專利名稱：一種人巨細(xì)胞病毒核酸檢測(cè)的高靈敏度方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種巨細(xì)胞病毒核酸的檢測(cè)試驗(yàn)方法，可以在臨床檢驗(yàn)和相關(guān)研究中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus,HCMV)是皰疫病毒科β屬DNA病毒，正常人群中自然感染普遍。在美國(guó)，3 10歲兒童每年血清HCMV抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率為3% 6.2%;在英國(guó)，青年人HCMV抗體陽(yáng)性率為10% 15%，中上階層成年人中達(dá)40% 60%，下層人群中達(dá)80%;發(fā)展中國(guó) 家，3歲以下兒童抗體陽(yáng)性率達(dá)80%，成年人群中幾乎達(dá)100%。據(jù)調(diào)查我國(guó)育齡婦女70 90%曾發(fā)生過(guò)HCMV感染，4.3 19.59%孕婦妊娠期間發(fā)生過(guò)HCMV感染，HCMV宮內(nèi)傳播率約為17 80%。HCMV感染呈全球分布，人是HCMV的唯一宿主。HCMV的傳播發(fā)生于人之間的直接接觸和體液傳播，多數(shù)HCMV感染是在圍生期和嬰兒期，或在成年期通過(guò)性接觸。HCMV檢測(cè)是圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)和優(yōu)生學(xué)中的重大研究課題。孕婦感染HCMV后，多無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，但病毒可經(jīng)胎盤傳播給胎兒，由于胎兒對(duì)HCMV具有很高的易感性，易造成先天性感染。母親初次感染后，胎兒先天性感染發(fā)生率約為25% 75%。有關(guān)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)被HCMV感染的胎兒中約有1/3出現(xiàn)巨細(xì)胞包涵體病(Cytomegalovirus inclusiondisease, CID)即約5%在早期出現(xiàn)流產(chǎn)和死胎等癥狀，約25_35%存活嬰兒可發(fā)生體重低下、肝脾腫大、黃疸、失明、腦畸形、血小板減少性紫癜、先天性智力低下及神經(jīng)性耳聾等癥狀。成人HCMV感染發(fā)病與免疫功能有密切關(guān)系，如器官移植者常因免疫抑制使?jié)摲牟《净罨l(fā)病，艾滋病患者的HCMV感染發(fā)病率高。免疫缺陷患者及免疫抑制治療，肝、腎、心臟等器官移植，腫瘤及骨髓移植等可產(chǎn)生廣泛的HCMV復(fù)發(fā)性感染，骨髓移植患者三分之一以上可兼發(fā)有癥狀的HCMV感染并導(dǎo)致間質(zhì)性肺炎，后者病死率高達(dá)40%。因此HCMV感染是目前導(dǎo)致骨髓移植失敗的重要原因之一。為了能早期、快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)HCMV感染，以便及時(shí)給予治療以降低疾病的嚴(yán)重性和死亡率，故建立快速靈敏且特異的檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。在已有的檢測(cè)方法中病毒培養(yǎng)分離為最準(zhǔn)確的方法，但耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果受標(biāo)本保存時(shí)間影響較大，在臨床應(yīng)用中困難；電鏡快速、準(zhǔn)確，一般適合實(shí)驗(yàn)室研究；免疫學(xué)方法在HCMV研究和診斷中有廣泛使用，但檢出的靈敏度有待提高；而核酸診斷敏感性及特異性均佳，是應(yīng)用發(fā)展的方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利的目的是提供一種HCMV病原體核酸的高靈敏度檢測(cè)方法，此方法克服了常規(guī)方法的上述問題，應(yīng)用此方法檢測(cè)HCMV病原體的敏感度和特異度較高，檢測(cè)HCMV病原體感染的真實(shí)性較好。在達(dá)到上述目的中，根據(jù)本發(fā)明提供了一種篩檢人巨細(xì)胞病毒的方法，即套式PCR。此方法是提取病原DNA模板，使用病原特異性外側(cè)上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，以第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用病原特異性內(nèi)側(cè)上下游引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。所用到的儀器有PCR擴(kuò)增儀，超速低溫離心機(jī)，移液器，電泳儀，水浴箱。主要試劑有Taq聚合酶，上下游引物。2本發(fā)明詳細(xì)描述步驟I血清病毒DNA的提取方法試劑以及配制I)蛋白酶K稱取20mg蛋白酶K，用消毒蒸餾水溶解并定容至1ml，作為貯存液于_20°C存放。2)電泳用10XTBE緩沖液貯存液稱取Tris54g，硼酸TL 5g，加入蒸餾水約400ml，攪拌溶解，再加入0.5MEDATA(PH=8.0) 20ml，定容至 500ml。電泳或制備瓊脂糖凝膠時(shí)需先用蒸餾水將10 X TBE稀釋10倍成I X TBE緩沖液。3)瓊脂糖凝膠的配置I).配制適量的電泳及制膠用的緩沖液0.5XTBE。2).根椐制膠量及凝膠濃度，準(zhǔn)確稱量瓊脂糖粉，加入適當(dāng)?shù)腻F形瓶中，然后在微波爐中加熱熔化瓊脂糖。溶液冷卻幾分鐘后加入溴乙錠溶液(終濃度0.5mg/ml)，并充分混勻。3).將瓊脂糖溶液倒入制膠模中，然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3 5_之間。4).在室溫下使膠凝固(大約30分鐘 I小時(shí))，然后放置于電泳槽中進(jìn)行電泳。步驟2血清病毒DNA的分離提取步驟(I)在室溫下血液離心，將上層血清移至EP管中，再吸取IOOul血清加入另一 EP管。(2)加入PEG6000和NaCL至終濃度分別為10%和lmol/L，充分混勻，室溫放置lh。(3)以 12000r/min 離心 30min,棄上清液。(4)用 200 μ L 裂解液(裂解液:終濃度為 20mmol/Ltris-HCL，pH8.0, IOmmol/LEDTA，pH8.0，lmg/mlSDS，0.8mg/mL 蛋白酶 K)作 I: I 混合 65°C水浴 4h，99°C加熱 15min。(5)加1/3體積5MNaCL，混勻4°C靜置I小時(shí)。(6)以12000r/min離心IOmin,將上清液移至另一 EP管中。(7)加入等體積的飽和酹,充分混勻，以12000r/min離心IOmin,將上清液移至另一 EP管中。(8)加入等體積的氯仿:異戍醇(24: I),充分混勻，以12000r/min離心IOmin,抽提2-3次，直至有機(jī)相與無(wú)機(jī)相無(wú)白色成淀為止。(9)取上清加入1/10體積的3mol/L，pH5.2的乙酸鈉，彈勻后加入2.5倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，振勻，_20°C放置過(guò)夜。(10)第二日以12000r/min離心IOmin,小心棄上清。(11)用70%的乙醇洗漆兩次，以12000r/min離心5min,棄上清,所得沉淀室溫干燥 lOmin。(12)用TE緩沖液溶解DNA，使其A260/280的比值界于1.65-1.80之間，將DNA的終濃度定量為150-200ng/l.! L，_20°C保存待用。(13)測(cè)定所提DNA的純度和含量。步驟3巢式PCR實(shí)驗(yàn)方法(I)檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)其第一輪PCR反應(yīng)體系是:10X擴(kuò)增緩沖液5ul，dNTPmix (IOmmol) lul,上游和下游引物(10pmol/ul)各 1.5ul,病毒模板DNAlul, Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.5ul, MgC12 (25mmol) 3ul,滅菌雙蒸水補(bǔ)足 36.5ul。檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)第一輪PCR反應(yīng)條件是:預(yù)變性91°C 5min，循環(huán)91°C 30S、56°C lmin、72°C Imin 共 35 個(gè)循環(huán)，延伸 72°C IOmin0(2)第一輪PCR反應(yīng)引物:上游引物P1: TGAGGATAAGCGGGAGATGT下游引物P2:ACTGAGGCAAGTTCTGCAGT(3)檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)其第二輪PCR反應(yīng)體系是:10X擴(kuò)增緩沖液5ul，dNTPmix (IOmmol) Iul，上游和下游引物(10pmol/ul)各1.5ul，第一輪PCR擴(kuò)增病毒核酸產(chǎn)物模板 DNA 5ul, Taq DNA 聚合酶(5U/ul) 0.5ul, MgC12 (25mmol) 3ul,滅菌雙蒸水補(bǔ)足32.5ul。檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)第二輪PCR反應(yīng)條件是:預(yù)變性93 °C 5min，循環(huán)91°C 30S、56°C lmin、72°C Imin 共 30 個(gè)循環(huán)，延伸 72°C IOmin0(4)第二輪PCR反應(yīng)引物:
上游引物P3:AGCTGCATGATGTGAGCAAG下游引物P4: GAAGGCTGAGTTCTTGGTA(5) PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè):通常應(yīng)用I 2%的瓊脂糖凝膠，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察擴(kuò)增特異性條帶，判斷產(chǎn)物的靈敏度和特異性。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):1、熒光定量PCR與套式PCR對(duì)HCMV感染檢測(cè)的比較表IHCMV熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與n_PCR結(jié)果分布
權(quán)利要求
1.一種高靈敏度的人巨細(xì)胞病毒病原核酸酶鏈聚合反應(yīng)(PCR)檢測(cè)方法，其特征是提取病原DNA模板，使用病原特異性外側(cè)上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，以第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用病原特異性內(nèi)側(cè)上下游引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，提高檢測(cè)感染病原體核酸水平。
2.如權(quán)利要去I所述的高靈敏度病原檢測(cè)方法，檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)其外側(cè)和內(nèi)存上下游引物分別為: 外側(cè)上游引物:5 ’ -TGAGGATAAGCGGGAGATGT-3，； 外側(cè)下游引物:5’ -ACTGAGGCAAGTTCTGCAGT-3’ ； 內(nèi)側(cè)上游引物:5’ -AGCTGAATGATGTAGGCAAG-3’ ； 內(nèi)側(cè)下游引物:5’ -GAAGGCTGAGTTCTTGGTAA-3’。
3.如權(quán)利要去I所述的高靈敏度病原檢測(cè)方法，檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)其第一輪PCR反應(yīng)體系是:10 X擴(kuò)增緩沖液3-5ul，dNTPmix (IOmmol) l_3ul，上游和下游引物(10pmol/ul)各 l-2ul,病毒模板 DNA l_2ul，Taq DNA 聚合酶(5U/ul)0.1-1.0ul，MgC12 (25mmol) l_3ul,滅菌雙蒸水補(bǔ)足 50ul。
4.如權(quán)利要去I所述的高靈敏度病原檢測(cè)方法，檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)第一輪PCR反應(yīng)條件是:預(yù)變性 90-93°C 5min，循環(huán) 88_91°C 30S、52_56°C lmin、68_72°C Imin 共 35 個(gè)循環(huán)，延伸 70-72 0C IOmin。
5.如權(quán)利要去I所述的高靈敏度病原檢測(cè)方法，檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)其第二輪PCR反應(yīng)體系是:10 X擴(kuò)增緩沖液3-5ul，dNTPmix (IOmmol) l_3ul，上游和下游引物(10pmol/ul)各l-2ul， 第一輪PCR擴(kuò)增病毒核酸產(chǎn)物模板DNA 3_5ul，Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.1-1.0ul, MgC12 (25mmol) l_3ul,滅菌雙蒸水補(bǔ)足 50ul。
6.如權(quán)利要去I所述的高靈敏度病原檢測(cè)方法，檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒核酸時(shí)第二輪PCR反應(yīng)條件是:預(yù)變性 90-93 °C 5min，循環(huán) 88-91 °C 30S、52-56 °C Imin、68-72 °C Imin 共 30 個(gè)循環(huán)，延伸 70-72 0C IOmin。
7.PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè):通常應(yīng)用I 2%的瓊脂糖凝膠，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察擴(kuò)增特異性條帶，判斷產(chǎn)物的靈敏度和特異性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種巨細(xì)胞病毒核酸的檢測(cè)試驗(yàn)方法，此方法是提取病原DNA模板，使用病原特異性外側(cè)上下游引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，以第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用病原特異性內(nèi)側(cè)上下游引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。套式PCR方法檢測(cè)HCMV病毒感染的靈敏度、特異度以及真實(shí)性優(yōu)于ELISA方法和熒光定量PCR，為臨床實(shí)踐提供一種高靈敏度的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103160613SQ201110419869
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月10日
發(fā)明者程寧, 白亞娜 申請(qǐng)人:程寧, 白亞娜