專利名稱：葡激酶與Annexin V融合基因的構(gòu)建及表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及葡激酶與Annexin V融合基因的構(gòu)建及在家蠶中和大腸桿菌中的表達(dá)。
葡激酶(Staphylokinase，Sak)是有溶血性金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體所合成的一種蛋白質(zhì)，由136個(gè)氨基酸組成，分子量15.5KD，能特異地與纖溶酶原結(jié)合成1∶1分子復(fù)合物，催化另一分子纖溶酶原，使之轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的活性纖溶酶，后者催化血栓中的纖維蛋白水解，使血栓溶解，血管再通。由于葡激酶具有高纖維蛋白特異性，因此能高效激活血栓周圍的纖溶酶原，特異地溶解血栓而不誘發(fā)系統(tǒng)性纖溶狀態(tài)。此外由于Sak分子量小，穿透性能好，對(duì)富含血小板的血栓的溶解比其他溶栓藥物具有更強(qiáng)的療效。80年代以來(lái)，己先后有人對(duì)該基因的克隆與表達(dá)作過(guò)研究，并發(fā)現(xiàn)葡激酶若與抗凝劑共同應(yīng)用時(shí)，其溶栓效力明顯加強(qiáng)。而Annexin V是從人胎盤及臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞提取的一種分子量為36kD的鈣結(jié)合蛋白，具有很好的抗栓作用，最近已有研究表明，它不僅具有抗凝作用，而且對(duì)以活化血小板及纖維蛋白為主要成分的血栓有特異性，因而它是一種發(fā)展血栓靶向性的溶栓藥物的優(yōu)良載體。國(guó)外曾有人用化學(xué)方法獲取了Annexin V與尿激酶B鏈的偶聯(lián)產(chǎn)物，其溶栓活性比尿激酶提高了近4倍。但目前尚未有報(bào)道將葡激酶與抗凝劑融合一起，制備靶向性溶栓藥物。
本發(fā)明的目的是通過(guò)基因工程方法構(gòu)建葡激酶與Annexin V融合基因。
本發(fā)明公開的葡激酶與Annexin V融合蛋白大小為53KD，由水蛭素C端12肽將葡激酶與Annexin V鉸鏈起來(lái)。
本發(fā)明的另一目的是公開葡激酶與Annexin V融合基因在家蠶中和大腸桿菌中的表達(dá)。
本發(fā)明公開的葡激酶與Annexin V融合基因在家蠶中的表達(dá)包括下列步驟1.材料與方法1.1材料1.1.1菌種、質(zhì)粒、病毒和細(xì)胞株金黃色葡萄球菌、質(zhì)粒pBS-SK(+)、pBacPAK8、pETUKAV、大腸桿菌TGl、家蠶核型多角體病毒BmNPV、家蠶細(xì)胞BmN4均由上海生化所及上海動(dòng)物生物技術(shù)中心保存。1.1.2主要酶類及其他生化試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Klenow酶為Gibco BRL公司產(chǎn)品；X-Gal，IPTG，Nick Translation Kit為Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶為Promega公司產(chǎn)品；[α-35S]-ATP為Amersham公司產(chǎn)品；T7DNA Kit為USB公司產(chǎn)品。CNBr-Saphorose4B為Sigma公司產(chǎn)品。兔抗葡激酶多抗血清自制。1.2方法1.2.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)抽取金黃色葡萄球菌菌體DNA作為模板，按照常規(guī)PCR反應(yīng)條件，以下列參數(shù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃1min；55℃40min；72℃1min；循環(huán)結(jié)束后自動(dòng)延伸10min。1.2.2PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定利用PCR產(chǎn)物兩端的酶切位點(diǎn)，將其克隆進(jìn)質(zhì)粒pBS-SK(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，參照USB公司產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行DNA序列測(cè)定。經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的SAK基因片段克隆與進(jìn)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8中。質(zhì)粒抽提、酶切反應(yīng)、電泳鑒定、DNA片段回收、連接反應(yīng)和大腸桿菌轉(zhuǎn)化均參考文獻(xiàn)，稍加修改后進(jìn)行。1.2.3重組病毒的構(gòu)建及篩選參考Summers的方法，將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與線性化病毒在脂質(zhì)體(Lipofection)作用下共轉(zhuǎn)染BmN4細(xì)胞。27℃培養(yǎng)4天后，收集上清分別作1×10-3、1×10-4、1×10-5稀釋，分別感染1×105BmN4細(xì)胞1小時(shí)，鋪上含0.2mg/ml X-gal的低熔點(diǎn)瓊脂糖。27℃，4天后，出現(xiàn)藍(lán)白空斑，挑取多個(gè)白斑于24孔培養(yǎng)板(1×104細(xì)胞/孔)，27℃培養(yǎng)72小時(shí)，收集上清保存。細(xì)胞進(jìn)行Dot-blot雜交篩斑，參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。共3次雜交篩選至獲得純的重組病毒。1.2.4SakAV融合基因的表達(dá)經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的重組病毒及空載體病毒，用TC-100無(wú)血清、無(wú)抗生素培養(yǎng)基10倍稀釋，分別在5齡起家蠶以及蠶蛹的環(huán)節(jié)進(jìn)行皮下注射，10μl/頭。室溫培養(yǎng)4-5天后，收集家蠶血淋巴用作SDS-PAGE及Western-blot檢測(cè)。1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)方法略加修改，用0.1mol/L PBS pH7.4配制1.4％瓊脂糖，水浴煮溶后取5ml與37℃預(yù)熱的人纖維蛋白原(2mg/ml)及0.2ml42℃預(yù)熱的凝血酶(50U/ml)混合，傾入平皿中，待凝固后，點(diǎn)加10-1、5×10-2、10-2、10-3PBS稀釋的家蠶血淋巴，各20μl。于濕盒中37℃孵育18小時(shí)。檢測(cè)溶解圈大小。以己知比活的葡激酶作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，空載體病毒注射的家蠶血淋巴作陰性對(duì)照。1.2.6表達(dá)產(chǎn)物的純化家蠶液5ml用PBS緩沖液稀釋至10ml，用孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)，后參照產(chǎn)品說(shuō)明介紹，用自制抗葡激酶抗體親和柱法純化蠶蛹中表達(dá)產(chǎn)物。SDS-PAGE凝膠電泳和Western-blot免疫印跡檢測(cè)純化結(jié)果。2.結(jié)果2.1PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定為了使葡激酶與Annexin V的融合蛋白各自保持正確的空間結(jié)構(gòu)，我們以具有抗凝活性的水蛭素C端12肽作為連接肽。根據(jù)葡激酶序列以及水蛭素C端12肽的核苷酸序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物P15’-GAGGATTCATGTCAAGTTCATTCGACAAAGG-3’；P25’-GGCTCGAGTTTCTTTTCTATAACAACCTTTG-3’，以質(zhì)粒pJLA(50+)DNA為模板，參照己發(fā)表Sak基因序列設(shè)計(jì)的引物，用PCR方法擴(kuò)增出一段大小為240bp左右DNA片段，克隆進(jìn)質(zhì)粒pBS-SK(+)的BamH I和Xho I位點(diǎn)之間。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析證實(shí)Sak基因序列與文獻(xiàn)所報(bào)道的序列相差3個(gè)堿基。共編碼136個(gè)氨基酸。其中葡激酶基因序列如下GGATTCATGTCAAGTTCATTCGACAAATATAAAAAAGGCGATGACGCGAGTTATTTTGAACCAACAMet S S S F D K Y K K G D D A S Y F E P TGGCCCGTATTTGATGGTAAATGTGACTGGAGTTGATAGTAAAGGAAATGAATTGCTATCCCCTCATG P Y L Met V N V T G V D S K G N E L L S P HTATGTCGAGTTTCCATTAAACCTGGGACTACACTTACAAAAGAAAAAATTGAATACTATGTCGAAY V E F P I K P G T T L T K E K I E Y Y V ETGGGCATTAGATGCGACAGCATATAAAGAGTTTAGGGTAGTTGAATTAGATCCAAGCGCAAAGATCW A L D A T A Y K E F R V V E L D P S A K IGAAGTCACTTATTATGATAAGAATAAGAAAAAAGAAGAAACGAAGTCTTTCCCTATAACAGAAAAAE V T Y Y D K N K K K E E T K S F P I T E KGGTTTTGTTGTCCCAGATTTATCAGAGCATATTAAAAACCCTGGATTCAACTTAATTACAAAGGTTG F V V P D L S E H I K N P G F N L I T K VGTTATAGAAAAGAAAGCCCTCGGCGATTTCGAAGAAATTCCAGAAGAATATCTCGAGV I E K K A L G D F E E I P E E Y其中AAA AGT AGG表示與已知基因序列不同的三個(gè)密碼子。2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆在質(zhì)粒pBS-SK(+)經(jīng)過(guò)BamH I和Xho I雙酶切的Sak基因片段、pETUKAV質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Xho I和Hind III雙酶切的Annexin V基因片段以及經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8一起低熔點(diǎn)回收后共連接，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8-SakAV見(jiàn)

圖1重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8-SakAV的構(gòu)建2.3重組病毒Bm-SakAV的篩選第1輪空斑篩選，共挑出24個(gè)白斑，利用32P-Sak標(biāo)記探針篩選出16個(gè)陽(yáng)性克隆。選出其中的2個(gè)陽(yáng)性斑經(jīng)第2、3輪空斑篩選，最終得到純化的重組病毒。2.4SakAV融合基因在家蠶幼蟲中的表達(dá)重組病毒Bm-SakAV接種家蠶蛹，經(jīng)過(guò)4-5天的室溫培養(yǎng)，對(duì)蠶蛹血淋巴作SDS-PAGE及Western-blot分析，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物的大小約為53kD見(jiàn)圖2蠶蛹淋巴液中融合基因的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析以及Western-blot免疫印記其中1、2為接種重組病毒Bm-SakAV的蠶蛹淋巴液；3接種病毒BmNPV的蠶蛹淋巴液；M蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；4接種病毒Bm-SakAV的蠶蛹淋巴液；5未接種病毒的蠶蛹淋巴液；2.5融合蛋白的純化結(jié)果SDS-PAGE凝膠電泳和Western-blot免疫印跡表明表達(dá)產(chǎn)物約為53Kd左右，與理論大小一致。見(jiàn)圖3純化的融合蛋白SDS-PAGE電泳及Western-blot免疫印記；1、2、3、4為不同管收集的提純蛋白；蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量(94,000；67,000；43,000；30,000；20,000；14,000)；5蛋白樣品。
本發(fā)明的再一目的是公開葡激酶與Annexin V融合基因作為強(qiáng)溶栓性、靶向性溶栓藥物的應(yīng)用。
家蠶及蠶蛹體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物的活性測(cè)定結(jié)果溶解圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的纖溶活性見(jiàn)圖4接種病毒的蠶蛹及家蠶幼蟲淋巴細(xì)胞的纖溶活性檢測(cè)，其中作10-3倍稀釋的樣品纖溶圈與已知比活(5萬(wàn)IU/mg)的葡激酶5IU的纖溶圈大小相當(dāng)。據(jù)此可以粗略估計(jì)出每條家蠶所表達(dá)的葡激酶約為25萬(wàn)IU(以每條家蠶取1ml血液計(jì)算)。即相當(dāng)于作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的葡激酶5mg。
圖4中，外圈標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照葡激酶的不同比活1U，2U，3U，4U，5U中圈不同的稀釋度的家蠶幼蟲淋巴液A10-3，B10-2，C5×10-2.D100-1內(nèi)圈不同的稀釋度的蠶蛹的淋巴液A110-3，B110-2，Cl5×10-2本發(fā)明公開的葡激酶與Annexin V融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)包括下列步驟1材料與方法1.1材料1.1.1菌種、質(zhì)粒質(zhì)粒pJLA(50+)由上海植物生理研究所惠贈(zèng)，質(zhì)粒pBS-SK(+)、pET-28a(+)、pETUKAV、大腸桿菌TG1、BL21(DE3)均由上海生化所和上海動(dòng)物生物技術(shù)中心保存。1.1.2主要酶類及其他生化試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Klenow酶為Gibco BRL公司產(chǎn)品；X-Gal，IPTG為Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶為公司產(chǎn)品；[α-35S]-ATP為Amersham公司產(chǎn)品；T7DNA Kit為USB公司產(chǎn)品。1.1.3PCR引物為了使葡激酶與Annexin V融合蛋白能各自保持正確的空間結(jié)構(gòu)，我們以具有抗凝活性的水蛭素C端12肽作為連接肽。根據(jù)現(xiàn)已報(bào)道Sak基因序列及水蛭素C端12肽的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物P1、P2為了便于克隆和表達(dá)，P1、P2兩端分別引入了BamH I和Xoh I位點(diǎn)，引物由中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心合成。1.2方法1.2.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)質(zhì)粒pJLA(50+)作為模板，按照常規(guī)PCR反應(yīng)條件，以下列參數(shù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃1min；55℃40min；72℃1min；循環(huán)結(jié)束后自動(dòng)延伸10min。1.2.2PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定利用PCR產(chǎn)物兩端的酶切位點(diǎn)，將其克隆進(jìn)pBS-SK(+)質(zhì)粒中，參照USB公司產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行DNA序列測(cè)定。經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的Sak基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a(+)中。質(zhì)粒抽提、酶切反應(yīng)、電泳鑒定、DNA片段回收、連接反應(yīng)和大腸桿菌轉(zhuǎn)化均參考文獻(xiàn)，稍加修改后進(jìn)行。1.2.3融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)將表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a(+)-SakAV轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑取單克隆轉(zhuǎn)化菌37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按1％比例接種LB培養(yǎng)液(含50/ml卡那霉素)37℃培養(yǎng)至A600為0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在1h，2h，3h，4h，5h，6h，收取等量培養(yǎng)物，5000r/min離心5min，收集菌體。SDS-PAGE凝膠電泳，并觀察時(shí)相表達(dá)的變化情況。同時(shí)設(shè)置空載體轉(zhuǎn)化菌作誘導(dǎo)表達(dá)，作為陰性對(duì)照。1.24表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)方法略加修改進(jìn)行。用0.1mol/L PBS pH7.4配制1.4％瓊脂糖，水浴煮溶后取5ml與37℃預(yù)熱的人纖維蛋白原(2mg/ml)及0.2ml42℃預(yù)熱的凝血酶(50U/ml)混合，傾入平皿中，待凝固后，點(diǎn)加不同梯度稀釋的大腸桿菌裂解液。標(biāo)準(zhǔn)葡激酶作對(duì)照。于濕盒中37℃孵育18小時(shí)。檢測(cè)溶解圈大小。1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的純化將100ml誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于4℃5000r/min離心5min收集菌體，用0.2mol/lPBS(pH7.4)洗滌1次，用20mmol/lTris-HCl、1mmol/lEDTA、pH8.0的TE懸浮菌體，冰浴超聲波破菌，4℃12000g離心10min，取上清加入預(yù)先用平衡液(5mM咪唑，0.SMNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0)平衡的Ni(+)-NTB親和柱中，先以10倍體積的平衡液洗柱，再以6倍柱體積洗液(20mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0)洗脫雜蛋白，最后以6倍柱體積洗脫液(0.5M咪唑，0.SMNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0)洗脫目的蛋白，收集洗脫組份(1ml/組份)，每一洗脫組份取10μl進(jìn)行SDS-PAGE。2結(jié)果2.1PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定以質(zhì)粒DNA為模板，參照已發(fā)表Sak基因序列設(shè)計(jì)的引物，用PCR方法擴(kuò)增出一段大小為240左右DNA片段，克隆進(jìn)質(zhì)粒pBS-SK(+)的位點(diǎn)之間。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析證實(shí)該基因序列與文獻(xiàn)所報(bào)道的序列一致，共編碼136個(gè)氨基酸。該基因序列如下TATGAGGCCTTCAAATATAAAAAAGGCGATGACGCGAGTTATTTTGAACCAACAGGCCCGTATTTGATGGTAAATGTGACTGGAGTTGATAGTAAAGGAAATGAATTGCTATCCCCTCATTATGTCGAGTTTCCTATTAAACCTGGGACTACACTTACAAAAGAAAAAATTGAATACTATGTCGAATGGGCATTAGATGCGACAGCATATAAAGAGTTTAGGGTAGTTGAATTAGATCCAAGCGCAAAGATCGAAGTCACTTATTATGATAAGAATAAGAAAAAAGAAGAAACGAAGTCTTTCCCTATAACAGAAAAAGGTTTTGTTGTCCCAGATTTATCAGAGCATATTAAAAACCCTGGATTCAACTTAATTACAAAGGTTGTTATAGAAAAGAAAGCCCTCGGCGATTTCGAAGAAATTCCAGAAGAATATCTCGAGGCACAGGTTCTCAGAGGCACTGTGACT2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆在質(zhì)粒pBS-SK(+)中的Sak基因片段經(jīng)過(guò)BamH I和XohI雙酶切、低熔點(diǎn)回收后與預(yù)先經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒pET28a(+)相連接，構(gòu)建成重組表達(dá)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pET28a(+)-SakAV，見(jiàn)圖5重組表達(dá)載體pET28a(+)-SakAV的構(gòu)建。2.3SakAV在大腸桿菌中表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)2～6小時(shí)內(nèi)，表達(dá)的特異性融合蛋白逐步增加，24小時(shí)后表達(dá)水平已經(jīng)下降。從圖6IPTG誘導(dǎo)融合基因SakAV在大腸桿菌中表達(dá)SDS-PAGE電泳圖譜可以看出蛋白分子量約為53KD。2.4表達(dá)產(chǎn)物的活性測(cè)定結(jié)果取1ml IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌培養(yǎng)液，離心去上清，用20μl水懸浮沉淀，取1μl分別作10-1，2×10-2，10-2，10-3稀釋，取20μl點(diǎn)樣于平皿中。溶解圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的纖溶活性(圖7)。其中作10-3倍稀釋的樣品纖溶圈與已知比活(5萬(wàn)IU/mg)的葡激酶5IU的纖溶圈大小相當(dāng)。據(jù)此可以粗略估計(jì)出1ml大腸桿菌培養(yǎng)物所表達(dá)的葡激酶約為2500IU。2.5表達(dá)產(chǎn)物的純化結(jié)果從圖8SakAV融合蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，經(jīng)Ni(+)-NTB親和柱純化的目的蛋白純度可達(dá)90％以上。根據(jù)紫外分光光度法A280計(jì)算得出，重組蛋白表達(dá)量約為16mg/L大腸桿菌培養(yǎng)物。
本發(fā)明葡激酶基因共編碼136個(gè)氨基酸，是成熟肽該基因序列與文獻(xiàn)所報(bào)道的金黃色葡萄球菌溶原性噬菌體Sφ-C所分泌的葡激酶基因序列相差，同時(shí)，酶活性實(shí)驗(yàn)表明該表達(dá)產(chǎn)物具有較高的纖溶活性。由于葡激酶具有高纖維蛋白特異性，能高效激活血栓周圍的纖溶酶原，特異地溶解血栓而不誘發(fā)系統(tǒng)性纖溶狀態(tài)。此外由于Sak分子量小，穿透性能好，對(duì)富含血小板的血栓的溶解比其他溶栓藥物具有更強(qiáng)的療效。
隨著對(duì)血栓治療的深入認(rèn)識(shí)，近年來(lái)靶向性溶栓藥的研制已成為熱點(diǎn)。國(guó)外曾有人用化學(xué)方法獲取了Annexin V與尿激酶B鏈的偶聯(lián)產(chǎn)物，其溶栓活性比尿激酶提高了近4倍。本發(fā)明為了確保兩個(gè)融合蛋白的空間構(gòu)象不互相干擾，利用具有抗凝活性的水蛭素C端12肽，作為有高纖維親和性的葡激酶與有血小板親和性的Annexin V鉸鏈起來(lái)的“空中橋梁”，這樣有利于兩個(gè)蛋白的天然特性不發(fā)生改變。
昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種高效真核表達(dá)系統(tǒng)，與其他表達(dá)系統(tǒng)相比較，具有高產(chǎn)量、高生物活性的特性，正確完成蛋白翻譯后加工和糖基化修飾等功能，被廣泛用于外源基因的表達(dá)。本研究利用該表達(dá)系統(tǒng)在家蠶體內(nèi)成功地表達(dá)SakAV融合蛋白，根據(jù)SDS-PAGE蛋白電泳及Western-blot印跡結(jié)果，推算出該融合蛋白大小約為53kD。并同時(shí)對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明其具有較高的酶纖溶活性。每條家蠶體內(nèi)的表達(dá)量約為25萬(wàn)HU/ml，相當(dāng)于比活為5萬(wàn)IU/mg的葡激酶5mg。
本發(fā)明還利用抗葡激酶抗體親和柱一步法純化表達(dá)產(chǎn)物，得到比較純的蛋白，但鑒于家蠶淋巴成分比較復(fù)雜，有可能含有與表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似的蛋白成分，所以抗體親和柱一步法純化的蛋白含有少量的雜蛋白，還需進(jìn)一步完善純化該蛋白的實(shí)驗(yàn)室方法。
本發(fā)明在家蠶、蠶蛹體內(nèi)或大腸桿菌中表達(dá)的SakAV融合蛋白比較穩(wěn)定，在-20℃存放一段時(shí)間后作活性檢測(cè)，酶活性未發(fā)生明顯改變。這就避免了體外表達(dá)蛋白容易降解的矛盾。
本發(fā)明利用基因工程方法構(gòu)建了葡激酶與Annexin V融合基因，并在家蠶中或大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。酶活性測(cè)定表明產(chǎn)物具有較高的纖溶活性。這為研制新一代的靶向性溶栓藥物打下了基礎(chǔ)，具有廣泛的應(yīng)用前景。
本發(fā)明各圖分別表示圖1重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8-Sak-AV的構(gòu)建圖2蠶蛹淋巴液中融合基因的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析以及Western-blot免疫印記圖3純化的融合蛋白SDS-PAGE電泳及Western-blot免疫印記圖4接種病毒的蠶蛹及家蠶幼蟲淋巴細(xì)胞的纖溶活性檢測(cè)圖5重組表達(dá)載體pET28a(+)-SakAV的構(gòu)建圖6IPTG誘導(dǎo)融合基因SakAV在大腸桿菌中表達(dá)SDS-PAGE電泳圖譜圖7纖溶活性檢測(cè)結(jié)果圖8SakAV融合蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖譜實(shí)施例1 SakAV融合基因在家蠶中的表達(dá)1.1材料1.1.1菌種、質(zhì)粒、病毒和細(xì)胞株金黃色葡萄球菌、質(zhì)粒pBS-SK(+)、pBacPAK8、pETUKAV、大腸桿菌TG1、家蠶核型多角體病毒BmNPV、家蠶細(xì)胞BmN4均由上海生化所及上海動(dòng)物生物技術(shù)中心保存。1.1.2主要酶類及其他生化試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Klenow酶為Gibco BRL公司產(chǎn)品；X-Gal，IPTG，Nick Translation Kit為Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶為Promega公司產(chǎn)品；[α-35S]-ATP為Amersham公司產(chǎn)品；T7DNA Kit為USB公司產(chǎn)品。CNBr-Saphorose4B為Sigma公司產(chǎn)品。兔抗葡激酶多抗血清自制。1.2方法1.2.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)抽取金黃色葡萄球菌菌體DNA作為模板，按照常規(guī)PCR反應(yīng)條件，以下列參數(shù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃1min；55℃40min；72℃1min；循環(huán)結(jié)束后自動(dòng)延伸10min。1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定利用PCR產(chǎn)物兩端的酶切位點(diǎn)，將其克隆進(jìn)質(zhì)粒pBS-SK(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，參照USB公司產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行DNA序列測(cè)定。經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的Sak基因片段克隆與進(jìn)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8中。質(zhì)粒抽提、酶切反應(yīng)、電泳鑒定、DNA片段回收、連接反應(yīng)和大腸桿菌轉(zhuǎn)化均參考文獻(xiàn)，稍加修改后進(jìn)行。1.2.3重組病毒的構(gòu)建及篩選參考Summers的方法，將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與線性化病毒在脂質(zhì)體(Lipofection)作用下共轉(zhuǎn)染BmN4細(xì)胞。27℃培養(yǎng)4天后，收集上清分別作1×10-3、1×10-4、1×10-5稀釋，分別感染1×105BmN4細(xì)胞1小時(shí)，鋪上含0.2mg/ml X-gal的低熔點(diǎn)瓊脂糖。27℃，4天后，出現(xiàn)藍(lán)白空斑，挑取多個(gè)白斑于24孔培養(yǎng)板(1×104細(xì)胞/孔)，27℃培養(yǎng)72小時(shí)，收集上清保存。細(xì)胞進(jìn)行Dot-blot雜交篩斑，參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。共3次雜交篩選至獲得純的重組病毒。1.2.4SakAV融合基因的表達(dá)經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的重組病毒及空載體病毒，用TC-100無(wú)血清、無(wú)抗生素培養(yǎng)基10倍稀釋，分別在5齡起家蠶以及蠶蛹的環(huán)節(jié)進(jìn)行皮下注射，10μl/頭。室溫培養(yǎng)4-5天后，收集家蠶血淋巴用作SDS-PAGE及Western-blot檢測(cè)。1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)方法略加修改，用0.1mol/L PBS pH7.4配制1.4％瓊脂糖，水浴煮溶后取5ml與37℃預(yù)熱的人纖維蛋白原(2mg/ml)及0.2ml42℃預(yù)熱的凝血酶(50U/ml)混合，傾入平皿中，待凝固后，點(diǎn)加10-1、5×10-2、10-2、10-3PBS稀釋的家蠶血淋巴，各20μl。于濕盒中37C孵育18小時(shí)。檢測(cè)溶解圈大小。以已知比活的葡激酶作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，空載體病毒注射的家蠶血淋巴作陰性對(duì)照。1.2.6表達(dá)產(chǎn)物的純化家蠶液5ml用PBS緩沖液稀釋至10ml，用孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)，后參照產(chǎn)品說(shuō)明介紹，用自制抗葡激酶抗體親和柱法純化蠶蛹中表達(dá)產(chǎn)物。SDS-PAGE凝膠電泳和Western-blot免疫印跡檢測(cè)純化結(jié)果。2.結(jié)果2.1PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定為了使葡激酶與Annexin V的融合蛋白各自保持正確的空間結(jié)構(gòu)，我們以具有抗凝活性的水蛭素C端12肽作為連接肽。根據(jù)葡激酶序列以及水蛭素C端12肽的核苷酸序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物P15’-GAGGATTCATGTCAAGTTCATTCGACAAAGG-3’；P25’-GGCTCGAGTTTCTTTTCTATAACAACCTTTG-3’，以質(zhì)粒pJLA(50+)DNA為模板，參照己發(fā)表Sak基因序列設(shè)計(jì)的引物，用PCR方法擴(kuò)增出一段大小為240bp左右DNA片段，克隆進(jìn)質(zhì)粒pBS-SK(+)的BamH I和Xho I位點(diǎn)之間。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析證實(shí)Sak基因序列與文獻(xiàn)所報(bào)道的序列相差3個(gè)堿基。共編碼136個(gè)氨基酸。2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆在質(zhì)粒pBS-SK(+)經(jīng)過(guò)BamH I和Xho I雙酶切的Sak基因片段、pETUKAV質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Xho I和Hind III雙酶切的Annexin V基因片段以及經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8一起低熔點(diǎn)回收后共連接，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8-SakAV(圖1)。
圖1重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8-Sak-AV的構(gòu)建2.3重組病毒Bm-SakAV的篩選第1輪空斑篩選，共挑出24個(gè)白斑，利用32P-Sak標(biāo)記探針篩選出16個(gè)陽(yáng)性克隆。選出其中的2個(gè)陽(yáng)性斑經(jīng)第2、3輪空斑篩選，最終得到純化的重組病毒。2.4SakAV融合基因在家蠶幼蟲中的表達(dá)重組病毒Bm-SakAV接種家蠶蛹，經(jīng)過(guò)4-5天的室溫培養(yǎng)，對(duì)蠶蛹血淋巴作SDS-PAGE及Western-blot分析，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物的大小約為53kD(圖2)。
圖2蠶蛹淋巴液中融合基因的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析以及Western-blot免疫印記
1，2接種重組病毒Bm-SakAV的蠶蛹淋巴液；3接種空病毒BmNPV的蠶蛹淋巴液；M蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；4接種病毒Bm-SakAV的蠶蛹淋巴液；5未接種病毒的蠶蛹淋巴液；2.5融合蛋白的純化結(jié)果SDS-PAGE凝膠電泳和Western-blot免疫印跡(圖3)表明表達(dá)產(chǎn)物約為53Kd左右，與理論大小一致。
圖3純化的融合蛋白SDS-PAGE電泳及Western-blot免疫印記1，2，3，4不同管收集的提純蛋白；蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量(94,000；67,000；43,000；30,000；20,000；14,000)；5蛋白樣品；家蠶及蠶蛹體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物的活性測(cè)定結(jié)果溶解圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的纖溶活性(圖4)。其中作10-3倍稀釋的樣品纖溶圈與已知比活(5萬(wàn)IU/mg)的葡激酶5IU的纖溶圈大小相當(dāng)。據(jù)此可以粗略估計(jì)出每條家蠶所表達(dá)的葡激酶約為25萬(wàn)IU(以每條家蠶取1ml血液計(jì)算)。即相當(dāng)于作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的葡激酶5mg。圖4接種病毒的蠶蛹及家蠶幼蟲淋巴細(xì)胞的纖溶活性檢測(cè)外圈標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照葡激酶的不同比活1U，2U，3U，4U，5U中圈不同的稀釋度的家蠶幼蟲淋巴液A10-3，B10-2，C5×10-2，D10-1內(nèi)圈不同的稀釋度的蠶蛹的淋巴液A110-3，B110-2，C15×10-2實(shí)施例2 SakAV融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)1材料與方法1.1材料1.1.1菌種、質(zhì)粒質(zhì)粒pJLA(50+)由上海植物生理研究所惠贈(zèng)，質(zhì)粒pBS-SK(+)、pET-28a(+)、pETUKAV、大腸桿菌TG1、BL21(DE3)均由上海生化所和上海動(dòng)物生物技術(shù)中心保存。1.1.2主要酶類及其他生化試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Klenow酶為Gibco BRL公司產(chǎn)品；X-Gal，IPTG為Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶為公司產(chǎn)品；[α-35S]-ATP為Amersham公司產(chǎn)品，T7DNAKit為USB公司產(chǎn)品。1.1.3PCR引物為了使葡激酶與Annexin V融合蛋白能各自保持正確的空間結(jié)構(gòu)，我們以具有抗凝活性的水蛭素C端12肽作為連接肽。根據(jù)現(xiàn)已報(bào)道Sak基因序列及水蛭素C端12肽的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物P1、P2為了便于克隆和表達(dá)，P1、P2兩端分別引入了BamH I和Xoh I位點(diǎn)，引物由中國(guó)科學(xué)院上海生物工程研究中心合成。1.2方法1.2.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)質(zhì)粒pJLA(50+)作為模板，按照常規(guī)PCR反應(yīng)條件，以下列參數(shù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃1min；55℃40min；72℃1min；循環(huán)結(jié)束后自動(dòng)延伸10min。1.2.2PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定利用PCR產(chǎn)物兩端的酶切位點(diǎn)，將其克隆進(jìn)pBS-SK(+)質(zhì)粒中，參照USB公司產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行DNA序列測(cè)定。經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的SAK基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a(+)中。質(zhì)粒抽提、酶切反應(yīng)、電泳鑒定、DNA片段回收、連接反應(yīng)和大腸桿菌轉(zhuǎn)化均參考文獻(xiàn)，稍加修改后進(jìn)行。1.2.3融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)將表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a(+)-SakAV轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。挑取單克隆轉(zhuǎn)化菌37℃搖振培養(yǎng)過(guò)夜，按1％比例接種LB培養(yǎng)液(含50/ml卡那霉素)37℃培養(yǎng)至A600為0.4～0.6時(shí)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在1h，2h，3h，4h，5h，6h，收取等量培養(yǎng)物，5000r/min離心5min，收集菌體。SDS-PAGE凝膠電泳，并觀察時(shí)相表達(dá)的變化情況。同時(shí)設(shè)置空載體轉(zhuǎn)化菌作誘導(dǎo)表達(dá)，作為陰性對(duì)照。1.2.4表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)方法略加修改進(jìn)行。用0.1mol/L PBS pH7.4配制1.4％瓊脂糖，水浴煮溶后取5ml與37℃預(yù)熱的人纖維蛋白原(2mg/ml)及0.2ml42℃預(yù)熱的凝血酶(50U/ml)混合，傾入平皿中，待凝固后，點(diǎn)加不同梯度稀釋的大腸桿菌裂解液。標(biāo)準(zhǔn)葡激酶作對(duì)照。于濕盒中37℃孵育18小時(shí)。檢測(cè)溶解圈大小。1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的純化將100ml誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于4℃5000r/min離心5min收集菌體，用0.2mol/lPBS(pH7.4)洗滌1次，用20mmol/lTris-HCl、1mmol/lEDTA、pH8.0的TE懸浮菌體，冰浴超聲波破菌，4℃12000g離心10min，取上清加入預(yù)先用平衡液(5mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0)平衡的Ni(+)-NTB親和柱中，先以10倍體積的平衡液洗柱，再以6倍柱體積洗液(20mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0)洗脫雜蛋白，最后以6倍柱體積洗脫液(0.5M咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0)洗脫目的蛋白，收集洗脫組份(1ml/組份)，每一洗脫組份取10μl進(jìn)行SDS-PAGE。2結(jié)果2.1PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定以質(zhì)粒DNA為模板，參照已發(fā)表Sak基因序列設(shè)計(jì)的引物，用PCR方法擴(kuò)增出一段大小為240左右DNA片段，克隆進(jìn)質(zhì)粒pBS-SK(+)的位點(diǎn)之間。經(jīng)過(guò)測(cè)序分析證實(shí)該基因序列與文獻(xiàn)所報(bào)道的序列一致，共編碼136個(gè)氨基酸。該基因序列如下TATGAGGCCTTCAAATATAAAAAAGGCGATGACGCGAGTTATTTTGAACCAACAGGCCCGTATTTGATGGTAAATGTGACTGGAGTTGATAGTAAAGGAAATGAATTGCTATCCCCTCATTATGTCGAGTTTCCTATTAAACCTGGGACTACACTTACAAAAGAAAAAATTGAATACTATGTCGAATGGGCATTAGATGCGACAGCATATAAAGAGTTTAGGGTAGTTGAATTAGATCCAAGCGCAAAGATCGAAGTCACTTATTATGATAAGAATAAGAAAAAAGAAGAAACGAAGTCTTTCCCTATAACAGAAAAAGGTTTTGTTGTCCCAGATTTATCAGAGCATATTAAAAACCCTGGATTCAACTTAATTACAAAGGTTGTTATAGAAAAGAAAGCCCTCGGCGATTTCGAAGAAATFCCAGAAGAATATCTCGAGGCACAGGTTCTCAGAGGCACTGTGACT2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆在質(zhì)粒pBS-SK(+)中的Sak基因片段經(jīng)過(guò)BamHI和XohI雙酶切、低熔點(diǎn)回收后與預(yù)先經(jīng)同樣雙酶切的載體質(zhì)粒pET28a(+)相連接，構(gòu)建成重組表達(dá)載體質(zhì)粒pET28a(+)-SakAV，見(jiàn)圖5重組表達(dá)載體pET28a(+)-SaKAV的構(gòu)建。2.3SakAV在大腸桿菌中表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)2～6小時(shí)內(nèi)，表達(dá)的特異性融合蛋白逐步增加，24小時(shí)后表達(dá)水平已經(jīng)下降。從圖6IPTG誘導(dǎo)融合基因SakAV在大腸桿菌中表達(dá)SDS-PAGE電泳圖譜可以看出蛋白分子量約為53KD。2.4表達(dá)產(chǎn)物的活性測(cè)定結(jié)果取1ml IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌培養(yǎng)液，離心去上清，用20μl水懸浮沉淀，取1μl分別作10-1，2×10-2，10-2，10-3稀釋，取20μl點(diǎn)樣于平皿中。溶解圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的纖溶活性(圖7)。其中作10-3倍稀釋的樣品纖溶圈與已知比活(5萬(wàn)IU/mg)的葡激酶5IU的纖溶圈大小相當(dāng)。據(jù)此可以粗略估計(jì)出1ml大腸桿菌培養(yǎng)物所表達(dá)的葡激酶約為2500IU。2.5表達(dá)產(chǎn)物的純化結(jié)果從圖8SakAV融合蛋白純化的SDS-PAGE電泳圖譜可以看出，經(jīng)Ni(+)-NTB親和柱純化的目的蛋白純度可達(dá)90％以上。根據(jù)紫外分光光度法A280計(jì)算得出，重組蛋白表達(dá)量約為16mg/L大腸桿菌培養(yǎng)物。
權(quán)利要求
1.一種葡激酶與Annexin V融合基因，其特征在于該融合基因大小為53KD，由水蛭素C端12肽將葡激酶與Annexin V鉸鏈起來(lái)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的葡激酶與Annexin V融合基因在家蠶中的表達(dá)，其特征在于該表達(dá)包括下列步驟(1)材料與方法1.1材料1.1.1菌種、質(zhì)粒、病毒和細(xì)胞株金黃色葡萄球菌、質(zhì)粒pBS-SK(+)、pET-28a(+)、pBacPAK8、大腸桿菌TG1、家蠶核型多角體病毒BmNPV、家蠶細(xì)胞BmN4；1.1.2主要酶類及其他生化試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Klenow酶；X-Gal，IPTG，NickTranslation Kit；TaqDNA聚合酶；[α-35S]-ATP；T7DNA Kit；CNBr-Saphorose4B；兔抗葡激酶多抗血清；1.2方法1.2.1聚合酶鏈反應(yīng)抽取金黃色葡萄球菌菌體DNA作為模板，按照常規(guī)PCR反應(yīng)條件，以下列參數(shù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃1min；55℃40min；72℃1min；循環(huán)結(jié)束后自動(dòng)延伸10min。1.2.2PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定.利用PCR產(chǎn)物兩端的酶切位點(diǎn)，將其克隆進(jìn)質(zhì)粒pBS-SK(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，參照USB公司產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行DNA序列測(cè)定。經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的Sak基因片段克隆與進(jìn)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8中。質(zhì)粒抽提、酶切反應(yīng)、電泳鑒定、DNA片段回收、連接反應(yīng)和大腸桿菌轉(zhuǎn)化均參考文獻(xiàn)，稍加修改后進(jìn)行；1.2.3重組病毒的構(gòu)建及篩選參考Summers的方法，將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒與線性化病毒在脂質(zhì)體作用下共轉(zhuǎn)染BmN4細(xì)胞；27℃培養(yǎng)4天后，收集上清分別作1×10-3、1×10-4、1×10-5稀釋，分別感染1×105BmN4細(xì)胞1小時(shí)，鋪上含0.2mg/ml X-gal的低熔點(diǎn)瓊脂糖；27℃，4天后，出現(xiàn)藍(lán)白空斑，挑取多個(gè)白斑于24孔培養(yǎng)板(1×104細(xì)胞/孔)，27℃培養(yǎng)72小時(shí)，收集上清保存；細(xì)胞進(jìn)行Dot-blot雜交篩斑，參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行；共3次雜交篩選至獲得純的重組病毒；1.2.4SakAV融合基因的表達(dá)經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的重組病毒及空載體病毒，用TC-100無(wú)血清、無(wú)抗生素培養(yǎng)基10倍稀釋，分別在5齡起家蠶以及蠶蛹的環(huán)節(jié)進(jìn)行皮下注射，10μl/頭；室溫培養(yǎng)4-5天后，收集家蠶血淋巴用作SDS-PAGE及Western-blot檢測(cè)；1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)方法略加修改，用0.1mol/L PBS pH7.4配制1.4％瓊脂糖，水浴煮溶后取5ml與37℃預(yù)熱的人纖維蛋白原(2mg/ml)及0.2ml 42℃預(yù)熱的凝血酶(50U/ml)混合，傾入平皿中，待凝固后，點(diǎn)加10-1、5×10-2、10-2、10-3PBS稀釋的家蠶血淋巴，各20μl；于濕盒中37℃孵育18小時(shí)；檢測(cè)溶解圈大小。以已知比活的葡激酶作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，空載體病毒注射的家蠶血淋巴作陰性對(duì)照；1.2.6表達(dá)產(chǎn)物的純化家蠶液5ml用PBS緩沖液稀釋至10ml，用孔徑為0.45μm的濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)，用抗葡激酶抗體親和柱法純化蠶蛹中表達(dá)產(chǎn)物；SDS-PAGE凝膠電泳和Western-blot免疫印跡檢測(cè)純化結(jié)果；(2)結(jié)果2.1PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定以具有抗凝活性的水蛭素C端12肽作為連接肽，根據(jù)葡激酶序列以及水蛭素C端12肽的核苷酸序列，以一對(duì)引物P15’-GAGGATTCATGTCAAGTTCATTCGACAAAGG-3’；P25’-GGCTCGAGTTTCTT TTCTATAACAACCTTTG-3’，以質(zhì)粒pJLA(50+)DNA為模板，參照已發(fā)表SAK基因序列設(shè)計(jì)的引物，用PCR方法擴(kuò)增出一段大小為240bp左右DNA片段，克隆進(jìn)質(zhì)粒pBS-SK(+)的BamH I和Xho I位點(diǎn)之間；經(jīng)過(guò)測(cè)序分析證實(shí)Sak基因序列與文獻(xiàn)所報(bào)道的序列相差3個(gè)堿基。2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆在質(zhì)粒pBS-SK(+)經(jīng)過(guò)BamH I和Xho I雙酶切的Sak基因片段、pETUKAV質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Xho I和Hind III雙酶切的AnnexinV基因片段以及經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8一起低熔點(diǎn)回收后共連接，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8-SakAV；2.3重組病毒Bm-SakAV的篩選第1輪空斑篩選，共挑出24個(gè)白斑，利用32P-Sak標(biāo)記探針篩選出16個(gè)陽(yáng)性克隆；選出其中的2個(gè)陽(yáng)性斑經(jīng)第2、3輪空斑篩選，最終得到純化的重組病毒；2.4 SakAV融合基因在家蠶幼蟲中的表達(dá)重組病毒Bm-SakAV接種家蠶蛹，經(jīng)過(guò)4-5天的室溫培養(yǎng)，對(duì)蠶蛹血淋巴作SDS-PAGE及Western-blot分析，結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物的大小約為53kD。
3.一種如權(quán)利要求1所述的葡激酶與Annexin V融合基因在大腸桿菌中表達(dá)，其特征在于該表達(dá)包括下列步驟(1)材料與方法1.1材料1.1.1菌種、質(zhì)粒質(zhì)粒pJLA(50+)，質(zhì)粒pBS-SK(+)、pET-28a(+)、pETUKAV、大腸桿菌TG1、BL21(DE3)；1.1.2主要酶類及其他生化試劑限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Klenow酶；X-Gal，IPTG；TaqDNA聚合酶；[α-35S]-ATP；T7DNA Kit；1.1.3PCR引物以具有抗凝活性的水蛭素C端12肽作為連接肽；根據(jù)現(xiàn)已報(bào)道Sak基因序列及水蛭素C端12肽的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物P1、P2為了便于克隆和表達(dá)，P1、P2兩端分別引入了BamH I和Xoh I位點(diǎn)；1.2方法1.2.1聚合酶鏈反應(yīng)質(zhì)粒pJLA(50+)作為模板，按照常規(guī)PCR反應(yīng)條件，以下列參數(shù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃1min；55℃40min；72℃1min；循環(huán)結(jié)束后自動(dòng)延伸10min；1.2.2PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定利用PCR產(chǎn)物兩端的酶切位點(diǎn)，將其克隆進(jìn)pBS-SK(+)質(zhì)粒中，參照USB公司產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行DNA序列測(cè)定；經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的Sak基因片段克隆進(jìn)表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a(+)中；質(zhì)粒抽提、酶切反應(yīng)、電泳鑒定、DNA片段回收、連接反應(yīng)和大腸桿菌轉(zhuǎn)化均文獻(xiàn)方法進(jìn)行；1.2.3融合基因在大腸桿菌中的表達(dá)將表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a(+)-SakAV轉(zhuǎn)化大腸桿菌；挑取單克隆轉(zhuǎn)化菌37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按1％比例接種LB培養(yǎng)液，其中含50/ml卡那霉素，37℃培養(yǎng)至A600為0.4-0.6時(shí)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在1h，2h，3h，4h，5h，6h，收取等量培養(yǎng)物，5000r/min離心5min，收集菌體；SDS-PAGE凝膠電泳，并觀察時(shí)相表達(dá)的變化情況；同時(shí)設(shè)置空載體轉(zhuǎn)化菌作誘導(dǎo)表達(dá)，作為陰性對(duì)照；1.2.4表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)方法用0.1mol/LPBS pH7.4配制1.4％瓊脂糖，水浴煮溶后取5ml與37℃預(yù)熱的2mg/ml人纖維蛋白原及0.2ml 42℃預(yù)熱的50U/ml凝血酶混合，傾入平皿中，待凝固后，點(diǎn)加不同梯度稀釋的大腸桿菌裂解液；標(biāo)準(zhǔn)葡激酶作對(duì)照；于濕盒中37℃孵育18小時(shí)；檢測(cè)溶解圈大?。?.2.5表達(dá)產(chǎn)物的純化將100ml誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液于4℃5000r/min離心5min收集菌體，用0.2mol/lPBS pH7.4洗滌1次，用20mmol/lTris-HCl、1mmol/lEDTA、pH8.0的TE懸浮菌體，冰浴超聲波破菌，4℃12000g離心10min，取上清加入預(yù)先用5mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0構(gòu)成的平衡液平衡Ni(+)-NTB親和柱中，先以10倍體積的平衡液洗柱，再以6倍柱體積由20mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0構(gòu)成的洗液洗脫雜蛋白，最后以6倍柱體積由0.5M咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-HCl，pH8.0構(gòu)成的洗脫液洗脫目的蛋白，收集洗脫1ml/組份的組份，每一洗脫組份取10μl進(jìn)行SDS-PAGE；(2)結(jié)果2.1PCR產(chǎn)物的克隆以質(zhì)粒DNA為模板，參照已發(fā)表Sak基因序列設(shè)計(jì)的引物，用PCR方法擴(kuò)增出一段大小為240bp左右DNA片段，克隆進(jìn)質(zhì)粒pBS-SK(+)的位點(diǎn)之間；2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆在質(zhì)粒pBS-SK(+)中的Sak基因片段經(jīng)過(guò)BamH I和Xoh I雙酶切、低熔點(diǎn)回收后與預(yù)先經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒pET28a(+)相連接，構(gòu)建成重組表達(dá)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pET28a(+)-SakAV。2.3SakAV在大腸桿菌中表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)2-6小時(shí)內(nèi)，表達(dá)的特異性融合蛋白逐步增加，24小時(shí)后表達(dá)水平已經(jīng)下降；蛋白分子量約為53KD；2.4表達(dá)產(chǎn)物的活性測(cè)定結(jié)果取1ml IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌培養(yǎng)液，離心去上清，用20μl水懸浮沉淀，取1μl分別作10-1，2×10-2，10-2，10-3稀釋，取20μl點(diǎn)樣于平皿中，表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的纖溶活性；1ml大腸桿菌培養(yǎng)物所表達(dá)的葡激酶約為2500IU；2.5表達(dá)產(chǎn)物的純化結(jié)果經(jīng)Ni(+)-NTB親和柱純化的目的蛋白純度可達(dá)90％以上；根據(jù)紫外分光光度法A280計(jì)算得出，重組蛋白表達(dá)量約為16mg/L大腸桿菌培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及葡激酶與Annexin V融合基因的構(gòu)建及在家蠶中和大腸桿菌中的表達(dá)。本發(fā)明公開的葡激酶與Annexin V融合蛋白大小為53KD,由水蛭素C端12肽將葡激酶與Annexin V鉸鏈起來(lái)。本發(fā)明利用基因工程方法構(gòu)建了葡激酶與Annexin V融合基因,并在家蠶中和大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。酶活性測(cè)定表明產(chǎn)物具有較高的纖溶活性,這為研制新一代的靶向性溶栓藥物打下了基礎(chǔ),具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1343777SQ0111312
公開日2002年4月10日 申請(qǐng)日期2001年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月26日
發(fā)明者林矯矯, 吳祥甫, 倪振亞, 蔡幼民, 傅志強(qiáng), 馮新港 申請(qǐng)人:上海動(dòng)物生物技術(shù)研究中心