專利名稱：一種利用微生物催化制備(s)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法
技術(shù)領域：
一種利用微生物全細胞催化不對稱還原制備⑶-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，即利用微生物全細胞不對稱還原4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮合成倍他司汀類藥物的重要手性中間體⑶-(4-氯苯基)_(卩比啶-2-基)_甲醇的方法，屬于生物催化技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
倍他司汀類藥物是一類具有高效低毒副作用特性的第二代抗組胺藥物，可用于治療過敏性鼻炎等變態(tài)反應疾病，具有作用迅速，選擇性高，副作用低，療效顯著等優(yōu)點。由于最近幾十年間過敏性疾病的發(fā)病率呈快速上升趨勢，在過敏性疾病治療領域發(fā)揮重要作用的倍他司汀類藥物的需求量不斷增加。同為第2代抗組胺藥，特非那定、阿司咪唑，能誘
發(fā)心臟毒性反應，其次是氯雷他定、西替利嗪，倍他司汀則由于其高效低毒的特性而備受矚目。⑶-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇(⑶-CPMA)是合成倍他司汀類藥物的重要手性中間體，關(guān)于其合成方法的報道主要有2003年，Chen C等人使用手性催化劑 irafls-RuCUtO^-xylbinap]
將 CPMK 不對稱還原合成產(chǎn)物(S)-CPMA 的e. e.值為60. 6% ； 1996年，Corey EJ等人使用兒茶酚硼烷(catecholborane)作為手性定位選擇劑，BF3和BBr3作為還原劑，將(4-苯基)-(吡啶_2_基)-甲酮 [(4-phenyl)-(pyridin-2-yl)methaone]進行不對稱還原，產(chǎn)物(4-苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇[C )44-phenyl)-(pyridin-2-yl)methanol]的 e. e.值和產(chǎn)率分別為 30%和19% ；2006年，Truppo MD等用酮還原酶(商品酶)對CPMK進行酶法不對稱還原，產(chǎn)物 C ) -CPMA光學純度僅有60%。由以上數(shù)據(jù)可以看出，化學還原制備C ) - (4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇效果不佳，產(chǎn)率和值較低，并且操作過程復雜，一些手性催化劑會在反應過程中引入重金屬元素，不利于在制藥行業(yè)的應用。僅有的一篇生物法的報道，采用酮還原酶(商品酶)還原制備(5)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇反應的產(chǎn)率和a a也不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用微生物全細胞不對稱還原制備C )-(4-氯苯基) _(吡啶-2-基)_甲醇的方法。利用篩選獲得的具有高對映體選擇性的微生物菌株克魯維假絲酵母(Jluyveromycessp. ) CCTCC M 2011385進行不對稱還原4_氯苯基-(吡啶-2-基)_甲酮的研究，為制備⑶-(4-氯苯基)_(卩比啶-2-基)-甲醇提供了一條可行的途徑。本發(fā)明的技術(shù)方案以含有立體選擇性羰基還原酶活性的微生物全細胞為催化劑，在單一水相或雙水相反應體系中對潛手性4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮進行不對稱還原，制備具有高光學純度的(5) - (4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，步驟如下
(1)微生物來源從無錫長廣溪濕地公園土壤樣品中進行篩選，獲得一株具有高立體選擇性羰基還原酶活性的微生物菌株克魯維假絲酵母Ο 7炒sp. ) JNU-KR1，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO =M 2011385。(2)濕菌體的培養(yǎng)培養(yǎng)基組成以g/L計為葡萄糖5 - 50，酵母膏3 — 30，磷酸二氫鉀1 一 10，七水合硫酸鎂0. 2 — 2，PH為4 一 9，發(fā)酵培養(yǎng)1 一 5天，發(fā)酵液過濾獲得濕菌體；
(3)配置反應體系以4-氯苯基_(吡啶-2-基)-甲酮為底物，用磷酸鹽緩沖液配制成的單一水相反應體系，底物濃度為0. 1-10 g/L，葡萄糖濃度10 — 100 g/L;或用不同分子量的PEG與不同無機鹽溶液配制成的各種雙水相反應體系，底物濃度為0.5 — 20 g/L，葡萄糖濃度 10 - 100 g/L。(4)酶轉(zhuǎn)化反應在反應體系中加入步驟(2)所述克魯維假絲酵母 (.Kluyveromycessv- )CCTCC NO :M 2011385 濕菌體 50-250 g/L，于 25-45 行酶反應，反應時間為3-72 h。(5)轉(zhuǎn)化液后處理轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液，將萃取獲得的有機相蒸發(fā)回收溶劑，采用硅膠柱層析進一步分離純化，再干燥脫水，蒸發(fā)回收溶劑，獲得無色油狀液體產(chǎn)物(5)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇。本發(fā)明方法所選用的反應體系為由0. 1 — 0. 5 mmol/L、pH6 — 8磷酸鹽緩沖液配制的單一水相體系，或由分子量為2000 - 20000的不同PEG與各種無機鹽(包括ΚΗ2Ρ04、 Na2HPO4, (NH4)2SO4和Na2SO4等)配制的不同雙水相反應體系。本發(fā)明方法所選用的酶轉(zhuǎn)化反應條件為底物濃度為1 一 10 g/L，濕菌體濃度 50 - 250 g/L，反應溫度 25 — 35 °C，反應時間 12 — 72 h。本發(fā)明方法在PEG 4000 (20%, ff/ff) /Na2HPO4 (14%, W/W)雙水相反應體系中，最終產(chǎn)物e. e.值和產(chǎn)率分別可以達到86. 7%和92. 1%。萃取處理用乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液得到含有(5·) - (4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的有機相，用適量的無水硫酸鎂干燥過夜使用0. 22 μ m孔徑膜濾后進行液相色譜檢測以測定反應的對映體過量值和產(chǎn)率。轉(zhuǎn)化反應產(chǎn)物經(jīng)萃取、干燥和0. 22 μ m孔徑膜濾后，采用液相色譜法測定產(chǎn)物產(chǎn)率及對映體過量值，具體條件如下Daicel Chiralcel OB-H (5 ym,250 mm X 4. 6 mm)液相色譜柱，流動相為正己烷異丙醇(90: 10，V/V)，流速1 mL /min，柱溫38 °C，紫外檢測波長254 nm，進樣量10 yL，保留時間20 min。產(chǎn)物光學純度通過對映體過量值來評價。
權(quán)利要求
1.一株具有高立體選擇性羰基還原酶活性的微生物菌株，其分類命名為克魯維假絲酵母aauFeroWCM sp. ) JNU-KRl，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO: M 2011385。
2.用微生物CCTCCNO =M 2011385不對稱氧化還原制備(5)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，(S) - (4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇簡寫⑶-CPMA,其特征是以CCTCC NO =M 2011385全細胞為催化劑，在單一水相或雙水相反應體系中對潛手性4-氯苯基_(吡啶-2-基)_甲酮CPMK進行不對稱還原，制備具有高光學純度的C )_(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，步驟如下(1)濕菌體的培養(yǎng)培養(yǎng)基組成以g/L計為葡萄糖5— 50，酵母膏3 - 30，磷酸二氫鉀1 一 10，七水合硫酸鎂0. 2 — 2，pH4 - 9，發(fā)酵培養(yǎng)1 一 5天，發(fā)酵液過濾獲得濕菌體；(2)配置反應體系以4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮為底物，用磷酸鹽緩沖液配制成的單一水相反應體系，底物濃度為0. 1-10 g/L，葡萄糖濃度10 — 100 g/L;或用不同分子量的PEG與不同無機鹽溶液配制成的各種雙水相反應體系，底物濃度為0. 5 — 20 g/L,葡萄糖濃度 10 - 100 g/L ；(3)酶轉(zhuǎn)化反應在反應體系中加入CCTCCNO =M 2011385濕菌體50-250 g/L，于25-45 °C進行酶反應，反應時間為3-72 h ；(4)轉(zhuǎn)化液后處理用乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液，將萃取獲得的有機相蒸發(fā)回收溶劑， 采用硅膠柱層析進一步分離純化，再干燥脫水，蒸發(fā)回收溶劑，獲得無色油狀液體產(chǎn)物 ⑶-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于反應體系為由0.1 — 0. 5 mmol/L、pH6 一 8磷酸鹽緩沖液配制的單一水相體系，或由分子量為2000 - 20000的不同PEG與ΚΗ2Ρ04、 Na2HPO4, (NH4)2SO4或Na2SO4各種無機鹽配制的不同雙水相反應體系。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于酶轉(zhuǎn)化反應條件為底物濃度為1一 10 g/ L，濕菌體濃度50 - 250 g/L，反應溫度25-35 °C，反應時間12 — 72 h。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在質(zhì)量濃度20%PEG 4000 /質(zhì)量濃度14% Na2HPO4雙水相反應體系中，最終產(chǎn)物e. e.值達到85%，產(chǎn)率達到92%。
全文摘要
一種利用微生物催化制備(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的方法，屬于生物催化技術(shù)領域。本發(fā)明利用克魯維假絲酵母(Kluyveromycessp.)CCTCCM2011385全細胞不對稱還原4-氯苯基-(吡啶-2-基)-甲酮，合成(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇，首先篩選出對潛手性酮底物具有高立體選擇性羰基還原酶活性的微生物，然后確定不對稱還原反應的一系列條件，如反應溫度、pH、細胞濃度、底物濃度、反應時間以及添加劑(包括各種輔溶劑、PEG、磷酸鹽等)的添加進行優(yōu)化，產(chǎn)物(S)-(4-氯苯基)-(吡啶-2-基)-甲醇的對映體過量值和產(chǎn)率分別可以達到86.7%e.e.和92.1%。利用硅膠柱層析法對產(chǎn)物進行了初步的分離提取，分離后產(chǎn)物的純度為99.2％，提取收率為56.7％。
文檔編號C12P17/12GK102559520SQ20111041999
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者倪曄, 周婕妤, 孫志浩 申請人:江南大學