專利名稱：一種hTAZ 融合基因及構(gòu)建的慢病毒和促成骨的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于MSC誘導(dǎo)分化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種hTAZ融合基因及構(gòu)建的慢病毒和促成骨的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前骨質(zhì)疏松癥的研究，多是針對(duì)增強(qiáng)的破骨細(xì)胞骨吸收作用給予骨吸收抑制劑 (雌激素、孕激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦類藥物、降鈣素等)，輔助以促進(jìn)成骨的礦化劑(鈣劑，活性維生素D等)。雖然雌激素補(bǔ)充替代(estrogen replacement therapy, ERT)對(duì)增加絕經(jīng)后骨量(bone mineral density, BMD)效果明顯，也能減少骨質(zhì)疏松癥患者骨折的發(fā)生率，但是其也增加了患者罹患乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率，更因其可以對(duì)血脂代謝產(chǎn)生影響，增加了患者心肌梗塞、中風(fēng)、深靜脈血栓，肺栓塞的發(fā)生率。雙膦類 (bisphosphonates, BP)藥物被破骨細(xì)胞吸收后干擾破骨細(xì)胞的多個(gè)生化過程，抑制骨吸收，可以增加骨量，降低脆性骨折的發(fā)生率。但其也存在著誘發(fā)視力模糊，食道、胃潰瘍，腎功能不全，血栓栓塞等并發(fā)癥的危險(xiǎn)。維生素D可以促進(jìn)腸道、腎臟鈣的吸收，但單獨(dú)使用效果不理想。單純補(bǔ)鈣效果也不明顯，骨密度(BMD)僅能增加1. 13% 2. 05%，而且一旦停藥效果不能持續(xù)，且效果與劑量間關(guān)系不大。最新的研究表明，骨質(zhì)疏松癥所引起的成骨活性減低，骨量減少常常伴發(fā)有骨髓中成脂活性增加，脂肪組織集聚。骨髓中成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞的共同祖細(xì)胞-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)成脂分化增強(qiáng)，成骨分化減弱是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的另一種主要機(jī)制。骨髓MSC的分化同時(shí)受到成骨分化因子-Rimt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)和成脂分化基因_過氧化物61±曾殖體激 舌受體(peroxisome proIiferator-actiν ated receptors, PPAR)調(diào)控?，F(xiàn)有的研究表明，Runx2在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)等上游分子的作用下促進(jìn)下游Osterix等分子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MSC分化為成骨細(xì)胞。 而 PPAR 和 CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein, C/EBP)等分子在其它調(diào)節(jié)因子的作用下促進(jìn)脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein, aP2)等下游基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MSC成脂分化。組蛋白去乙?；?sirtuin typel, SIRT1)被激活后能抑制PPARy的生成， 抑制 MSC 成月旨分化(Wang H, Qiang L, Farmer SR. Identification of a domain within peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulating expression of a group of genes containing fibroblast growth factor 21that are selectively repressed by SIRTl in adipocytes. Mol Cell Biol. 2008 ；28(1) : 188-200)。龐婷婷等提出可將SIRTl作為切入點(diǎn)，利用高表達(dá)SIRTl開展抑制MSC成脂、促進(jìn)成骨的研究，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚未見公開報(bào)道。Fan Q等著眼于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨與成脂分化平衡，選擇CCAAT/ 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein, C/EBP- α )為靶基因，研究它在細(xì)胞成骨-成脂轉(zhuǎn)分化過程中的調(diào)節(jié)作用。他們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)C/ΕΒΡα可以抑制BMP-2誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞的成骨分化，進(jìn)而提出通過抑制C/ΕΒΡα的表達(dá)而達(dá)到促進(jìn)骨形成，抑制脂肪異常增生的研究，但其進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也未見報(bào)道。羥固醇(Oxysterols)、淫羊藿酮(Epimedium-derivedflavonoids)、三七總皂苷 (Panax notoginseng saponins)等化合物和中藥提取物均被報(bào)道具有抑制MSC成脂分化， 促進(jìn)其成骨分化的作用，但其作用機(jī)理并未被研究透徹。TAZ,又稱含有Wff功能域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子1 (WW domain containing transcriptional regulator 1，WWTR1)。TAZ分子氨基端含有一個(gè)Wff結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可以和ftO-Pro-X-Tyr (PPXY)基序結(jié)合，羧基端含有一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil)，該結(jié)構(gòu)域可以和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的核心分子結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。MSCs成骨、成脂分化中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2和PPAR γ均含有PPXY基序，因此TAZ可以與Runx2和PPAR γ結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。Hong等的研究初步證實(shí)，TAZ與PPARy相結(jié)合，可以抑制脂肪細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)合蛋白 (ALBP/aP2)啟動(dòng)子所引起的aP2的轉(zhuǎn)錄，穩(wěn)定表達(dá)的TAZ可以抑制3T3-L1細(xì)胞成脂分化； 而同時(shí)骨髓來源的MSCs在TAZ基因抑制(knockdown)后成骨作用減弱，成脂作用增強(qiáng)。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)TAZ是成骨分化和成脂分化之間關(guān)鍵的“調(diào)節(jié)器”分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種hTAZ融合基因及構(gòu)建的慢病毒和促成骨的應(yīng)用，構(gòu)建出可表達(dá)的hTAZ基因慢病毒表達(dá)載體及hTAZ慢病毒，可應(yīng)用于促hMSC的成骨分化和骨質(zhì)疏松癥防治。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種hTAZ融合基因，在hTAZ基因的5'端依次連接Kozak序列、Shine-Dalgarno 序列和attBl序列，在其3 ‘端連接attB2序列；hTAZ融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1 所示。所述的hTAZ融合基因應(yīng)用于hMSC的促成骨分化，或應(yīng)用于hMSC成脂細(xì)胞的成骨分化。一種hTAZ載體，通過attB重組位點(diǎn)將SEQ. ID. NO. 1所示的hTAZ融合基因克隆入 PD0NR221 載體，稱為 pENTR-hTAZ 載體。一種hTAZ載體，通過LR重組反應(yīng)將含有SEQ. ID. NO. 1所示的hTAZ融合基因克隆入 pLenti6/V5-DEST 載體，稱為 pLenti6/V5_hTAZ 載體。一種hTAZ慢病毒，是由包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG表達(dá)的蛋白包裹含有 PLenti6/V5-hTAZ載體的基因組；該hTAZ慢病毒是將pLenti6/V5-hTAZ表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2和pLP/ VSVG混合感染宿主細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后裂解而產(chǎn)生。所述的hTAZ慢病毒轉(zhuǎn)染hMSC或hMSC成脂細(xì)胞后促其成骨分化的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明在hTAZ融合基因的基礎(chǔ)上構(gòu)建載體pLenti6/V5-hTAZ本發(fā)明構(gòu)建的pLenti6/V5-hTAZ表達(dá)質(zhì)粒是一種高效的hTAZ表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒在目的基因hTAZ上下游含有Lambda噬菌體重組序列_att，該序列的特異重組反應(yīng)允許目的
4腸桿菌、桿狀病毒和酵母等原核和真核載體之間通過重組反應(yīng)轉(zhuǎn)移穿梭，同時(shí)能保持讀框的正確性和方向性，有利于hTAZ基因功能的分析和蛋白質(zhì)的表達(dá)。相對(duì)于國內(nèi)外其它實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的基因載體在原核擴(kuò)增、真核表達(dá)時(shí)需要繁復(fù)的酶切鑒定具有反應(yīng)簡(jiǎn)便、高保真的優(yōu)點(diǎn)。
2、本發(fā)明同時(shí)生產(chǎn)出高效安全的hTAZ慢病毒病毒載體具有轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn)。目前約85%的基因治療臨床實(shí)驗(yàn)采用病毒載體。常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體等，但是這些載體存在著潛在的致癌性、自身免疫原性以及目的基因容量小等的缺點(diǎn)。在基因治療中廣泛應(yīng)用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體存在的主要問題，是無法高效轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細(xì)胞，而腺病毒載體雖然能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細(xì)胞，但在體內(nèi)不能實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定的長(zhǎng)期表達(dá)，且反復(fù)應(yīng)用容易引起免疫反應(yīng)。慢病毒載體具有可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞，轉(zhuǎn)移基因片段容量較大，目的基因表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)，不易引發(fā)宿主免疫反應(yīng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，以慢病毒載體系統(tǒng)的安全性甚至超過了目前臨床試驗(yàn)正在使用的致癌性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。因此，慢病毒載體已成為基因治療中載體研究的熱點(diǎn)。本發(fā)明中生產(chǎn)的hTAZ基因慢病毒是基于第3代慢病毒載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)的慢病毒生產(chǎn)體系，具有高效安全的特點(diǎn)。3、本發(fā)明構(gòu)建的hTAZ慢病毒在hMSC成脂-成骨轉(zhuǎn)分化中抑制成脂、促進(jìn)成骨的作用骨質(zhì)疏松癥患者骨髓內(nèi)存在MSCs分化的失衡，過高的成脂活性和脂細(xì)胞聚集危害到成骨細(xì)胞的形成和骨形成。若能阻斷MSCs向脂細(xì)胞分化的過程，或?qū)⒐撬柚械闹?xì)胞和潛在的“成脂前體細(xì)胞”轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞，可能會(huì)達(dá)到抑制成脂，促進(jìn)成骨的作用。本發(fā)明細(xì)胞轉(zhuǎn)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)hTAZ基因慢病毒對(duì)hMSC成脂-成骨轉(zhuǎn)分化具有促進(jìn)作用可以將已成脂分化的hMSC細(xì)胞分化誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，同時(shí)可以促進(jìn)未分化hMSC細(xì)胞成骨分化?？煽紤]將TAZ基因及其表達(dá)載體與緩釋基質(zhì)載體相結(jié)合(gene activated matrix, GAM)，通過局部注射的方式應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥患者的股骨頸、腰椎或橈骨遠(yuǎn)端，以起到促進(jìn)成骨，預(yù)防骨折的作用。


圖1為pD0NR221載體的質(zhì)粒圖譜；圖2為pENTR-hTAZ載體的雙酶切鑒定結(jié)果圖；圖3為表達(dá)載體pLenti6/V5-hTAZ的雙酶切鑒定結(jié)果圖；圖4為Wfestern blot檢測(cè)hTAZ在轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細(xì)胞后的表達(dá)結(jié)果圖；圖5-1 5-2為未進(jìn)行成脂誘導(dǎo)前、進(jìn)行成脂誘導(dǎo)后的油紅0紅染的結(jié)果圖；圖6為RT-PCR檢測(cè)成脂誘導(dǎo)細(xì)胞的PPAR γ和aP2表達(dá)的結(jié)果圖；圖7為Wfestern Blot檢測(cè)hTAZ病毒感染脂肪細(xì)胞后hTAZ表達(dá)的的結(jié)果圖；圖8為特異茜素紅S染色hTAZ病毒感染脂肪細(xì)胞后檢測(cè)成骨分化能力的結(jié)果圖；圖9為特異茜素紅S染色hTAZ病毒感染脂肪細(xì)胞后檢測(cè)成骨分化能力的定量分析圖。
具體實(shí)施例方式鑒于TAZ處于決定骨髓MSC分化方向的中心，具有和成脂分化關(guān)鍵分子PPAR γ和成骨分化關(guān)鍵分子Runx2結(jié)合，同時(shí)抑制PPAR γ調(diào)控的成脂分化，并促進(jìn)Rimx2調(diào)控的成骨分化的作用；本發(fā)明的目的在于克隆得到hTAZ基因，構(gòu)建出可表達(dá)的hTAZ基因慢病毒表達(dá)載體，并生產(chǎn)出可用于轉(zhuǎn)染的高滴度的hTAZ慢病毒，為骨質(zhì)疏松癥的基因治療打下基礎(chǔ)。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。1、可表達(dá)hTAZ基因克隆載體pLenti6/V5_hTAZ質(zhì)粒的構(gòu)建1)獲得兩端含有重組位點(diǎn)attB及信號(hào)肽的hTAZ基因片段首先設(shè)計(jì)并人工合以下PCR擴(kuò)增hTAZ基因的引物對(duì)P 上游引物Pl:gggg acaast ttstacaaaa aascassct t cgaaggagat aga accatg； a atccggcctc ggcgc ；下游引物P2:gggg acctct ttstacaasa aasctgggt C ttacagccag gttagaaagg gc ；其中上游引物Pl劃線標(biāo)注的序列依次為attBl序列、Shine-Dalgarno序列和 Kozak序列；下游引物P2劃線標(biāo)注的序列為attB2序列；在目的基因hTAZ上下游構(gòu)建Lambda噬菌體重組序列_att，att序列的特異重組反應(yīng)允許目的基因通過BP、LR重組反應(yīng)在大腸桿菌、桿狀病毒和酵母等原核和真核載體之間轉(zhuǎn)移穿梭，同時(shí)能保持讀框的正確性和方向性，有利于hTAZ基因功能的分析和蛋白質(zhì)的表達(dá)；提取培養(yǎng)好的Hela細(xì)胞的mRNA，以提取的mRNA作為模板，參照!Iomega (USA)說明書合成cDNA，S卩1μ g mRNA為模板加入引物oligo-dT12-18，放入70°C水浴IOmin后立即轉(zhuǎn)移入冰中，加入反轉(zhuǎn)錄酶AMV-RT，41°C水浴中60min，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；然后以合成的cDNA為模板，以引物對(duì)P作為引物，利用Platinum Taq DNA高保真聚合酶合成attB-hTAZ。具體的PCR反應(yīng)如下，在25 μ L體系中加入IOX反應(yīng)緩沖液 2. 5 μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 4 μ L，模板 cDNA2 μ L，上游引物(10 μ mol/L) 2 μ L，下游引物 (10μπιο1/ 2μ L，Platinum Taq DNA 高保真聚合酶 1U，補(bǔ)水至 25 μ L ；PCR循環(huán)設(shè)置，94°C， 5min ；94°C，30s ；53°C, 30s ；72°C, Imin ；30 個(gè)循環(huán)；PCR 獲得 attB-hTAZ 融合基因。取1 2μ 1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，可以檢測(cè)到含有attB重組位點(diǎn)的重組hTAZ片段，可見在1電泳道IOOObp與2000bp之間的1279bp的 attB-hTAZ融合基因，其具體的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。使用北京天根公司膠回收試劑盒(貨號(hào)DP209)回收PCR片段將PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中切下，稱重。向膠塊中加入3倍體積的溶膠液PN，50°C水浴lOmin。將溶膠液加入已平衡過的吸附柱CA2中，12，000rpm(13，400g)離心30 60s。向吸附柱中加入600 μ 1 漂洗液PW，12，OOOrpm(13, 400g)離心30 60s，共漂洗兩次。將吸附柱CA2放入收集管中， 向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖液EB，室溫放置anin。12，OOOrpm(13, 400g)離心 anin后收集DNA溶液。
2)利用BP重組反應(yīng)構(gòu)建克隆質(zhì)粒pENTR-hTAZ將IOOfmol attB-hTAZ與IOOfmol pD0NR221載體(其質(zhì)粒圖譜如圖2所示)在 BP克隆酶復(fù)合物作用下進(jìn)行BP重組反應(yīng)于一潔凈的1. 5ml離心管中順序加入IOOfmol attB-hTAZ PCR產(chǎn)物，IOOfmol PD0NR221質(zhì)粒。用PH8. O的TE緩沖液稀釋至8 μ 1混合均勻。而后在離心管中加入2 μ L 的BP Clonase II酶，混勻后于25°C孵育2h。attB-hTAZ中的attB重組位點(diǎn)和pD0NR221 中的attP重組位點(diǎn)發(fā)生重組反應(yīng)，成功生成的載體稱為pENTR-hTAZ載體；將1 μ 1 BP反應(yīng)物與50 μ 1 DH5 α感受態(tài)細(xì)菌混合，熱休克法轉(zhuǎn)化DH5 α細(xì)菌。 將菌液涂于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)板，倒置放于37°C孵箱，待12h后挑選陽性克隆。挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒后，對(duì)提取的pENTR-hTAZ質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。采用M13測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。M13上游(-20)引物gtaaaacgacggccag，下游引物 gtcatagctgtttcctgg ；PCR 反應(yīng)條件:95V 5min ；96°C 20s, 50°C 10s,60°C 4min，30 個(gè)循環(huán)。 測(cè)序反應(yīng)鑒定pENTR-hTAZ質(zhì)粒中的hTAZ序列正確無誤。3)利用LR重組反應(yīng)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pLenti6/V5_hTAZ將IOOng 質(zhì)粒 pENTR-hTAZ 與 150ng pLenti6/V5_DEST 載體質(zhì)?；旌?，加入 4 μ 1 LR克隆重組酶II復(fù)合物(美國hvitrogen公司)，25°C孵育lh，進(jìn)行LR重組反應(yīng)，成功重組而生成的載體稱為表達(dá)載體pLenti6/V5-hTAZ ；將獲得的表達(dá)載體pLenti6/V5_hTAZ轉(zhuǎn)化One Shot Stbl3感受態(tài)Ε. coli，以含有 100 μ g/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)板篩選陽性克隆，挑取5個(gè)陽性克隆，擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行BamH I.Xho I雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定；雙酶切鑒定的電泳結(jié)果如圖3所示，其中泳道1為Marker，泳道2 6為5個(gè)陽性克隆所提取的質(zhì)粒的酶切，可以看到5個(gè)陽性克隆均含有1279bp的目的片段hTAZ ；而提取的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定，目的片段hTAZ的序列保持一致，所挑取的克隆為陽性克隆。4)表達(dá)載體pLenti6/V5_hTAZ的表達(dá)鑒定以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將表達(dá)載體pLenti6/V5-hTAZ轉(zhuǎn)染小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1 (中科院上海細(xì)胞庫)，以含有10 μ g/ml的殺稻瘟菌素(Blasticidin)培養(yǎng)基篩選pLenti6/ V5-hTAZ轉(zhuǎn)染的重組MC3T3-E1細(xì)胞。挑選pLenti6/V5-hTAZ成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，每IO6細(xì)胞加300 μ 1裂解液裂解細(xì)胞， 抽提蛋白，定量。取40 μ g上樣，進(jìn)行SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，lh。5%脫脂奶粉封閉Ih后加兔抗人TAZ抗體(美國Cell Signaling公司)，37°C，lh， 洗膜。羊抗兔化6二抗(武漢博士德公司)，371，111，洗膜。以β-actin的檢測(cè)作為內(nèi)參照，ECL發(fā)光系統(tǒng)(美國Pierce公司)檢測(cè)反應(yīng)蛋白，X線膠片顯影。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，泳道1為作為對(duì)照的未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的MC3T3-E1細(xì)胞，泳道2 為成功轉(zhuǎn)染pLenti6/V5-hTAZ載體的MC3T3-E1細(xì)胞，對(duì)比泳道1、2，可以明顯的看到hTAZ 基因在宿主細(xì)胞中得到了表達(dá)；這表明所構(gòu)建的表達(dá)載體pLenti6/V5-hTAZ可在MC3T3-E1 中高表達(dá)hTAZ。2. hTAZ慢病毒的生產(chǎn)1)目的基因hTAZ載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染病毒生成細(xì)胞以獲得hTAZ慢病毒
將3 μ g 的 pLenti6/V5-hTAZ 表達(dá)質(zhì)粒 9 μ g 的包裝質(zhì)粒 pLPl，pLP2，pLP/VSVG ViraPower Packaging Mix (美國 Invitrogen 公司，產(chǎn)品名 ViraPower Bsd Lentiviral Support Kit，貨號(hào)K4970-00)(共12 μ g質(zhì)粒)按照1 3比例混合，加入1. 5ml無血清的 Opti-MEM I 培養(yǎng)液中。同時(shí)將 36 μ 1 脂質(zhì)體Lipofectamine 2000加入 1. 5ml 的 Opti-MEM I 培養(yǎng)基中輕柔混合，并室溫放置5min。輕柔混合稀釋的DNA與稀釋的Lipof ectamine 2000， 室溫孵育20min以形成復(fù)合物。最后將DNA-Lipofectamine 2000加入培養(yǎng)有人胚腎細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)的培養(yǎng)瓶中，于含有5% CO2的371培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后，去掉原細(xì)胞培養(yǎng)液，更換為無抗生素的10%胎牛血清的Opti-MEM I培養(yǎng)液。更換培養(yǎng)液后48h 收取含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液，4°C離心3000轉(zhuǎn)15min，收集培養(yǎng)上清，以0. 45 μ m Millex-HV 或聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)濾膜過濾，去除細(xì)胞碎屑，收獲病毒。 存于-80°C備用。2)確定生產(chǎn)出hTAZ慢病毒的滴度將生產(chǎn)出的hTAZ慢病毒10倍體積比倍比稀釋，在多陽離子化合物海美溴銨 (hexadimethrine bromide, Polybrene)的協(xié)同作用下轉(zhuǎn)染人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞。以殺稻瘟毒素(Blasticidin)篩選穩(wěn)定表達(dá)hTAZ的細(xì)胞(說明培養(yǎng)的條件和殺稻瘟毒素的濃度)，由于hTAZ慢病毒含有Blasticidin抗性基因(該基因是存在于 PLenti6/V5-hTAZ載體上)，因此可以在殺稻瘟毒素篩選壓力下存活。殺稻瘟毒素(Blasticidin)篩選12天。用1 %結(jié)晶紫染色，根據(jù)倍比稀釋慢病毒溶液在篩選培養(yǎng)板上形成的克隆平均數(shù)確定病毒的滴度。滴度檢測(cè)結(jié)果顯示本發(fā)明所獲得的hTAZ慢病毒滴度可達(dá)7 X IO6轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(transducing units, TU)/毫升(ml)。而培養(yǎng)上清經(jīng)超高速離心26，000rpm，90min，4°C，可將病毒滴度濃縮至6X IO8TU/ ml ο3.驗(yàn)證hTAZ慢病毒在hMSC成脂-成骨轉(zhuǎn)分化中抑制成脂、促進(jìn)成骨的作用hMSC (美國 Cambrex-Lonza 公司，貨號(hào) P0PT-2501)以 Poietics MSC 培養(yǎng)液(美國 Cambrex-Lonza公司，貨號(hào)PT-3001)于含有5% CO2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次
培養(yǎng)液。在hMSC培養(yǎng)基中(Poietics MSC培養(yǎng)液)加入成脂誘導(dǎo)劑1 μ M地塞米松，0. 2mM 吲哚美辛，0. lmg/ml胰島素和ImM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤誘導(dǎo)hMSC成脂分化。每3天
更換一次培養(yǎng)液。成脂誘導(dǎo)分化21天后見hMSC分化為細(xì)胞漿內(nèi)含有大量油紅0紅染的脂肪顆粒， 證實(shí)細(xì)胞已分化為脂肪細(xì)胞；在圖5-1、圖5-2所示分別為未進(jìn)行成脂誘導(dǎo)前、進(jìn)行成脂誘導(dǎo)后的油紅0紅染的結(jié)果圖，經(jīng)過對(duì)比可以證實(shí)細(xì)胞已分化為脂肪細(xì)胞；同時(shí)提取成脂誘導(dǎo)前、后的細(xì)胞mRNA， RT-PCR檢測(cè)見成脂分化標(biāo)志分子PPAR γ和aP2表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，可以看出經(jīng)過21天的成指誘導(dǎo)后，PPARy和aP2表達(dá)升高，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞已分化為脂肪細(xì)胞；取7X 106TU/ml轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的pLenti6/V5-hTAZ慢病毒Iml加入到成脂分化誘導(dǎo)21 天的hMSC中。24h后將含有病毒的培養(yǎng)液更換為普通hMSC培養(yǎng)液，24h后向轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入成骨分化誘導(dǎo)劑IOOnM地塞米松，IOmM β-甘油磷酸和50μΜ L-抗壞血酸。 以后每3天更換一次含有成骨分化誘導(dǎo)劑的hMSC培養(yǎng)液，成骨分化誘導(dǎo)21天。
誘導(dǎo)21天之后，對(duì)pLenti6/V5-hTAZ慢病毒感染后的成骨分化效果進(jìn)行檢測(cè)。如圖7所示的脂肪細(xì)胞在hTAZ病毒感染前(non-transduced)、空病毒對(duì)照感染后(Lenti-mock)和hTAZ慢病毒感染后(Lenti-TAZ) 10天的Western Blot檢測(cè)結(jié)果，可見 hTAZ慢病毒感染后(Lenti-TAZ)細(xì)胞內(nèi)hTAZ蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。用特異性茜素紅S 染色(Osteogenesis Quantitation Kit 購自美國 Millipore 公司，貨號(hào)ECM815)確定細(xì)胞鈣化的程度。茜素紅S可以螯合礦化組織的鈣并沉積于細(xì)胞表面，利用10%乙酸析取螯合的茜素紅S并比照吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對(duì)細(xì)胞的成骨分化進(jìn)行定量分析。 具體方法如下細(xì)胞用PBS洗2遍，95%乙醇固定lOmin，0. 2%茜素紅作用20min， 水洗3遍，晾干。在接種有細(xì)胞的M孔板每孔中加入400 μ L 10%乙酸室溫下孵育30min， 用細(xì)胞刮將細(xì)胞輕輕掛下移至1. 5mL的離心管中，渦旋30s。85°C加熱lOmin，將離心管移至冰上5min, 20，000g離心15min。離心結(jié)束后將400 μ L上清移至新的1. 5mL的離心管中。 每個(gè)離心管中加入150μ L 10%氫氧化銨。將標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品各取150μ L放入96板中， 用0D405的濾光片檢測(cè)吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的茜素紅S的濃度。染色結(jié)果如圖8所示，hTAZ慢病毒感染細(xì)胞(Ienti-TAZ)的成骨分化能力較空病毒對(duì)照感染組(Lenti-mock)和未感染組(non-transduced)茜素紅S染色明顯增強(qiáng) (10X20)。(圖中未染色部分為未能成骨分化，表面未沉積礦化物的細(xì)胞。)定量比色法茜素紅S染色檢測(cè)結(jié)果如圖9所示，hTAZ慢病毒感染細(xì)胞組 (Ienti-TAZ)染色數(shù)值較空病毒對(duì)照感染組(Lenti-mock)和未感染組(non-transduced) 有顯著性升高(P <0.01)。鑒于所制備的hTAZ基因慢病毒對(duì)hMSC成脂-成骨轉(zhuǎn)分化的促進(jìn)作用，提示hTAZ 基因慢病毒在治療骨質(zhì)疏松癥骨折中的潛在應(yīng)用價(jià)值。骨質(zhì)疏松癥患者的骨質(zhì)中存在著 hMSC成脂分化增強(qiáng)，成脂分化減弱的情況，其椎體、股骨頸和橈骨遠(yuǎn)端易于發(fā)生脆性骨折， 在高齡患者中往往會(huì)造成嚴(yán)重的家庭負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。hTAZ基因慢病毒可以促進(jìn)骨髓中由hMSC分化而來的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成骨細(xì)胞，并能促進(jìn)未分化的hMSC分化為成骨細(xì)胞。 因此可以考慮將攜帶hTAZ基因的慢病毒通過局部注射的方法應(yīng)用于易于發(fā)生脆性骨折的機(jī)體局部，達(dá)到預(yù)防并治療骨質(zhì)疏松癥骨折的作用；所購建并生產(chǎn)的hTAZ基因載體和慢病毒具有廣闊的研究前景和應(yīng)用價(jià)值。
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權(quán)利要求
1.一種hTAZ融合基因，其特征在于，在hTAZ基因的5'端依次連接Kozak序列、 Shine-Dalgarno序列和attBl序列，在其3'端連接attB2序列；hTAZ融合基因的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。
2.權(quán)利要求1所述的hTAZ融合基因應(yīng)用于hMSC的促成骨分化，或應(yīng)用于hMSC成脂細(xì)胞的成骨分化。
3.一種hTAZ載體，其特征在于，通過attB重組位點(diǎn)將SEQ. ID. NO. 1所示的hTAZ融合基因克隆入PD0NR221載體，稱為pENTR-hTAZ載體。
4.一種hTAZ載體，其特征在于，通過LR重組反應(yīng)將含有SEQ. ID. NO. 1所示的hTAZ融合基因克隆入pLenti6/V5-DEST載體，稱為pLenti6/V5_hTAZ載體。
5.一種hTAZ慢病毒，其特征在于，是由包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG表達(dá)的蛋白包裹含有pLenti6/V5-hTAZ載體的基因組；該hTAZ慢病毒是將pLenti6/V5-hTAZ表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pLPl、pLP2和pLP/VSVG混合感染宿主細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后裂解而產(chǎn)生。
6.權(quán)利要求5所述的hTAZ慢病毒轉(zhuǎn)染hMSC或hMSC成脂細(xì)胞后促其成骨分化的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種hTAZ融合基因及構(gòu)建的慢病毒和促成骨的應(yīng)用，在hTAZ基因的5′端依次連接Kozak序列、Shine-Dalgarno序列和attB1序列，在其3′端連接attB2序列；hTAZ融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。細(xì)胞轉(zhuǎn)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)hTAZ基因慢病毒對(duì)hMSC成脂-成骨轉(zhuǎn)分化具有促進(jìn)作用可以將已成脂分化的hMSC細(xì)胞分化誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，同時(shí)可以促進(jìn)未分化hMSC細(xì)胞成骨分化。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102517311SQ20111037770
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者尹思, 尹戰(zhàn)海, 張璟, 李曙明, 李萌, 邱裕生 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)