專利名稱：一種用流式細胞術快速鑒定非洲菊倍性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用流式細胞術快速鑒定非洲菊倍性的方法，屬生物技術領域，專用于非洲菊大孢子再生植株倍性的快速鑒定。
背景技術：
非洲菊iPerbem jamesonil Bolus)又名扶郎花，為菊科大丁草屬植物，其花色艷麗，可用作切花生產或盆栽觀賞，全世界廣泛分布，是一種觀賞價值較高的花卉。目前，生產中迫切需要耐低溫、耐弱光、抗疫病和抗病毒病的優(yōu)質高產非洲菊新品種，但常規(guī)育種周期長而且變異譜范圍有限，不易捕捉目標性狀。通過花粉(花藥)培養(yǎng)獲得雙單倍體是高效利用種質資源和提高選育效率的一種方法。
非洲菊為典型的異花授粉作物，自交衰退嚴重，且雄配子誘導反應較差，而且其特殊的花器構造導致花粉或小孢子培養(yǎng)的外植體滅菌難度較大，難以獲得成功，因而，通過離體大孢子培養(yǎng)獲得單倍體尤其具有獨特的價值，并成為目前獲得非洲菊雙單倍體的唯一可行途徑，可加速育種材料純化，縮短育種周期，加速育種進程。
然而，通過非洲菊大孢子培養(yǎng)獲得的再生大孢子植株群體或非洲菊單倍體經(jīng)秋水仙堿處理的組培苗植株，在這些植株中，除育種家需要的單倍體、雙單倍體(Doubled Haploid,DH)植株外，還包含四倍體及非整倍體等，育種家必須花費大量的時間來鑒別真正的單倍體和雙單倍體植株。有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進一步應用大孢子再生植株的基礎，特別是大量的非洲菊大孢子再生植株和大孢子再生單倍體植株經(jīng)秋水仙堿處理的試管苗前期倍性鑒定，不僅可以大大減少育種工作量，加快育種進程，而且可以提前進行分子標記輔助選擇和遺傳圖譜構建工作。
另外，非洲菊從苗期到開花期，沒有明顯的形態(tài)學性狀可用于區(qū)別不同的倍性水平。盡管在開花期單倍體可能產生不正常的花和敗育的花粉，個別四倍體植株可能產生較大的花，但二倍體和四倍體(如非洲菊品種‘金葵花’)仍然難以區(qū)別。因此，長期以來都是通過顯微觀察來鑒定個體的染色體倍性，主要方法有花粉粒大小判別法、根尖染色體計數(shù)法、氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體計數(shù)法、保衛(wèi)細胞長度測量法等。這些顯微方法不僅費時，而且技術難度大。此外，采用花粉大小判別法需在開花期進行，占地且費時；而采用保衛(wèi)細胞長度測量法，由于單倍體和二倍體以及二倍體和四倍體的保衛(wèi)細胞長度重疊而不準確。
流式細胞術(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是在單細胞水平上，應用流式細胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的大量細胞或生物顆粒的理、化及生物學特性進行分析的方法。它可定量地測定某一細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量，以及細胞群體中上述成分含量不同的細胞數(shù)量，特別是它還可將某一特異染色的細胞從數(shù)以萬計的細胞群體中分離出來，因此近年來得到越來越廣泛的應用。目前，流式細胞術已普遍應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫(yī)學和基礎醫(yī)學研究領域，但在植物方面的應用直到20世紀80年代中期才開始。由于流式細胞儀可以直接測定細胞的DNA含量，從而快速鑒定出植株倍性水平，不受植株生長發(fā)育時期和環(huán)境條件的影響，不僅省時、高效，而且還可以快速、直觀、高效的檢測出非整倍體和混倍體。目前已被成功地用于花椰菜、青花菜、抱子甘藍、葡萄、大白菜、獼猴桃植株的倍性鑒別上，但由于各種作物的遺傳物質和倍體有所差異，運用流式細胞術對其進行倍性鑒別有特殊的要求，所以，至今還未見用流式細胞術用于非洲菊大孢子再生植株的倍性鑒定報道。發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種用流式細胞術快速鑒定非洲菊倍性的方法。針對上述現(xiàn)有技術中非洲菊大孢子再生植株的倍性鑒定存在的問題，將流式細胞儀應用到非洲菊大孢子再生植株的倍性鑒定上，建立非洲菊大孢子再生植株的流式細胞儀倍性鑒定體系，從而提高非洲菊大孢子再生植株的倍性鑒定效率，加速育種材料的選育和遺傳圖譜的構建。
一種用流式細胞術快速鑒定非洲菊倍性的方法，包括以下步驟(1)樣品前處理制劑的制備樣品前處理制劑由萃取裂解緩沖液和染色緩沖液組成，染色緩沖液需現(xiàn)配現(xiàn)用； 所述的萃取裂解緩沖液的配制用蒸餾水配制PH為3，終濃度為2 %質量分數(shù)的聚乙烯毗咯烷酮K30 (Polyvinyl Pyrrolidone K30, PVPK30), 100 mM 的一水檸檬酸(C6H8O7 · H2O),0. 5 %體積比的 Tween 20 的混合緩沖液，貯藏于4°C保存； 所述的染色緩沖液的配制1 mg 4，，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4，，6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride，DAPI)溶于濃度為400 mM的Na2PO4 ·12Η20緩沖液500mL中，用蒸餾水配制， PH為9，現(xiàn)配現(xiàn)用；(2)單細胞懸浮液的制備切取0. 2 0. 5 m2潔凈的非洲菊大孢子再生試管苗幼葉置于培養(yǎng)皿中，加步驟(1) 所述的萃取裂解緩沖液400 μ 1，用刀從縱橫兩個垂直方向快速將小葉片切碎，并使碎片完全浸于萃取液中，避光靜置萃取2 5min，后再加步驟(1)所述現(xiàn)配制的染色緩沖液1600 μ 1，混勻，避光靜置染色5 8min，30 μ m濾網(wǎng)過濾，濾液收集于流式細胞儀機用標準樣品管，所收集的濾液即為單細胞懸浮液；(3)對照及待測樣品的流式細胞術倍體水平鑒定設置已知倍性的非洲菊試管苗為對照材料，將對照樣品單細胞懸浮液置于德國partec 公司生產的CyFlow Cube型號流式細胞儀測定，流式細胞儀激發(fā)光源為20mW、488nm的藍寶石固體激光；測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道暢通，噴嘴清潔；控制樣品進樣速度為0. 1至20微升/秒，各通道的變異系數(shù)CV穩(wěn)定且在0 3 %，手動控制細胞流速在100 120個/秒以保持細胞分離純度。通過與CyFlow Cube型號流式細胞儀相連的 Partec CyView 85計算機分析軟件，調整電壓以設置對照DNA含量熒光強度分離峰所在橫坐標的位置，即可進行待測樣品的倍性鑒定；同對照相同的測試條件下，對比待測樣品與對照產生的DNA含量熒光強度分離峰所在橫坐標的位置，鑒定出待測樣品的倍性水平，具體是①以已知的二倍體非洲菊試管苗為對照時，設置對照樣品DNA含量熒光強度分離峰在橫坐標100的位置，當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標100士5%的位置時，該待測樣品為二倍體；當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標50士5%的位置時，該待測樣品為單倍體；當待測樣品的DNA含量直方圖出現(xiàn)兩個以上分離峰，且最高分離峰和最矮分離峰的高度相差不超過一半的為混倍體，混倍體的倍性組成由各分離峰所在橫坐標的熒光強度位置確定。分離峰在橫坐標的偏離允許范圍為士5.0%，此步驟適用于單倍體的鑒定；②以已知的非洲菊大孢子再生單倍體植株試管苗為對照時，將對照樣品DNA含量熒光強度分離峰設置在橫坐標50的位置，當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標 50士5%的位置時，該待測樣品為單倍體；當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標100士5%的位置時，該待測樣品為雙單倍體；當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標200士5%的位置時，該待測樣品為四倍體；當待測樣品的DNA含量直方圖出現(xiàn)兩個以上分離峰，且最高分離峰和最矮分離峰的高度相差不超過一半的為混倍體，混倍體的倍性組成可由各分離峰所在橫坐標的熒光強度位置確定。分離峰在橫坐標的偏離允許范圍為士5. 0%，此步驟適用于雙單倍體的鑒定。
本發(fā)明將流式細胞儀應用于非洲菊大孢子再生植株的倍性鑒定，建立了非洲菊大孢子再生植株的流式細胞儀倍性鑒定體系。與現(xiàn)有技術相比，有益效果是(1)基于DNA含量水平的倍性鑒定，準確、靈敏度和分辨率高，特別適合于倍性較為復雜的樣品或樣品數(shù)量較多的倍性檢測分析，是一種專門適用于用流式細胞術快速鑒定非洲菊大孢子再生植株倍性水平的方法。
(2)制樣簡單，該方法不受植物體取材部位和細胞所處時期限制，取材部位可以是葉片、莖、根、花、果皮、種子等。特別是在離體培養(yǎng)過程中，試管中的芽或小植株很小和很嫩時，此方法僅用1 cm2的樣品就很容易鑒定其材料倍性。
(3)測試速度快，僅用1 3 min就可以分析上萬個細胞，測定出單個細胞核內 DNA含量，并且DNA含量變異可在分布圖上直觀地看出。
(4)本發(fā)明提供的一種用流式細胞術快速鑒定非洲菊倍性的方法，實現(xiàn)了非洲菊倍性鑒定的批量快速檢測，可節(jié)省大量的人力、物力和財力，加速育種進程，為非洲菊新品種選育提供了技術支撐。


圖1是實施例1對照樣品即非洲菊品種‘菊派王’的二倍體植株葉片樣品DNA含量直方圖。
圖2是實施例1待測非洲菊品種品DNA含量直方圖。
圖3是實施例1待測非洲菊品種品DNA含量直方圖。
圖4是實施例1待測非洲菊品種品DNA含量直方圖。
圖5是實施例2對照樣品即非洲菊品種‘熱帶草原’單倍體植株葉片樣品DNA含量直方圖。‘菊派王’大孢子培養(yǎng)再生的單倍體植株葉片樣 ‘菊派王’大孢子培養(yǎng)再生的二倍體植株葉片樣 ‘菊派王’大孢子培養(yǎng)再生的混倍體植株葉片樣
圖6是實施例2待測非洲菊品種‘熱帶草原’大孢子培養(yǎng)再生單倍體植株，經(jīng)秋水仙堿處理獲得的雙單倍體植株葉片DNA含量直方圖。
圖7是實施例2待測非洲菊品種‘熱帶草原’大孢子培養(yǎng)再生單倍體植株，經(jīng)秋水仙堿處理無加倍現(xiàn)象的單倍體植株葉片DNA含量直方圖。
圖8是實施例2待測非洲菊品種‘熱帶草原’大孢子培養(yǎng)再生單倍體植株，經(jīng)秋水仙堿處理獲得的四倍體植株葉片DNA含量直方圖。
圖9是實施例2待測非洲菊品種‘熱帶草原’大孢子培養(yǎng)再生單倍體植株，經(jīng)秋水仙堿處理的混倍體植株葉片DNA含量直方圖。
圖1 圖9的橫坐標為樣品DNA含量熒光強度，縱坐標為樣品細胞計數(shù)。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步描述，但本發(fā)明的內容并不僅限于這些。 以下實施例所采用的非洲菊品種材料不是利用該品種的遺傳特異性，因此，也可以采用其它非洲菊品種采用本發(fā)明方法鑒定其倍性，并且這些非洲菊品種材料均是商業(yè)化品種，可以通過商業(yè)渠道購買到，如可以在云南云科花卉有限公司購買，地址是云南省昆明市北郊龍頭街桃園村。
實施例1非洲菊大孢子再生植株的倍性鑒定 1、材料與樣品處理制劑的制備①待測樣品材料非洲菊品種‘菊派王’，該品種來源于云南農科院花卉所非洲菊種質資源保存圃的，用王麗花等(王麗花等.非洲菊未授粉胚株離體誘導和植株再生[J].生理學通訊，2007, 43 (6) 1089-1092)的方法對其進行大孢子誘導培養(yǎng)，獲得大孢子再生植株M 株，采用德國partec公司生產的CyFlow Cube型號的流式細胞儀，對大孢子再生植株進行流式細胞儀倍性分析。應用的分析軟件為Partec CyView 85軟件。
②對照樣品材料非洲菊品種‘菊派王’的常規(guī)試管苗，經(jīng)根尖染色體鑒定為二倍體(&ι=2χ=50)材料。
③樣品處理制劑的制備樣品處理制劑由萃取裂解緩沖液和染色緩沖液組成，染色緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)配。
所述的萃取裂解緩沖液的配制用蒸餾水配制PH為3，終濃度為2 %質量分數(shù)的聚乙烯毗咯烷酮K30 (Polyvinyl Pyrrolidone K30, PVPK30), 100 mM 的一水檸檬酸(C6H8O7 · H2O),0. 5 %體積比的 Tween 20 的混合緩沖液，貯藏于4°C保存。
所述的染色緩沖液的配制1 mg 4，，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4，，6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride，DAPI)溶于濃度為400 mM的Na2PO4 ·12Η20緩沖液500mL中，用蒸餾水配制， PH為9，現(xiàn)配現(xiàn)用。
2、單細胞懸浮液的制備①對照樣品的制備切取對照樣品試管苗幼葉0. 5 m2，加萃取裂解緩沖液400 μ 1，用鋒利的新手術刀片從縱橫兩個垂直方向快速切碎，并使碎片完全浸于萃取裂解緩沖液中，避6光靜置萃取2 min，后再加1600 μ 1染色緩沖液，快速混勻，避光靜置染色5min，30 μ m濾網(wǎng)過濾，濾液收集于德國partec公司生產的CyFlow Cube型號流式細胞儀機用標準樣品管， 所收集的濾液即為對照樣品單細胞懸浮液，迅速上機測定。
②待測樣品的制備方法與對照樣品的制備相同，各測試樣品設置3個以上重復。
3、流式細胞儀對樣品倍性的測定及倍性分析測定前自動清洗流式細胞儀使管道暢通，噴嘴清潔，儀器處于最佳狀態(tài)；控制樣品進樣速度為0. 1至20微升/秒，各通道的變異系數(shù)CV穩(wěn)定且在0 3 %，手動控制細胞流速在 100 120個/秒以保持細胞分離純度，熒光強度由儀器自動檢出。通過與CyFlow Cube 型號流式細胞儀相連的Partec CyView 85計算機分析軟件，調節(jié)電壓值為317伏，使對照 DNA含量熒光強度分離峰設置于橫坐標100的位置(見圖1)。
由于對照樣品材料為已知二倍體，因而待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處于橫坐標100士0. 05的位置為二倍體(峰值在橫坐標偏離的允許范圍為士5. 0%);而待測樣品的DNA含量峰值處于橫坐標的50士0. 05為單倍體。出現(xiàn)兩個或多個高度相近(最高和最矮分離峰的高度相差不超過一半)分離峰的為混倍體。即待測樣品的熒光強度分離峰在橫坐標上的位置與對照標樣熒光強度分離峰處于橫坐標上的位置相近的為二倍體，為對照1 / 2的為單倍體，出現(xiàn)2個或以上分離峰的為混倍體，混倍體又可根據(jù)各峰值與對照的倍數(shù)關系確定其構成細胞的倍性組成，從而確定出待測樣品的倍性水平。待測非洲菊‘菊派王’的 24株大孢子再生植株中，有9株為單倍體(見圖幻，14株為二倍體(見圖幻，1株為混倍體 (見圖4)。
單倍體與根尖染色體鑒定結果和植株形態(tài)鑒別相吻合，但混倍體、二倍體與正常二倍體植株應用根尖染色體計數(shù)或形態(tài)特征難以區(qū)分，而利用流式細胞儀可在幾分鐘內快速鑒定出其倍性水平。這樣可以在瓶苗誘導早期就可對大孢子再生植株進行倍性鑒定，鑒定出的單倍體迅速擴繁后便可進行加倍處理，獲得雙單倍體，避免浪費過多的人力和藥品。 特殊倍性的植株還可應用于細胞遺傳學方面的研究。
實施例2非洲菊大孢子再生單倍體植株經(jīng)秋水仙堿處理獲得的試管苗倍性鑒定。
1、材料與方法①待測樣品材料非洲菊品種‘熱帶草原’，該品種來源于云南農科院花卉所非洲菊種質資源保存圃，利用王麗花等(王麗花等.非洲菊未授粉胚株離體誘導和植株再生[J].生理學通訊，2007, 43 (6) 1089-1092)的方法對其進行大孢子誘導培養(yǎng)，獲得大孢子再生植株 11株，經(jīng)根尖染色體鑒定，獲得單倍體3株，擴繁此3株單倍體分別至50株以上，置于添加 0. 025%的秋水仙堿的擴繁培養(yǎng)基MS+BA 0.6 mg. L^+NAA 0. 1 mg. Γ1 (ρΗ 5.8)中處理6天。 處理結束后轉入MS+BA 0. 3 mg. L-1+NAA 0. 1 mg. L—1 (ρΗ 5. 8)培養(yǎng)基中恢復培養(yǎng)30 50 d。后加倍處理的正常成活植株114株采用德國partec公司生產的CyFlow Cube型號流式細胞儀對其進行流式細胞術倍性分析。應用的分析軟件為Partec CyView 85軟件。
②對照樣品材料通過根尖染色體計數(shù)法鑒定非洲菊品種‘熱帶草原’大孢子再生植株，而獲得的單倍體試管苗On=x=25)。
2、單細胞懸浮液的制備待測樣品和對照樣品的單細胞懸浮液的制備除以下措施不同外，其余措施與實施例1 相同，不再贅述。
(1)切取的待測樣品試管苗幼葉和對照樣品試管苗幼葉為0. 2 m2 ；(2)避光靜置萃取5min ；(3)避光靜置染色8min。
3、流式細胞儀倍性分析測定前自動清洗流式細胞儀使管道暢通，噴嘴清潔，儀器處于最佳狀態(tài)，樣品進樣速度為0. 1至20微升/秒；各通道的變異系數(shù)CV穩(wěn)定且在0 2%以下，熒光強度由儀器自動檢出，通過手動控制細胞流速在100 120個/秒以保持細胞分離純度。以根尖染色體計數(shù)鑒定出的‘熱帶草原’單倍體(2n=x=20組培苗為標樣，峰值與對照相近的為單倍體 (所述的“相近”是指分離峰在橫坐標位置的偏離允許范圍為士5. 0%。)，為對照2倍的為雙倍體，3倍的為三倍體、4倍的為四倍體，出現(xiàn)2個或以上分離峰的為混倍體，混倍體根據(jù)各分離峰與單倍體分離峰的倍數(shù)關系確定其構成細胞的倍性組成，從而確定出待測樣品的倍性水平。峰值偏離允許范圍為士5.0%。
4、結果與分析經(jīng)根尖染色體鑒定為單倍體(2η=χ=25)的‘熱帶草原’組培苗設定為對照標樣，設置其熒光強度的分離峰處于橫坐標50的位置(見圖5)。流式細胞儀倍性鑒定結果表明，待測植株峰值處于50附近(所述的“附近”是指分離峰在橫坐標位置的偏離允許范圍為士5. 0%。) 的視為單倍體，而處在100和200附近的分別視為雙單倍體和四倍體。出現(xiàn)兩個或多個高度相近分離峰的為混倍體。擴繁的非洲菊大孢子再生單倍體植株經(jīng)秋水仙堿加倍處理后正常成活114株，其中，59株為雙單倍體(見圖6)，占51. 7% ；14株無加倍現(xiàn)象為單倍體(見圖7)，占12. 3% ；17株為四倍體(見圖8)，占14. 9% ；24株為混倍體(見圖9)，占21. 1%。
本發(fā)明針對對大量的非洲菊大孢子再生植株和大孢子再生單倍體植株經(jīng)秋水仙堿處理的試管苗，建立了適宜非洲菊大孢子培養(yǎng)再生植株的流式細胞儀倍性鑒定的方法， 大大提高了 DH群體構建和遺傳圖譜繪制的效率，從而加速了育種進程。
權利要求
1. 一種用流式細胞術快速鑒定非洲菊倍性的方法，包括以下步驟(1)樣品前處理制劑的制備樣品前處理制劑由萃取裂解緩沖液和染色緩沖液組成，染色緩沖液需現(xiàn)配現(xiàn)用；所述的萃取裂解緩沖液的配制用蒸餾水配制PH為3，終濃度為2 %質量分數(shù)的聚乙烯毗咯烷酮K30，100 mM的一水檸檬酸，0. 5 %體積比的Tween 20的混合緩沖液，貯藏于4°C保存； 所述的染色緩沖液的配制lmg 4’，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽溶于濃度為400 mM的 Na2PO4 · 12H20緩沖液500mL中，用蒸餾水配制，pH為9 ；(2)單細胞懸浮液的制備切取0. 2 0. 5 m2潔凈的非洲菊大孢子再生試管苗幼葉置于平底培養(yǎng)皿中，加步驟 (1)所述的萃取裂解緩沖液400 μ 1，用刀片從縱橫兩個垂直方向快速將小葉片切碎，并使碎片完全浸于萃取液中，避光靜置萃取2 5min，后再加步驟(1)所述現(xiàn)配制的染色緩沖液 1600 μ 1混勻，避光靜置染色5 8min，30 μ m濾網(wǎng)過濾，濾液收集于流式細胞儀機用標準樣品管，所收集的濾液即為單細胞懸浮液；(3)對照及待測樣品的流式細胞術倍體水平鑒定設置已知倍性的非洲菊試管苗為對照材料，將對照樣品單細胞懸浮液置于德國partec 公司生產的CyFlow Cube型號流式細胞儀測定，流式細胞儀激發(fā)光源為20mW、488nm的藍寶石固體激光；測定前流式細胞儀自動清洗內部使管道暢通，噴嘴清潔；控制樣品進樣速度為0. 1至20微升/秒，各通道的變異系數(shù)CV穩(wěn)定且在0 3%，手動控制細胞流速在100 120個/秒以保持細胞分離純度；通過與CyFlow Cube型號流式細胞儀相連的 Partec CyView 85計算機分析軟件，調整電壓設置對照DNA含量熒光強度分離峰所在橫坐標的位置，即可進行待測樣品的倍性鑒定；同對照相同的測試條件下，對比待測樣品與對照產生的DNA含量熒光強度分離峰所在橫坐標的位置，即可鑒定出待測樣品的倍性水平，具體是①以已知的二倍體非洲菊試管苗為對照時，設置對照樣品DNA含量熒光強度分離峰在橫坐標100的位置，當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標100士5%的位置時， 該待測樣品為二倍體；當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標50士5%的位置時，該待測樣品為單倍體；當待測樣品的DNA含量直方圖出現(xiàn)兩個以上分離峰，且最高分離峰和最矮分離峰的高度相差不超過一半的為混倍體，混倍體的倍性組成由各分離峰所在橫坐標的位置確定；②以已知的非洲菊大孢子再生單倍體植株試管苗為對照時，將對照樣品DNA含量熒光強度分離峰設置在橫坐標50的位置，當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標 50士5%的位置時，該待測樣品為單倍體；當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標100 士 5%的位置時，該待測樣品為雙單倍體；當待測樣品的DNA含量熒光強度分離峰處在橫坐標200 士 5%的位置時，該待測樣品為四倍體；當待測樣品的DNA含量直方圖出現(xiàn)兩個以上分離峰，且最高分離峰和最矮分離峰的高度相差不超過一半的為混倍體，混倍體的倍性組成由各分離峰所在橫坐標的位置確定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用流式細胞術快速鑒定非洲菊倍性的方法。包括利用萃取裂解緩沖液和染色緩沖液進行單細胞懸浮液制備；采用德國partec公司生產的CyFlow Cube型號的流式細胞儀測定樣品DNA熒光強度進行倍性分析；對比待測樣品與對照的DNA含量熒光強度分離峰所在橫坐標的位置，即可鑒定出待測樣品的倍性水平。流式細胞儀倍性鑒定結果與根尖染色體計數(shù)倍性鑒別結果相一致。應用此法，可快速篩選鑒定出批量的非洲菊大孢子再生植株倍性，大大提高DH群體構建和遺傳圖譜繪制的效率，從而加速了育種進程。本發(fā)明制樣簡單、檢測快速、具有穩(wěn)定的高檢出率。
文檔編號C12Q1/68GK102517384SQ20111041778
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月14日 優(yōu)先權日2011年12月14日
發(fā)明者吳學尉, 張麗芳, 張藝萍, 彭綠春, 楊秀梅, 王麗花, 瞿素萍, 蘇艷 申請人:云南省農業(yè)科學院花卉研究所