一種海藻酸裂解酶sha-3基因及其原核表達(dá)載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種海藻酸裂解酶SHA-3基因及其原核表達(dá)載體PGEX-4T-1-5B4-J，該載體高效表達(dá)海藻酸裂解酶蛋白SHA-3。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)海洋資源的開(kāi)發(fā)利用已逐漸成為研宄的熱點(diǎn)，海藻酸因其獨(dú)特的理化性質(zhì)在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。海藻酸寡糖因具有多種生理活性，成為開(kāi)發(fā)新藥的聚焦點(diǎn)。同時(shí)海藻酸作為最豐富的海洋生物質(zhì)之一，因具有以下優(yōu)勢(shì):(1)光合作用效率高，生長(zhǎng)快，產(chǎn)量高，資源豐富；(2)生長(zhǎng)不占用耕地；(3)幾乎不含有木質(zhì)素，纖維素的含量很少，預(yù)處理簡(jiǎn)單，便于微生物的利用和發(fā)酵；從而在生物能源領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。目前，降解海藻酸的方法可分為三大類(lèi):第一類(lèi)是化學(xué)降解法，目前廣泛采用的是酸水解法，這種方法操作步驟繁瑣，反應(yīng)條件劇烈。第二類(lèi)是物理降解法，例如超聲降解海藻酸。第三類(lèi)是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸條件溫和，過(guò)程可控，得率高，綠色安全，作用機(jī)理明確，產(chǎn)物確定，可以根據(jù)具體目的產(chǎn)物要求選擇單一的酶制劑或使用不同底物專(zhuān)一性組合的酶制劑。
[0003]海藻酸裂解酶主要由海藻酸分解菌和一些海洋動(dòng)植物等產(chǎn)生，具有很大的應(yīng)用前景。但野生型海藻酸分解菌產(chǎn)酶量低且成本高，很難達(dá)到實(shí)際的應(yīng)用要求。因此，通過(guò)基因工程手段對(duì)海藻酸裂解酶基因進(jìn)行異源表達(dá)是提高海藻酸裂解酶產(chǎn)量的最有效途徑。1993年，Boyd等首次克隆了 Pseudomorms海藻酸裂解酶的編碼基因algL并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，其粗酶液活性達(dá)到146U/mg。1996年Frederic等將Pseudomonas
中編碼海藻酸裂解酶的基因aly在大腸桿菌中表達(dá)，其催化活性達(dá)到97U/mg。2009 年，GaofeiPseudoalteromonas sp.CY24 中克隆得到了海藻酸裂解酶基因alyPI，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，得到一個(gè)催化活性為121.6U/mg，分子量為58KD的蛋白。2012年，Hwan Hee Park等利用sp.MJ-3的基因組構(gòu)建基因文庫(kù)，篩選得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并將其在大腸桿菌中表達(dá)，得到了一種對(duì)PolyM和PolyG都有活性的雙功能酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種海藻酸裂解酶SHA-3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:I所示，本海藻酸裂解酶SHA-3基因來(lái)源于iferiflicaiefla alginatilytica SH-52 (保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013073),由本實(shí)驗(yàn)室全基因組測(cè)序獲得，通過(guò)BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示與Cellulophaga baltica NN016038的海藻酸裂解酶的相似度為71%。
[0005]本發(fā)明另一目的是提供一種海藻酸裂解酶SHA-3基因的原核表達(dá)載體，該載體含有Ptac啟動(dòng)子、終止子和海藻酸裂解酶基因細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS、GST標(biāo)簽，
基因的上游為Ptac啟動(dòng)子，Ptac啟動(dòng)子的下游為可被IPTG誘導(dǎo)的操縱子序列，緊靠基因起始密碼子上游的是一個(gè)GST標(biāo)簽序列，可生成融合表達(dá)蛋白，之后通過(guò)凝血酶可將GST標(biāo)簽切除而不影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)活性。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是將algina ti Iyti ca SH-52海藻酸裂解酶SHA-3基因的原核表達(dá)載體應(yīng)用在制備海藻酸裂解酶SHA-3中。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
I > Marini ca tena algina ti Iyti ca SH-52海藻酸裂解酶基因的獲得和原核表達(dá)載體的構(gòu)建
(1)根據(jù)alginati Iyti ca SH-52海藻酸裂解酶基因編碼框序列和原核表達(dá)載體PGEX-4T-1多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)I對(duì)特異引物如下:
SHA-3-F:5’ - GGATCCATGATGACCAAAACATTAGTG-3’
SHA-3-R: 5’ -GCGGCCGCTTAATACATCAGCTTCAACTCAAT-3’，在 h下游引物的 5’端分別加入BamH I和Not I酶切位點(diǎn)(下劃線為酶切位點(diǎn));提取iferiflicaieaa algina ti Iyti ca SH-52的基因組，使用上述引物進(jìn)行擴(kuò)增；
(2)回收并純化海藻酸裂解酶全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到PMD19-T載體上，采用SDS-堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD19T-5B4-J;
(3)構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-l-5B4-J，用BamHI和Not I雙酶切pMD19T_5B4-滿口PGEX-4T-1，并回收純化海藻酸裂解酶基因片段及pGEX_4T_l載體片段，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，獲得原核表達(dá)載體PGEX-4T-1-5B4-J，進(jìn)行測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
[0008]2、海藻酸裂解酶SHA-3的原核表達(dá)
使用熱刺激法將pGEXIT-l-^-^S轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)下篩選最佳表達(dá)條件，并在最適條件下進(jìn)行大量表達(dá)；
3、海藻酸裂解酶SHA-3的蛋白純化
收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，得到的上清通過(guò)GST瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行純化，收集純化后的蛋白用于SHA-3的蛋白表達(dá)檢測(cè)及下一階段實(shí)驗(yàn)；
4、重組海藻酸裂解酶SHA-3的特性研宄
對(duì)純化后的海藻酸裂解酶SHA-3進(jìn)行以下特性研宄:最適溫度，最適pH等，本發(fā)明獲得的重組海藻酸裂解酶SHA-3，其最適溫度為55°C，最適pH為7.5 ;本發(fā)明中采用的測(cè)定方法為常規(guī)海藻酸裂解酶酶活性測(cè)定方法，測(cè)定反應(yīng)底物在A235nm處吸光值的變化。
[0009]本發(fā)明對(duì)新型的來(lái)自于厭氧海藻酸分解菌algina ti Iyti ca SH-52中海藻酸裂解酶基因—-^5進(jìn)行了擴(kuò)增，并進(jìn)一步進(jìn)行原核表達(dá)和蛋白純化，獲得了 SHA-3蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)海藻酸裂解酶的野生菌株通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)到產(chǎn)酶，至少需要3天的時(shí)間，而本發(fā)明的基因工程菌株只需1h即可獲得最大量的目的蛋白，本發(fā)明所獲得的重組海藻酸裂解酶SHA-3蛋白具有廣泛的底物特異性，既能利用PolyM也能利用PolyG為底物，酶活可以達(dá)到12U/mg，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的雙功能酶，本發(fā)明原核表達(dá)載體及整體表達(dá)系統(tǒng)容易操作，便于工業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明解決了現(xiàn)有的產(chǎn)海藻酸裂解酶菌株酶產(chǎn)量較低的問(wèn)題，也為進(jìn)一步對(duì)海藻酸裂解酶SHA-3進(jìn)行機(jī)理及機(jī)制研宄奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1 是本發(fā)明algina ti Iyti ca SH-52 基因組 DNA 的檢測(cè)不意圖，圖中:M是DNA marker ;1和2是基因組DNA ；
圖2是本發(fā)明海藻酸裂解酶SHA-3基因的TA克隆策略示意圖；
圖3是本發(fā)明重組質(zhì)粒PMD19T-5B4-旅]電泳檢測(cè)示意圖，圖中:M是DNA marker ;1_2是 pMD19T-5B4-J;
圖4是本發(fā)明重組質(zhì)粒PMD19T-5B4-旅]雙酶切檢測(cè)示意圖，圖中:M是DNA marker ；1-2 是 BamH I 與 Not I 雙酶切的 pMD19T_5B4-J質(zhì)粒；
圖5是本發(fā)明重組質(zhì)粒pMD19 ?-SHA-m PCR檢驗(yàn)示意圖，圖中:M是DNA marker ；1是負(fù)對(duì)照；2-5是以PMD19T-5B4-戲/模板，用SHA-3-F，SHA-3-R為引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；
圖6是本發(fā)明海藻酸裂解酶基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；
圖7是本發(fā)明重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-5B4-旅]電泳檢測(cè)示意圖，圖中:M是DNA marker ；1-2 是 pGEX-4T-l-5B4-J;
圖8是本發(fā)明重組質(zhì)粒PGEX-4T-1-5B4-旅]酶切檢測(cè)示意圖，圖中:M是DNA marker ；
I是BamH I與Not I雙酶切的的pGEX-4T-l_5B4-J質(zhì)粒；
圖9是本發(fā)明海藻酸裂解酶SHA-3表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)示意圖，圖中:M是蛋白marker ；1是pGEX_4T_l質(zhì)粒在28 °C，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，6h的細(xì)菌總蛋白；2是pGEX-4T-l-5B4-J質(zhì)粒在28 °C，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，6h的細(xì)菌總蛋白；3_8是PGEX-4T-1-5B4-J質(zhì)粒在 28°C，經(jīng) ImM IPTG 誘導(dǎo)后，2、4、6、8、10、12h 的細(xì)菌總蛋白；
圖10是本發(fā)明海藻酸裂解酶SHA-3在28°C下表達(dá)情況，圖中:M是蛋白marker ；1是PGEX-4T-1-5B4-J質(zhì)粒在 28°C未經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)，1h 的細(xì)菌總蛋白；2_7 是 pGEX_4T_l- SHA-3質(zhì)粒在28°C、經(jīng)終濃度分別為0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mMIPTG誘導(dǎo)1h的細(xì)菌總蛋白；圖11是本發(fā)明海藻酸裂解酶SHA-3在不同溫度誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，圖中:M是蛋白marker ； I是pGEX-4T-l_5B4-J質(zhì)粒在28 °C未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，1h的細(xì)菌總蛋白；2_6是PGEX-4T-1-5B4-J質(zhì)粒分別在15、20、25、28、30°C經(jīng)終濃度為ImM IPTG誘導(dǎo)1h的細(xì)菌總蛋白；
圖12是本發(fā)明海藻酸裂解酶的純化電泳示意圖，圖中:M是蛋白marker ;1是純化前的細(xì)菌上清蛋白；2是純化后的流川液；3是純化后的洗滌液；4是用還原性谷胱甘肽洗脫后的洗脫液；
圖13是本發(fā)明海藻酸裂解酶SHA-3的最適pH示意圖，圖中:菱形曲線為SHA-3蛋白在pH6.0-8.0磷酸鹽緩沖液中的活性示意圖；正方形曲線為SHA-3蛋白在pH8.0-9.0Tris-HCl緩沖液中的活性示意圖；
圖14是本發(fā)明海藻酸裂解酶SHA-3的最適溫度示意圖；
圖15是本發(fā)明海藻酸裂解酶SHA-3的金屬離子影響示意圖；
圖16是本發(fā)明海藻酸裂解酶SHA-3的底物特異性示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的采用常規(guī)方法，使用的試劑如無(wú)特殊說(shuō)明的使用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。
[0012]本實(shí)施例中試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑，各種限制性內(nèi)切酶、pfu DNA聚合酶、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)及北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器；所有引物序列均在上海生工合成。
[0013]實(shí)施例\., Marinicatena algina ti Iyti ca SH-52 基因組 DNA 的制備與檢測(cè)本發(fā)明所用的Marinicatena algina ti Iyti ca SH-52為本實(shí)驗(yàn)室篩選菌株，SH-52基因組DNA的制備采用普通細(xì)菌基因組提取方法，具體內(nèi)容如下:取2mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液于4°C，4000rpm離心2min，棄盡上清液，收集菌體；加入10ul Solut1n I懸菌、30 μ I 10%SDS和I μ I 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37°C孵育I小時(shí)；加入100 μ I 15mol/L NaCl，混勻；加入20 μ I CTAB/NaCl 溶液(CTAB 10%，NaCl 0.7mol/L)，混勻，65°C，10 分鐘；加入等體積酚/ 氯仿/異戊醇(25:24:1)混勻，12000rpm離心5分鐘；取上清，加入2倍體積無(wú)水乙醇，0.1倍體積3mol/L NaOAC, _20°C放置30分鐘；12000rpm離心10分鐘；沉淀加入70%乙醇洗滌；沉淀干燥后，溶于20 μ I TE，-20°C保存。取2 μ I基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果(圖1