān)刑崛∽喜肆蛩岫嗵牵淮翁崛∵^程中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖。本發(fā)明可在一次提取中獲得藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖，得到的藻紅蛋白純度高，紫菜硫酸多糖均一性好。本發(fā)明操作簡便，工藝簡單，分離速度快，成本低，提高了次等紫菜的利用效率，實(shí)現(xiàn)了資源的重復(fù)使用和多次利用。
【專利說明】-種從次等紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖的方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明藻類功能物質(zhì)的提取與分離，具體涉及一種從紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和 紫菜硫酸多糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 紫菜是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大型海藻，目前有幾個(gè)種廣泛栽培于東南亞沿海 各國。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2006年紫菜年產(chǎn)量約1. 8 X 104噸干品，年產(chǎn)值估計(jì)約13億美元（FA0, 2006)。 我國紫菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，從分布區(qū)域來看，長江W南W壇紫菜為主，主要集中在福建省和廣 東?。婚L江W北W條斑紫菜為主，主要集中在江蘇省和山東省。其中江蘇省全省紫菜栽培 面積約33萬畝，從業(yè)人員8萬左右，在南通、鹽城和連云港海區(qū)形成了我國條斑紫菜的主產(chǎn) 區(qū)，年產(chǎn)量40億枚標(biāo)準(zhǔn)制品，行業(yè)總產(chǎn)值20億元左右。生產(chǎn)的紫菜在當(dāng)?shù)匾淮魏投渭庸?后形成產(chǎn)品，銷往世界各地，成為我國出口創(chuàng)匯的重要組成部分。
[0003] 在條斑紫菜生產(chǎn)中，次等紫菜因膠含量高、蛋白含量低的原因，導(dǎo)致一次加工產(chǎn)品 質(zhì)量偏低，二次加工產(chǎn)品口感不好，因而價(jià)格偏低，進(jìn)而影響企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。該些次等紫菜 常常和加工過程中產(chǎn)生的廢棄紫菜一起作為垃圾處理，不僅浪費(fèi)了資源，又增加了環(huán)境負(fù) 擔(dān)。因此，該些次等紫菜的高值化加工及其高附加值物質(zhì)的提取已經(jīng)成為紫菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù) 發(fā)展的關(guān)鍵。
[0004] 藻膽蛋白是一種水溶性色素蛋白，具有獨(dú)特的吸收光譜和英光發(fā)射光譜，它的存 在補(bǔ)充了葉綠素的光吸收范圍，拓寬了藻類對(duì)可見光的吸收，更有利于對(duì)水生環(huán)境的適應(yīng)。 條斑紫菜藻紅蛋白為I型R-藻紅蛋白，由于其獨(dú)特的光譜特性、穩(wěn)定性W及較高的吸收系 數(shù)和量子產(chǎn)額，藻膽蛋白可被用作生化研究的英光探針而運(yùn)用于細(xì)胞和生物大分子的標(biāo) 記，也可被用作腫瘤治療的光敏劑，甚至有報(bào)道稱其具有免疫調(diào)節(jié)的作用。此外，藻膽蛋白 還可作為天然色素用于食品、化妝品的添加，避免了化學(xué)合成色素可能帶來的毒性危害。
[0005] 紫菜多糖是其細(xì)胞主要組分之一，具有抗凝血、降血脂、抗衰老及免疫調(diào)節(jié)等作 用。有報(bào)道顯示紫菜多糖能夠通過降低小鼠MDA水平，直接清除體內(nèi)自由基而提高其抗氧 化能力。因而紫菜多糖是一種比較理想的可被開發(fā)成抗衰老食品和藥品的重要組分。多糖 分子中存在大量輕基或駿基等極性基團(tuán)，可W與水分子形成氨鍵，表現(xiàn)出良好的吸濕和保 濕性能，所W在醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。從條斑紫菜中可分離到 具有激活巨瞻細(xì)胞、增強(qiáng)免疫功能的多糖組分。
[0006] 人們于是想到利用紫菜同時(shí)提取藻膽蛋白和紫菜多糖，為此做了大量研究。
[0007] 肖海芳等探索了脈沖超聲波同時(shí)提取紫菜中蛋白和多糖的工藝（脈沖超聲波同 時(shí)提取紫菜中蛋白和多糖的工藝研究，食品科學(xué)，2007, Vol. 28, No. 06)，朱曉君等探索了用 超聲方式同時(shí)提取紫菜多糖和藻膽蛋白的工藝（超聲輔助同時(shí)提取條斑紫菜多糖及藻膽 蛋白工藝的優(yōu)化，食品科學(xué)，2008, Vol. 29, No. 05)。中國專利CN200810018871. 0公開了一 種條斑紫菜多糖和蛋白同步超聲波輔助提取方法。但該些提取工藝都是利用紫菜干粉，得 到的藻膽蛋白光譜活性很低，且多糖在提取過程中不可避免地會(huì)受到蛋白等其他分子的污 染，成分復(fù)雜。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)從次等紫菜中提取藻紅蛋白及紫菜硫酸多糖的 方法，得到的藻紅蛋白純度高、多糖受污染小，提取工藝簡單，提高次等紫菜資源利用率，提 高紫菜產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[0010] 一種從次等紫菜中同時(shí)分離提取藻紅蛋白和硫酸多糖的方法，從新鮮次等紫菜中 先提取藻紅蛋白，再從提取了藻紅蛋白的殘?jiān)刑崛∽喜肆蛩岫嗵?，一次提取過程中同時(shí) 提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖。
[0011] 其中，具體步驟如下：
[001引 A.藻紅蛋白提取
[0013] (1)將新鮮次等紫菜切碎，放入1 %磯酸鹽緩沖液使其細(xì)胞溶脹破裂；
[0014] 似離也，收集上清液，得到藻紅蛋白粗提液，加入固體硫酸饋至終濃度為0. 5M ;
[0015] (3)將藻紅蛋白粗提液粟入化en^-s巧harose柱，清洗去除雜蛋白；
[0016] (4)依次用硫酸饋溶液、蒸觸水從化enyl-Sepharose柱洗脫藻紅蛋白；
[0017] (5)將步驟（4)中所得的洗脫液分別加入DEAE-Se地arose離子交換柱，先依次用 50mM、lOOmM磯酸鹽緩沖液、lOmM醋酸軸、4mM醋酸洗柱，然后用含化C1的磯酸鹽緩沖液洗 脫，即得純化的藻紅蛋白；
[0018] B.從殘?jiān)刑崛∽喜肆蛩岫嗵?br> [001引 （1)利用提取藻紅蛋白后剩余的殘?jiān)?，?0倍體積1%磯酸鹽緩沖液、P冊(cè).0酸度 下，控制溫度在110?12rc，提取1小時(shí)，紗布過濾；向?yàn)V渣中加入5倍體積的1 %磯酸鹽 緩沖液，重復(fù)上述操作，再次進(jìn)行提取、過濾；然后合并兩次濾液，得到多糖粗提液；將多糖 粗提液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮；
[0020] 似向濃縮后的多糖粗提液中加入己醇，收集沉淀，冷凍干燥，得到紫菜硫酸多糖 干粉。
[002。 其中，步驟A(l)中1%磯酸鹽緩沖液的抑=6. 0。
[002引其中，步驟A(2)中的離也是在轉(zhuǎn)速為9000?llOOOg、溫度為5?1(TC條件下離 也10分鐘。
[002引其中，步驟A(4)是依次用0. 20、0. 10、0. 05M硫酸饋溶液、蒸觸水W 3?5ml/min 的速度從化en^-S巧harose柱洗脫藻紅蛋白。
[0024] 其中，步驟A(5)中所述的用含化C1的磯酸鹽緩沖液洗脫，是依次用含0. 15M化C1 的50mM磯酸鹽緩沖液、含0. 20M化C1的50mM磯酸鹽緩沖液、含0. 2M化C1的lOOmM磯酸 鹽緩沖液洗脫。
[00巧]其中，步驟B(2)是加入4倍體積的己醇進(jìn)行沉淀。
[0026]本發(fā)明將紫菜藻體粉碎，水溶性物質(zhì)在一定濃度鹽離子條件下用 Phen^-Se地arose膨化柱提取，即可得藻紅蛋白制品，再用DEAE-Se地arose離子交換柱 對(duì)藻紅蛋白進(jìn)行純化，可得藻紅蛋白純品，然后將提取藻紅蛋白剩余的殘?jiān)糜谧喜肆蛩?多糖的提取。純化后藻紅蛋白光譜純度大于3. 2,產(chǎn)率為0. 66mg/g ;所得硫酸多糖產(chǎn)率為 32. 9mg/g〇
[0027] 本發(fā)明先純化活性藻紅蛋白，再提取硫酸多糖，達(dá)到了綜合利用生物質(zhì)的目的，同 時(shí)，由于藻膽蛋白的提取，降低了硫酸多糖提取時(shí)蛋白的污染和淀粉等糖類的污染。因此， 本方法不僅可W得到光譜純度高于3. 2的試劑級(jí)藻紅蛋白，而且可同時(shí)得到均一性較好的 硫酸多糖。
[0028] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0029] 1.操作過程簡單。提取原料僅需切碎，凍融，過濾，即得粗提液。藻膽蛋白分離前 不需進(jìn)行預(yù)處理。
[0030] 2.本發(fā)明用蛋白提取后的殘?jiān)M(jìn)行多糖提取，一方面達(dá)到了充分利用資源的目 的，另一方面經(jīng)過蛋白提取后，減少了多糖提取時(shí)的蛋白污染，一舉兩得。
[0031] 3.藻膽蛋白分離速度快，一個(gè)完整的分離過程僅需要3. 5小時(shí)，包括柱的平衡所 需之30分鐘，上樣60分鐘，清洗50分鐘，洗脫60分鐘。
[0032] 4.本發(fā)明提出了一種簡便高效的紫菜綜合利用的方法，純化后的藻紅蛋白光譜純 度大于3. 2,產(chǎn)率為0. 66mg/g，硫酸多糖得率為32. 9mg/g，多糖均一性好，通過本發(fā)明可大 大提高紫菜的利用率。
[0033] 本發(fā)明利用次等紫菜同時(shí)提取藻膽蛋白和紫菜硫酸多糖，具有所得藻紅蛋白光譜 純度高，紫菜硫酸多糖受污染小的優(yōu)點(diǎn)。操作簡便，工藝簡單，分離速度快，成本低，提高了 次等紫菜的利用效率，實(shí)現(xiàn)了資源的重復(fù)使用和多次利用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1為條斑紫菜粗提液在250-800nm的吸收光譜。
[0035] 圖2A為0. 2M硫酸饋溶液從化en廠Se地arose膨化柱洗提的藻紅蛋白在 250-800nm的吸收光譜。
[0036] 圖2B為0. 1M硫酸饋溶液從化en廠Se地arose膨化柱洗提的藻紅蛋白在 250-800nm的吸收光譜。
[0037] 圖2C為0. 05M硫酸饋溶液從化en廠Se地arose膨化柱洗提的藻紅蛋白在 250-800nm的吸收光譜。
[0038] 圖2D為蒸觸水從化en廠Se地arose膨化柱洗提的藻紅蛋白在250-800皿的吸收 光譜。
[0039] 圖3A為藻紅蛋白經(jīng)離子交換柱純化后在250-800nm的吸收光譜。
[0040] 圖3B為離子交換樹脂純化后藻紅蛋白英光發(fā)射光譜。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，該些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，該些等價(jià)形式同樣落于本發(fā)明所限定的范圍。
[0042] 實(shí)施例1，藻紅蛋白的提取及純化方法
[0043] 1.稱取lOOg濕重新鮮次等紫菜切碎后，加入10倍于藻體重量的1 %磯酸鹽緩沖 液，4°C過夜，使細(xì)胞溶脹。
[0044] 2.在轉(zhuǎn)速為9000g、溫度為5?1(TC條件下離也10分鐘，收集全部上清液，得到藻 紅蛋白粗提液340ml。收集所有殘?jiān)湃?2(TC冰箱中保存，W備進(jìn)行硫酸多糖的提取。
[0045] 測定藻紅蛋白粗提液的0D值，然后按照公式R-PE = 155. 80D498. 5-40. 00D614-1 0. 50D651，計(jì)算得粗提液中含53. 4mg藻紅蛋白，產(chǎn)率為5. 34mg/g。
[0046] 圖1為條斑紫菜藻紅蛋白粗提液在250-800nm的吸收光譜。
[0047] 3.化en廠Se地arose膨化柱提取。首先用0. 5M硫酸饋溶液平衡化en廠Se地arose 膨化柱。在室溫下，在藻紅蛋白粗提液加入固體硫酸饋至終濃度為0. 5M，W 15ml/min的速 度從下向上粟入膨化柱，藻膽蛋白被吸附劑捕獲。再用0. 5M硫酸饋溶液沖洗柱子，將雜質(zhì) 和細(xì)胞殘片沖洗干凈，直至流出液沒有顏色。
[004引 4.依次用0. 20、0. 10、0. 05M硫酸饋溶液和蒸觸水W 15ml/min的速度從上向下洗 提藻紅蛋白。收集全部洗提液，透析后測量其體積、測定250-800nm的吸收光譜。
[0049] 圖2A為0. 2M硫酸饋溶液從化en廠Se地arose膨化柱洗提的藻紅蛋白在 250-800nm的吸收光譜。
[0050] 圖2B為0. 1M硫酸饋溶液從化en廠Se地arose膨化柱洗提的藻紅蛋白在 250-800nm的吸收光譜。
[0051 ] 圖2C為0. 05M硫酸饋溶液從化eny-Se地arose膨化柱洗提的藻紅蛋白在 250-800nm的吸收光譜。
[0052] 圖2D為蒸觸水從化en廠Se地arose膨化柱洗提的藻紅蛋白在250-800皿的吸收 光譜。
[0053] 0. 20,0. 10,0. 05M硫酸饋溶液從膨化柱洗脫樣品的純度和含量見表1。總蛋白含 量為 91. 2mg，產(chǎn)率為 0. 912mg/g。
[0054] 表1不同硫酸饋濃度洗脫的藻紅蛋白得率及純度
[00 巧]

【權(quán)利要求】
1. 一種從次等紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特征在于，從新鮮 次等紫菜中先提取藻紅蛋白，再從提取了藻紅蛋白的殘?jiān)刑崛∽喜肆蛩岫嗵牵淮翁崛?過程中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖。
2. 按權(quán)利要求1所述的從次等紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特 征在于，具體步驟如下： A. 藻紅蛋白提取 (1) 將新鮮次等紫菜切碎，放入1 %磷酸鹽緩沖液使其細(xì)胞溶脹破裂； (2) 離心，收集上清液，得到藻紅蛋白粗提液，加入固體硫酸銨至終濃度為0. 5M ; (3) 將藻紅蛋白粗提液泵入Phenyl-Sepharose柱，清洗去除雜蛋白； (4) 依次用硫酸銨溶液、蒸饋水從Phenyl-Sepharose柱洗脫藻紅蛋白； (5) 將步驟⑷中所得的洗脫液分別加入DEAE-Sepharose離子交換柱，先分別用 50mM、100mM磷酸鹽緩沖液、10mM醋酸鈉、4mM醋酸洗柱，然后用含NaCl的磷酸鹽緩沖液洗 脫，即得純化的藻紅蛋白； B. 從殘?jiān)刑崛∽喜肆蛩岫嗵? (1) 利用提取藻紅蛋白后剩余的殘?jiān)?，?0倍體積1 %磷酸鹽緩沖液、PH6. 0酸度下， 控制溫度在110?121°C，提取1小時(shí)，紗布過濾；向?yàn)V渣中加入5倍體積的1 %磷酸鹽緩沖 液，重復(fù)上述操作，再次進(jìn)行提取、過濾；然后合并兩次濾液，得到多糖粗提液；將多糖粗提 液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮； (2) 向濃縮后的多糖粗提液中加入乙醇，收集沉淀，冷凍干燥，得到紫菜硫酸多糖干粉。
3. 按權(quán)利要求2所述的一種從紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特 征在于，步驟A(2)中的離心是在轉(zhuǎn)速為9000?llOOOg、溫度為5?10°C條件下離心10分 鐘。
4. 按權(quán)利要求2所述的一種從紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特 征在于，步驟A(4)是依次用0? 20、0. 10、0. 05M硫酸銨溶液、蒸餾水以3?5ml/min的速度 從Phenyl-Sepharose柱洗脫藻紅蛋白。
5. 按權(quán)利要求2所述的從紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特征在 于，步驟八(5)中所述的用含似(：1的磷酸鹽緩沖液洗脫，是依次用含0.1511似(：1的5〇1111磷 酸鹽緩沖液、含〇. 20M NaCl的50mM磷酸鹽緩沖液、含0. 2M NaCl的lOOmM磷酸鹽緩沖液洗 脫。
6. 按權(quán)利要求2所述的一種從紫菜中同時(shí)提取藻紅蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特 征在于，步驟B(2)是加入4倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK104447967SQ201410697186
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】王廣策, 牛建峰, 馮建華, 何林文 申請(qǐng)人:南通中國科學(xué)院海洋研究所海洋科學(xué)與技術(shù)研究發(fā)展中心, 中國科學(xué)院海洋研究所