專利名稱：scFvC6.5－TNF－α融合基因和蛋白及制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶向抗腫瘤藥物和基因重組技術(shù)，具體地說是scFvC6.5-TNF-α融合基因和蛋白及制備，尤其是細胞因子免疫毒素scFvC6.5-TNF-α及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫毒素是由靶向腫瘤細胞的抗體分子與細胞毒效應(yīng)分子相連所產(chǎn)生的組合分子，主要用于靶向治療腫瘤或自身免疫性疾病。免疫毒素發(fā)展至今經(jīng)歷了三代歷程，重組免疫毒素(recombinant immunotoxin)被認為是第三代免疫毒素，它是通過基因工程方法將抗體功能區(qū)或生長因子的基因與突變形式的毒蛋白基因融合表達產(chǎn)生。重組免疫毒素具有適于工業(yè)化、生產(chǎn)成本低、對實體瘤滲透性高、免疫原性小等優(yōu)點。
對于重組免疫毒素進行基因工程和蛋白質(zhì)工程方面的改造稱為免疫毒素工程(Engineering of immunotoxins)。對免疫毒素的改造可分為抗體部分和毒素部分兩個方面。對免疫毒素進行改造的目的是為了盡量降低免疫原性、增加特異殺傷作用、保證合理的半衰期、減小非特異性毒副作用。
Her2/neu是具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌基因，編碼一種分子量185KDa的單鏈跨膜糖蛋白激酶，稱之為p185或HER2/neu；這種蛋白與表皮生長因子受體高度同源，屬于表皮生長因子家族成員之一；此家族還包括EGFR(HER1/ErbB1)、HER2/neu(c-neu/erbB2)、HER3(ErbB3)及HER4(tyro2/ErbB4)，它們編碼的蛋白均具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性。同屬于受體酪氨酸激酶超家族。Her2/neu過度表達在人類多種腫瘤組織中，如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等，已經(jīng)成為這些腫瘤的靶分子。也使其成為腫瘤一個亞類發(fā)生發(fā)展的標志物，靶向HER2/neu的研究是近年來研究的熱點。另外臨床研究發(fā)現(xiàn)HER2/neu過度表達的癌細胞對TNF-α的作用不敏感，其通過抵抗二者的細胞毒作用，使腫瘤細胞逃逸宿主防御機制而促進腫瘤發(fā)生。
腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強的細胞因子，它通過與細胞表面TNF-α受體結(jié)合，誘導腫瘤細胞凋亡。關(guān)于TNF-α與其它抗體融合構(gòu)建免疫毒素的技術(shù)已經(jīng)趨于成熟，臨床研究顯示TNF-α相關(guān)的免疫毒素對腫瘤具有特異性殺傷效果。

發(fā)明內(nèi)容
為了增加過度表達HER2/neu的腫瘤細胞對TNF的敏感性和提高HER2/neu抗體的腫瘤殺傷效應(yīng)，申請人構(gòu)建了一個新的由人源化抗HER2/neu單鏈抗體(scFvC6.5)和人腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)組成的免疫毒素scFvC6.5-TNF-α，并鑒定了其免疫特異性和生物活性。結(jié)果顯示重組免疫毒素能夠特異識別和殺傷HER2/neu+陽性卵巢癌細胞SKOV-3和乳腺癌細胞MCF-7，對HER2/neu-陰性黑色素瘤細胞A375沒有影響；提示它在抗HER2/neu過度表達的腫瘤靶向治療中具有潛在的應(yīng)用價值。
本發(fā)明的目的是提供一種特異性強，滲透力高，對HER2/neu過度表達的腫瘤細胞具有靶向殺傷能力的細胞因子類免疫毒素。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種scFvC6.5-TNF-α融合基因，具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列；其編碼蛋白具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
scFvC6.5-TNF-α融合基因的制備以人源化單鏈抗體scFvC6.5和人的TNF-α基因為模板，進行PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳回收后，經(jīng)雙酶切，插入到表達載體pET28a中，進行酶連接反應(yīng)，得到pET28a-scFvC6.5-TNF-α。
scFvC6.5-TNF-α融合蛋白的制備pET28a-scFvC6.5-TNF-α轉(zhuǎn)化致大腸桿菌BL21(DE3)中，進行表達；SDS-PAGE證明蛋白scFvC6.5-TNF-α主要以包含體形式存在于菌體中；利用組氨酸殘基與Ni+結(jié)合的原理，應(yīng)用金屬螯合柱層析梯度復性，將包含體蛋白進行了變性復性和純化，得到了純化的scFvC6.5-TNF-α融合蛋白。
所述scFvC6.5-TNF-α融合基因的編碼蛋白可用于制備對高表達HER2/neu的腫瘤細胞具有強特異性殺傷作用的藥物中，可使scFvC6.5-TNF-α所誘導的腫瘤細胞凋亡。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.scFvC6.5-TNF-α融合基因經(jīng)過表達、變性、復性純化得到免疫毒素scFvC6.5-TNF-α；而scFvC6.5-TNF-α融合蛋白中的scFvC6.5為人源化抗體，TNF-α為來自人本身的細胞因子，避免了實際應(yīng)用中可能出現(xiàn)的免疫原性。
2.scFvC6.5-TNF-α基因為人工制備的一種新的融合基因，屬首次制得的基因，該基因的表達可用于抗HER2/neu高表達的腫瘤靶向治療的研究。體外實驗證實其融合蛋白對HER2/neu高表達的腫瘤細胞具有明顯殺傷作用，而對HER2/neu陰性的細胞沒有殺傷作用，顯示出腫瘤殺傷強特異性；該免疫毒素為細胞表面過度表達HER2/neu的腫瘤靶向治療展示了潛在的應(yīng)用前景；融合毒素scFvC6.5-TNF-α分子量為43KDa，具有滲透實體瘤的能力。
3.本發(fā)明提供了一種制備融合毒素scFvC6.5-TNF-α的工藝方法，據(jù)此方法可以制得分純的scFvC6.5-TNF-α蛋白；應(yīng)用本發(fā)明，可進一步提供直接用于生產(chǎn)融合毒素scFvC6.5-TNF-α的工程菌株。


圖1為scFvC6.5-TNF-α融合基因在大腸桿菌中表達電泳圖其中1為中分子量蛋白標準，2為scFvC6.5-TNF-α融合蛋白純品，3為誘導后細胞周質(zhì)蛋白，4為誘導后細胞菌體蛋白，5為未誘導的工程菌菌體蛋白(陰性對照)。
具體實施例方式
實施例1一種scFvC6.5-TNF-α融合基因，具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列。
CATTAGCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCAGAGTTGAAAAAACCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTACATGGGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCGTCAGCACTGCCTACTTGCAATGGAGCAGTCTGAAGCCCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGACATGACGTGGGATATTGCAGTAGTTCCAACTGCGCAAAGTGGCCTGAATACTTCCAGCATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTCACACCAATCGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTGCGGCCGCAGGTGGAGGCGGATCCGTCAGGTCATCTTCACGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTGCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTACCATCAGAGGGCTTGTACCTCATTTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCGTCGACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCGATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCATGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAAATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATTAtTGCCCTGCTCGAG
(1)SFQ ID NO1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長度1272堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源scFvC6.5cDNA和TNF-αcDNA(2)scFvC6.5-TNF-α融合基因的制備為了獲得pET28a-scFvC6.5-TNF-α融合基因，設(shè)計并合成了2對引物一對scFvC6.5引物和一對TNF-α引物。
scFvC6.5Primer15`-gggtttcatatgcaggtgcagctggtgc-3`，含NdeI酶切位點。
scFvC6.5Primer25`-atttgcggccgcacctaggacggtcagc-3`含NotI酶切位點。
TNF-αPrimerl5`-atttgcggccgcaggtggaggcggatccgtcaggtcatcttcac-3`含NotI酶切位點及Gly4Ser連接肽。
TNF-αPrimer25`-aattctcgagcagggcaataatcccaaag-3`含XhoI酶切位點。
用上述引物分別PCR擴增scFvC6.5和TNF-α基因，條件為scFvC6.5進行PCR條件變性94℃，30sec；退火58℃，30sec；延伸72℃，1min；35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。
TNF-α進行PCR條件變性94℃，30sec；退火55℃，30sec；延伸72℃，1min；35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳回收后，用NdeI和NotI酶切scFvC6.5基因，用NotI和XhoI酶切TNF-α基因。將NedI和XhoI酶切后的載體pET28a與scFvC6.5和TNF-α酶切片段按照1∶3∶3的比例混合后，加入T4DNA連接酶在16℃過夜進行連接反應(yīng)。
酶連接反應(yīng)體系(30μl)

將酶連接后的混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)。感受態(tài)細胞的制備，CaCl2轉(zhuǎn)化方法，質(zhì)粒DNA的提取鑒定參考《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，E.F.費里奇，T.曼尼阿蒂斯，科學出版社1998年版。
卡那霉素平板篩選，挑取陽性克隆，接種于5mlLB(50μg/ml卡那霉素)培養(yǎng)基，37℃，220rpm培養(yǎng)過夜，小量提取質(zhì)粒，進行測序。送至上海聯(lián)合基因生物公司進行測序；對轉(zhuǎn)化子的測序結(jié)果表明，DNA序列測定結(jié)果顯示scFvC6.5-TNF-α的DNA序列及讀碼框完全正確。
(3)重組子pET28a-scFvC6.5-TNF-α在大腸桿菌中的表達將上述重組菌擴大培養(yǎng)于500mlLB培養(yǎng)液(50μg/ml卡那霉素)中，37℃，220rpm培養(yǎng)至OD600nm＝0.5。加入IPTG至終濃度為1mM，誘導表達4h。4000g離心20min收集菌體。
(4)融合蛋白scFvC6.5-TNF-α的變性、復性及純化PBS洗滌菌體一次。菌體經(jīng)50ml 50mM Tris·HCl pH8.3重懸后，超聲破碎。12000g離心30min，得到上清和沉淀。對上清和沉淀分別進行SDS-PAGE及Western-blot鑒定，發(fā)現(xiàn)scFvC6.5-TNF-α蛋白主要以包含體形式存在。依次用2.5M NaCl、0.05％TritonX-100及2M脲素洗滌scFvC6.5-TNF-α的包含體后，10,000rpm離心30min，洗滌后的包含體按2mg/ml濃度溶解在變性液(8M脲素，50mM Tris·HCl，pH8.3)中，4℃攪拌過夜，0.45μm微膜過濾，準備上柱純化。
應(yīng)用IMAC梯度復性法進行產(chǎn)物蛋白的純化及復性。5ml ChelatingSepharose裝柱后經(jīng)Ni離子飽和，用變性液平衡柱體。將10ml變性的包涵體加入柱中，4℃孵育5h。用變性液將基線洗平，然后用200ml的線性梯度逐步由含8M脲素的變性液過渡到復性緩沖液(50mMTris·HCl，pH8.3)中。然后用洗脫液(0.5M咪唑，50mM Tris·HCl，pH8.3)將復性后的蛋白洗出柱子。洗脫樣品在透析液(含10％甘油的PBS溶液)中透析過夜。保留各洗脫產(chǎn)物，分取10μl，進行SDS-PAGE，以鑒定蛋白純化情況。其中第一抗體為抗TNF-α鼠單克隆抗體抗體，第二抗體為HRP標記的羊抗鼠抗體，底物為Supersignal發(fā)光底物。
(5)融合蛋白scFvC6.5-TNF-α的SDS-PAGE檢測將scFvC6.5-TNF-α誘導前后的菌體蛋白與上樣6×上樣緩沖液30μl體系，混勻后在100℃煮5min，取5μl進行12％SDS-PAGE?？捡R斯亮藍染色，結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白的表達。
結(jié)果比較誘導后工程菌的細胞全蛋白電泳帶和誘導前工程菌的細胞全蛋白電泳帶，發(fā)現(xiàn)在43KDa處的蛋白帶明顯增粗，包含體純化后蛋白帶就在此處，正符合scFvC6.5-TNF-α的分子大小。見圖1，紫外凝膠成像掃描系統(tǒng)顯示此表達蛋白占菌體總蛋白的5％左右。純化蛋白純度大于95％。折合產(chǎn)率800μg/lL菌液。
(6)ELISA檢測scFvC6.5-TNF-α對不同程度表達HER2/neu的腫瘤細胞的結(jié)合活性將SKOV-3、MCF-7、MDA-MB-231和A-375細胞分別培養(yǎng)至對數(shù)期，以每孔5×104接種96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。舍棄上清，4℃使用丙酮固定15min。5％BSA/PBS溶液100μl 37℃封閉2h后，分別加入不同濃度純化后的scFvC6.5-TNF-α50μl/孔，37℃孵育2h。PBS洗三次，加入鼠抗6×His·Tag抗體(1∶2000)50μl，37℃孵育2h。PBS洗三次，再加入HRP標記的羊抗鼠抗體50μl，37℃孵育1h。PBS洗三次，加入OPD底物5min，加12.5％硫酸50μl/孔中止反應(yīng)。置酶標儀測492nm吸光度值。加入PBS的一組為陰性對照。每個樣品設(shè)三個平行孔，結(jié)果取三次重復試驗的平均值。
ELISA實驗表明，免疫毒素scFvC6.5-TNF-α結(jié)合卵巢癌SKOV-3細胞的活性最高，而且隨著劑量的增高而加強，結(jié)合乳腺癌MCF-7細胞的能力較弱，幾乎不結(jié)合黑色素瘤A-375細胞。這說明融合蛋白scFvC6.5-TNF-α的結(jié)合活性是特異的，能夠區(qū)分HER2/neu陽性和陰性細胞。
(7)融合蛋白scFvC6.5-TNF-α的細胞殺傷活性試驗MTT法檢測不同濃度scFvC6.5-TNF-α對SKOV-3、MCF-7和A-375三種細胞的細胞毒活性將培養(yǎng)至對數(shù)期的SKOV-3、MCF-7和A-375細胞，分別以每孔104傳人96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。加入不同濃度的scFvC6.5-TNF-α50μl/孔，培養(yǎng)12h。加入MTT至終濃度為1mg/ml。孵育2h。吸凈培養(yǎng)液。加入50μl DMSO。振蕩5min，置于酶標儀中測定A570吸光度值。加入含10％甘油的PBS的一組為陰性對照。每組設(shè)三次平行，取三次試驗平均值。設(shè)空白對照。
MTT法檢測50nM下不同時間scFvC6.5-TNF-α對SKOV-3、MCF-7和A-375三種細胞的細胞毒活性與上述方法相同，在加入scFvC6.5-TNF-α后2、8、12、16、24h，分別加入MTT至終濃度為1mg/ml。測定A570吸光度值。
MTT試驗表明scFvC6.5-TNF-α對HER2/neu高表達細胞SKOV-3的生長具有顯著的抑制作用，并且為劑量依賴性。在一定濃度下，scFvC6.5-TNF-α對HER2/neu中度表達的MCF-7細胞也存在明顯的細胞毒效應(yīng)，而對HER2/neu表達陰性的細胞A-375不敏感。
當選擇50nM scFvC6.5-TNF-α作為固定劑量，觀察不同時間(2-24h)對細胞生長的影響時，發(fā)現(xiàn)scFvC6.5-TNF-α對細胞生長的抑制作用自孵育后第12開始加速，在第24h時，SKOV-3細胞死亡率接近100％，MCF-7細胞死亡率約80％；而HER2/neu表達陰性的細胞A-375沒有隨著時間的延長產(chǎn)生明顯的細胞毒現(xiàn)象，說明scFvC6.5-TNF-α對靶細胞的殺傷作用呈現(xiàn)時間依賴性。
SEQUENCE LISTING<110>中國科學院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所<120>scFvC6.5-TNF-α融合基因和蛋白及制備<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1272<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1272)<223>
<400>1cat tag cag gtg cag ctg ttg cag tct ggg gca gag ttg aaa aaa ccc48His Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro1 5 10 15ggg gag tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt acc96Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr20 25 30agc tac tgg atc gcc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag144Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu35 40 45tac atg ggg ctc atc tat cct ggt gac tct gac acc aaa tac agc ccg192Tyr Met Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro50 55 60tcc ttc caa ggc cag gtc acc atc tca gtc gac aag tcc gtc agc act240Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr65 70 75gcc tac ttg caa tgg agc agt ctg aag ccc tcg gac agc gcc gtg tat288Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr80 85 90 95ttt tgt gcg aga cat gac gtg gga tat tgc agt agt tcc aac tgc gca336Phe Cys Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala100 105 110aag tgg cct gaa tac ttc cag cat tgg ggc cag ggc acc ctg gtc acc384Lys Trp Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr115 120 125gtc tcc tca ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt ggc432
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<211>422<212>PRT<213>人工序列<400>2Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met35 40 45Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp100 105 110Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser130 135 140Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln145 150 155 160Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn165 170 175Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu180 185 190Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser195 200 205Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg210 215 220Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu225 230 235 240Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala245 250 255Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser260 265 270
Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn pro Gln Ala Glu Gly Gln275 280 285Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val290 295 300Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu305 310 315 320Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His325 330 335Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr340 345 350Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr355 360 365Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly370 375 380Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn385 390 395 400Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly405 410 415Ile Ile Ala Leu Leu Glu420
權(quán)利要求
1.一種scFvC6.5-TNF-α融合基因，其特征在于具有序列表SEQ IDNO1中的堿基序列。
2.一種權(quán)利要求1所述scFvC6.5-TNF-α融合基因的編碼蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
3.一種權(quán)利要求2所述scFvC6.5-TNF-α融合基因的編碼蛋白的制備，其特征在于1)制備scFvC6.5-TNF-α融合基因以人源化單鏈抗體scFvC6.5和人的TNF-α基因為模板，進行PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳回收后，經(jīng)雙酶切，插入到表達載體pET28a中，進行酶連接反應(yīng)，得到pET28a-scFvC6.5-TNF-α；2)制備scFvC6.5-TNF-α融合蛋白將上述的pET28a-scFvC6.5-TNF-α轉(zhuǎn)化致大腸桿菌BL21中，進行表達；運用IMAC梯度復性法對表達產(chǎn)物進行變性、復性及純化，得到scFvC6.5-TNF-α分純產(chǎn)品。
4.一種權(quán)利要求2所述scFvC6.5-TNF-α融合基因的編碼蛋白的應(yīng)用，其特征在于用于制備對高表達HER2/neu的腫瘤細胞具有強特異性殺傷作用的藥物中。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶向抗腫瘤藥物和基因重組技術(shù)，具體地說是scFvC6.5－TNF－α融合基因和蛋白及制備，scFvC6.5－TNF－α融合基因具有序列表1的堿基序列。scFvC6.5－TNF－α融合基因經(jīng)過表達、變性、復性純化得到免疫毒素scFvC6.5－TNF－α。體外實驗證實該融合蛋白對HER2/neu高表達的腫瘤細胞具有明顯殺傷作用，而對HER2/neu陰性的細胞沒有殺傷作用，顯示出腫瘤殺傷強特異性。該免疫毒素為細胞表面過度表達HER2/neu的腫瘤靶向治療展示了潛在的應(yīng)用前景。
文檔編號A61P35/00GK1865444SQ20051004647
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日
發(fā)明者吳文芳, 蔣琳, 呂安國 申請人:中國科學院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所