專利名稱：用于甜瓜枯萎病抗性鑒定的功能性分子標(biāo)記一及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蔬菜抗病分子標(biāo)記育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甜瓜枯萎病抗性基因 Fom-2功能性分子標(biāo)記及其應(yīng)用，從而為甜瓜枯萎病抗性的標(biāo)記輔助選擇提供一種新型分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
甜瓜(Cocumis melo L.)作為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物中一種重要的園藝作物，具有較高的商業(yè)品價值和經(jīng)濟(jì)價值，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。近年來隨著甜瓜種質(zhì)資源商品化和種植面積的不斷擴大，病蟲害發(fā)生日益嚴(yán)重，迫使生產(chǎn)上大量使用化學(xué)試劑，嚴(yán)重影響了甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)(Sherf and MacNab 1986)。其中甜瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的一種世界范圍內(nèi)毀滅性的土傳病害，導(dǎo)致甜瓜90%以上的經(jīng)濟(jì)損失 (Leach JG1938 ；Martyn RD 1987)。目前已經(jīng)鑒定分離得到4種枯萎病菌生理小種，分別為生理小種0，1，2和1-2。遺傳分析表明，2個獨立的基因Fom-I和Fom-2分別控制對生理小種 0，2 和 0，1 的抗性(Risser et al. 1976 ；Risser and Mas 1965 ；Robinson et al. 1976)。其中！^0111-2基因已經(jīng)通過圖位克隆的方法得到分離(Joobeur et al. 2004)。 Fom-2 基因?qū)儆?NBS-LRR 類的 R 基因，這類基因編碼 NBS (nucleotide binding site, NBS) 和LRRdeucine-rich repeat, LRR)兩個比較保守的結(jié)構(gòu)域。通常植物?；剐允怯捎谒拗鲗剐缘鞍桩a(chǎn)生的無毒基因的識別，進(jìn)而引發(fā)一個信號級聯(lián)反應(yīng)和防御反應(yīng)(Hammond Kosack and Jones 1997 ；Martin et al. 2003)。植物的R基因不斷變化來識別產(chǎn)生變異的無毒基因，這有利于人們在分子水平上發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識自然選擇?，F(xiàn)在人們已從許多物種中克隆得到R基因，并驗證了它們在抗性和不抗材料間的功能多樣性。許多研究表明擬南芥和其他幾個物種R基因存在序列的多態(tài)性，這種種間或種內(nèi)影響表型的基因序列多態(tài)性的識別有利于功能性分子標(biāo)記的發(fā)展(Andersen and Lubberstedt，2003)。目前培育優(yōu)良抗枯萎病甜瓜品種成為解決甜瓜枯萎病害問題的有效途徑之一，分子輔助選擇(MAQ手段的發(fā)展能大大縮短甜瓜枯萎病抗性育種進(jìn)程。但目前抗病育種過程中所使用的分子標(biāo)記與目標(biāo)基因存在一定遺傳距離，易發(fā)生重組交換而分離，從而影響選擇的準(zhǔn)確性。功能性分子標(biāo)記是與表型相關(guān)的功能基因基序中功能性單核苷酸多態(tài)性位點開發(fā)而成的新型分子標(biāo)記，功能性分子標(biāo)記的開發(fā)首先需要鑒定出群體中與表型相關(guān)的功能基因的功能性基序的序列。AS-PCR和CAPS方法已成功應(yīng)用于基于SNPs的一系列功能性分子標(biāo)記的開發(fā)(Chiapparino et al. 2004 ；Kim et al. 2006 ；Yeam et al. 2005)。功能性分子標(biāo)記不需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備或繁瑣的操作步驟，因此非常適合應(yīng)用于分子育種過程。隨著越來越多的功能基因及其等位基因的分離和注釋，功能性分子標(biāo)記已成為一類新型分子標(biāo)記，可以大大提高標(biāo)記的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與甜瓜枯萎病抗性基因i^om-2相關(guān)的功能性分子標(biāo)記，其適用于甜瓜的抗枯萎病的輔助選擇。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于甜瓜枯萎病抗性鑒定的功能性分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記所采用的CAPS引物序列為以下任意一種CAPSl 正向引物為 5，-TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3， (SEQ ID NO 3)反向引物為 5，-GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3， (SEQ ID NO 4),CAPS2 正向引物為 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3， (SEQ ID NO 5)反向引物為 5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3， (SEQ ID NO 6),CAPS3 正向引物為 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，(SEQ ID NO 7)反向引物為 5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，(SEQ ID NO 8)；或者，該分子標(biāo)記所采用的AS-PCR引物序列為AS-PCR 正向引物為 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3， (SEQ ID NO 9)反向引物為 5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3，(SEQ ID NO :10)。本發(fā)明還同時提供了上述功能性分子標(biāo)記的用途用于甜瓜枯萎病的分子輔助育
種，或者用于鑒定甜瓜枯萎病抗性基因。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了甜瓜枯萎病抗性基因i^om-2在抗病與感病種質(zhì)的LRR區(qū)域有3個 SNP位點，甜瓜枯萎病抗性基因i^om-2的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述?？菸】剐院透胁〔牧显谛蛄斜鞸EQ ID NO 1的^lbp處有一個A-G的堿基突變，在1075bp處有一個A-G的堿基突變，在1216bp處有一個T-C的堿基突變(圖1)。突變后的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 2所述。根據(jù)上述SEQ ID NO 1的序列的SNP特征，分別設(shè)計引物，開發(fā)FMs，所述的CAPS 和AS-PCR方法的引物對分別為CAPSl 正向引物為 5，-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3，反向引物為 5，-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3，；CAPS2 正向引物為 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，反向引物為 5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，；CAPS3 正向引物為 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，反向引物為 5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，。AS-PCR 正向引物為 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3，反向引物為 5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3，。該CAPS及AS-PCR引物對能成功鑒定出甜瓜抗病及感病種質(zhì)(圖2、3)，并且在F2
世代中呈單基因遺傳分離規(guī)律(表1、2)，應(yīng)用上述兩種方法可以成功鑒定出甜瓜種質(zhì)對枯萎病抗性的基因型(表3)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是本發(fā)明的甜瓜抗病及感病種質(zhì)i^om-2基因LRR區(qū)域SNP位點圖；圖1中fom-2-R代表枯萎病抗病基因型，F(xiàn)om-2-S代表枯萎病感病基因型；圖2是CAPS方法鑒定甜瓜抗病及感病種質(zhì)對比圖；圖2中FF為抗病純合基因型，F(xiàn)f為抗病雜合基因型，ff為感病純合基因型，M為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3是AS-PCR方法鑒定甜瓜抗病及感病種質(zhì)對比圖；圖3中FF為抗病純合基因型，F(xiàn)f為抗病雜合基因型，ff為感病純合基因型，M為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式實施例1、本發(fā)明的主要步驟和內(nèi)容為根據(jù)數(shù)據(jù)庫中甜瓜枯萎病抗性基因i^m-2 設(shè)計引物，以甜瓜抗病及感病種質(zhì)及它們Fp F2世代基因組DNA為模板，鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng) (PCR)方法擴增目的片段、測序，然后應(yīng)用生物信息學(xué)然間對序列進(jìn)行分析。采用CAPS和 AS-PCR兩種方法開發(fā)枯萎病抗性相關(guān)的FMs，并在F1J2世代驗證其有效性和可靠性。應(yīng)用上述兩種標(biāo)記方法，提取生產(chǎn)上應(yīng)用的不同甜瓜種質(zhì)基因組DNA，鑒定其枯萎病抗性的基因型。具體步驟如下(1)在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://WWW· ncbi. nlm. nih. gov/)中找到甜瓜枯萎病抗性基因!^0111-2的序列信息，F(xiàn)om-2基因登錄號為AY583855。！^111-2基因?qū)儆贜BS-LRR類的R基因，編碼NBS和LRR兩個比較保守的結(jié)構(gòu)域。(2)設(shè)計引物并合成，在i^om-2基因LRR區(qū)兩端設(shè)計引物，引物序列如下
Fom-2 正向引物GAGTCTATTGTTTCGCTTC反向引物TGCTCGTCTCTGGGTCACCTTC。(3)基因組DNA的提取(a)分別取0. 5g上述甜瓜抗病(Cantaloupe，高抗枯萎病材料)和感病種質(zhì)(仙果027-5，高感枯萎病材料)、Fp F2的不同甜瓜種質(zhì)嫩葉于研缽中，液氮狀態(tài)下研磨，加入 600 μ 1 65°C預(yù)熱的2 X CTAB (30 μ 1巰基乙醇混勻)，轉(zhuǎn)移到離心管中，65°C保溫1小時。(b)加入600 μ 1的氯仿異戊醇(24/1的體積比)輕輕搖勻，4°C，13000rpm離心， 10分鐘。(C)取上清，重復(fù)(b)步驟一次。(d)取步驟(C)所得的上清于另一離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，顛倒混勻，靜置5分鐘，13000rpm，離心10分鐘。(e)倒去上清，加入700 μ 1 Wash Buffer漂洗DNA沉淀，離心，重復(fù)一次。(f)加 15 μ ITE-Rnase, 37°C保溫 1 小時。(g)力口入 2mol/L NaCl 100 μ 1+100 % 乙醇 250 μ 1 混勻，-20 °C 靜置 30min， 13000rpm離心10分鐘。(h)倒去上清，加入500 μ 1 70% (體積比)乙醇，漂洗，倒去乙醇，重復(fù)一次，常溫晾干。
⑴加入30-50 μ 1 ddH20或TE,回溶，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｗ?XCTAB配方CTAB 4gIM Tris-HCl (pH8. 0) 20mlEDTA 1. 488gNaCl 16. 352g先用70ml ddH20溶解，再定容至200ml滅菌，冷卻后0. 2_1%2_巰基乙醇000 μ 1) 氯仿-異戊醇04 1)先加96ml氯仿，再加細(xì)1異戊醇，搖勻即可。TE-Rnase :15 μ 1 TE 力口入 1/100 體積的 Rnase0Wash Buffer IOmmol/L 乙酸氨75% (體積比)乙醇(4)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)的試劑與條件首先將下列試劑混和在一起
IOxTaq DNA聚合酶緩沖液5 μ
模板DNA1 μ
正向引物(1.25昭/1)0.4 μ
反向引物(1.25昭/1)0.4 μ
脫氧核苷酸混合物(dNTP)1 μ
Taq DNA 聚合酶0.4 μ
滅菌水41.8 μ
總體積50 μ PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min后，94 °C變性30s，50°C退火45s，72 °C延伸 1. 5min，35個循環(huán)后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。對目的條帶進(jìn)行克隆測序，具體方法如下(a)連接反應(yīng)，離心管順序加入以下各組分H2O 2 μ 1T4DNALigase IOXBuffer 1 μ 1pUCM-T 載體1 μ 1PCR 產(chǎn)物4 μ 1PEG4000 1 μ 1T4DNALigase 1 μ 1 ；(b)感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞):①挑取新活化的E. coli DH5a單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C下振蕩培養(yǎng)1 左右，直至對數(shù)生長后期。②將菌液以1 100-1 150的比例(重量比)接種于IOOml LB液體培養(yǎng)基中， 37°C下振蕩培養(yǎng)2h左右，至0D600 = 0. 5左右。
③將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置lOmin，然后于4°C下IOOOOrpm離心lOmin。④棄上清，用預(yù)冷的0. lmol/L的CaC12溶液30ml輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置IOmin 后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。重復(fù)操作一次。⑤棄上清，加3ml預(yù)冷的含15% (體積比)甘油的0. lmol/L的CaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置5min后，即成感受態(tài)細(xì)胞，分裝成200 μ 1的小份，置于_70°C保存?zhèn)溆谩?c)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α ①取上述(b)步驟制備的感受態(tài)細(xì)胞懸浮液200 μ 1，搖勻后加入4μ 1上述(a)步驟的連接產(chǎn)物，用槍頭輕輕吹打均勻，冰浴30分鐘； ②42 °C保溫90秒，迅速放入冰中，冰浴5分鐘；③加入37°C預(yù)熱的Iml LB液體培養(yǎng)基(Amp_)，混勻，37 °C保溫1個小時，使細(xì)胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)；④ 3000rpm 離心 10 分鐘；⑤棄去上清，余下的200 μ 1用槍頭輕輕吹打均勻，使細(xì)菌充分懸浮后均勻涂布于含 15 μ 1 X-Gal (20mg/ml)禾Π 100 μ 1 IPTG (24mg/ml)的 LB 篩選平板培養(yǎng)基上(Amp+)；⑥37°C正面向上放置半個小時后，倒置培養(yǎng)8-12小時，觀察。LB培養(yǎng)基配方IOOrnl體系中加入以下各組分蛋白胨(Typtone)Ig酵母提取物(YeastExtract) 0. 5gNaCl IgNaOH (lmol/L) 100 μ 1先用70ml ddH20溶解，再定容至100ml，高壓高溫滅菌后4°C保存。(5)質(zhì)粒純化(a)在超凈工作臺中用無菌槍頭挑取單個白色菌落，接種于含50μ g/ml Amp的 5mlLB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)過夜。(b)取 l_2ml 菌液于 Epeendorf 管中，12000rpm 離心 1 分鐘；(c)加入100 μ 1 Solution I，用槍頭充分懸浮菌液；(d)加入 200 μ 1 Solution II，顛倒 Epeendorf 管，冰浴 3 分鐘；(e)加入 150 μ 1 預(yù)冷的 Solution III，顛倒 Epeendorf 管，冰浴 5 分鐘；(f) 40C，12000rpm離心5分鐘，上清液加入等體積的苯酚/氯仿混勻；(g) 40C，12000rpm離心5分鐘，上清液加入2倍體積的乙醇，室溫放置5分鐘；(h)4°C，12000rpm離心5分鐘，用70%乙醇漂洗一下，涼干沉淀，50 μ 1 TE融解沉淀，-20°C保存?zhèn)溆?。其中Solution I :100ml 體系lmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0) 2.5ml0. 5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0ml20% Glucose (1. llmol/L) 4.5mldH20 91ml0108]高溫高壓滅菌后4°C保存。
0109]SolutionII :100ml 體系
0110]10% SDS IOml
0111]2mol/LNaOH IOml
0112]加滅菌水至100ml，充分混勻，室溫保存，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
0113]SolutionIII :100ml 體系
0114]KOAc 29. 4g
0115]CH3COOH 11.5ml
0116]加滅菌水至IOOml，高溫高壓滅菌后4°C保存。
0117]序列測定與分析序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。將所得序列在
Genebank及分子生物學(xué)軟件DNAMAN、Clustalff等分析，得到SNP位點信息(圖1)?！? CAPS 方法采用dCAPS 2. 0(http://helix. wustl.edu/dcaps/dcaps. html)軟件設(shè)計引物， 引物序列如下
0120]CAPS 1 正向引物 5，-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3，
0121]反向引物 5，-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3，
0122]CAPS2 正向引物 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，
0123]反向引物 5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，
0124]CAPS3 正向引物 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，
0125]反向引物為 5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，
0126]反應(yīng)體系和條件同上，PCR產(chǎn)物分別采用AccI，EcoRI和)(baI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行
酶切，三種內(nèi)切酶均采用20 μ 1的反應(yīng)體系如下反應(yīng)體系
PCR 產(chǎn)物5-10μ1
0.1% BSA2μ1
IOxbuffer2μ1
酶5U補充dd H2O 至 20μ 1 ；將混合溶液置于37 °C，TaqI體系置于65 °C條件下各保溫4小時，產(chǎn)物采用 HDA-GT 12TM(eGene，USA)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行檢測。利用CAPS標(biāo)記分析F2群體遺傳規(guī)律，3個SNP位點均呈1:2:1的分離比例 (表1)，符合孟德爾單基因遺傳規(guī)律，因此CAPS方法可以有效區(qū)分抗性和敏感植株。表1、CAPS方法鑒定的SNP位點在F2世代中遺傳分離
權(quán)利要求
1.用于甜瓜枯萎病抗性鑒定的功能性分子標(biāo)記一，其特征是 所述分子標(biāo)記一所采用的引物序列為CAPSl 正向引物為 5’ -TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3’反向引物為 5’ -GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3’。
2.如權(quán)利要求1所述的功能性分子標(biāo)記一的用途，其特征是用于甜瓜枯萎病的分子輔助育種，或者用于鑒定甜瓜枯萎病抗性基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于甜瓜枯萎病抗性鑒定的功能性分子標(biāo)記一，該分子標(biāo)記一所采用的引物序列為CAPS1正向引物為5’-TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3’，反向引物為5’-GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3’。該功能性分子標(biāo)記一用于甜瓜枯萎病的分子輔助育種，或者用于鑒定甜瓜枯萎病抗性基因。
文檔編號C12N15/11GK102399885SQ20111037795
公開日2012年4月4日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者張明方, 楊景華, 王士偉 申請人:浙江大學(xué)