專利名稱：一種含有mrp-2基因3′utr和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種含有MRP-2基因的3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)多種藥物產(chǎn)生抗藥性的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)不同、靶位不同、作用方式不同的抗腫瘤藥物均產(chǎn)生的交叉耐藥性。多藥耐藥是最重要、最常見的腫瘤耐藥現(xiàn)象，成為腫瘤治療中最大的障礙之一。多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP-2是三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合盒運(yùn)載體基因家族成員之一，也稱ABCC2 (ATP-binding cassette, subfamily C, member 2)，又名管狀多特異性有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cMOAT)，是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與腫瘤多藥耐藥相關(guān)的基因。MRP-2轉(zhuǎn)運(yùn)的抗癌藥物包括甲氨蝶呤、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿、順鉬、依托泊苷和一些兩性陰離子藥物及內(nèi)源性的化合物如葡萄糖醛酸鹽和硫酸鹽等。近幾年，MRP-2介導(dǎo)的MDR是研究多藥耐藥機(jī)制的熱點(diǎn)之一。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和模式生物基因組計(jì)劃的進(jìn)行，人們對(duì)于占人類基因組95%以上的非編碼序列的研究日益加強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，它們中很多是具有生物學(xué)功能和意義的片段，在這些研究之中，對(duì)于大小約21-23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA的microRNA的研究則是最為熱點(diǎn)之一。在近幾年腫瘤的研究中，關(guān)于microRNA對(duì)于腫瘤的功能與調(diào)控的研究一直是腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，取得了很大的突破與進(jìn)展。目前研究表明，microRNA 主要是通過結(jié)合到靶標(biāo)基因的3' UTR區(qū)域，進(jìn)而抑制靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，因此基因的3' UTR的抑制程度能夠指示該基因受到microRNA抑制的水平。然而，現(xiàn)階段對(duì)于多藥耐藥與 microRNA的相關(guān)研究報(bào)道并不多見，對(duì)MRP-2蛋白與microRNA的研究更是鮮有報(bào)導(dǎo)，目前沒有一種簡(jiǎn)便、快捷的方法用來篩選能夠抑制多藥耐藥蛋白的microRNA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種含有MRP-2基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的第二個(gè)目的是，提供上述重組質(zhì)粒的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是，提供上述重組質(zhì)粒在篩選抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種含有MRP-2基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，所述報(bào)告基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶基因pGL3。為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種含有MRP-2基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的制備方法，包括以下步驟
(1)用pGL3-pr0m0ter質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增，堿裂解法制備pGL3-pr0m0ter質(zhì)粒，電泳檢測(cè)質(zhì)粒的純度和含量，用NcoI和HindIII對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，試劑盒凝膠回收大片段的酶切產(chǎn)物；
(2)MRP-2基因的3'UTR序列的克隆、酶切及純化，所用的引物為引物 1: 5' - CCCAAGCTTTGGGTTAGAAAAGGAC -3'；
引物 2: 5' - CATGCCATGGTTCAGGACAGTGGTTGT -3'；
以基因組DNA為模板，利用常規(guī)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，用試劑盒凝膠回收PCR產(chǎn)物，將回收的PCR產(chǎn)物用NcoI和HindIII雙酶切；
(3)將上述獲得的pGL3-pr0m0ter載體和MRP-2基因3'UTR片段進(jìn)行連接反應(yīng)；
(4)篩選重組子，將上述連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化子的平板上隨即挑取菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后用堿裂解法少量提取質(zhì)粒備用，經(jīng)過酶切、PCR、測(cè)序鑒定。為了實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種含有MRP-2基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒在篩選抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的應(yīng)用。作為一個(gè)優(yōu)選方案，用PGL3-MRP-2-3 ‘ UTR-promoter質(zhì)粒聯(lián)合海腎熒光素酶PRL-SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染耐藥型腫瘤細(xì)胞系，通過同時(shí)檢測(cè)兩種熒光素酶活性來反應(yīng) microRNA對(duì)MRP-2基因3 ‘ UTR活性的抑制作用。作為又一個(gè)優(yōu)選方案，所述耐藥型腫瘤細(xì)胞系為結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116/L-0HP。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，通過同時(shí)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性來反應(yīng)microRNA對(duì)于MRP-2基因3 ‘ UTR區(qū)的抑制活性，即其對(duì)于MRP-2的抑制活性，從而建立靶向篩選逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的microRNA的方法。該方法在篩選逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的 microRNA、研究逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥與microRNA之間的作用機(jī)理以及研究腫瘤細(xì)胞多藥耐藥microRNA水平的機(jī)制等方面有極佳的應(yīng)用前景。


圖1為MRP-2基因3' UTR序列的克隆，其中Marker為DL2000，1和2為MRP-2 基因 3' UTR 片段(261bp)。圖 2 為 pGL3-MRP-2-3 ‘ UTR-promoter 重組質(zhì)粒的 Nhe I 和 Bgl II 雙酶切檢測(cè)， 其中 Markerl 為 DL10000, Marker2 為 DL2000，1 和 2 為 pGL3-MRP_2_3‘ UTR-promoter/ HindIII + NcoI (5010bp+261bp)。圖 3 為運(yùn)用 pGL3-MRP-2-3 ‘ UTR-promoter 質(zhì)粒在 HCT116/L-0HP 細(xì)胞中篩選對(duì)于MRP-2基因3 ‘ UTR活性有影響的microRNA，以空白pGL3-promoter質(zhì)粒熒光活性為 Control，l 為空白、2 為 hsa_miR-148a、3 為 hsa_miR-222、4 為 hsa_miR-297、5 為 hsa_miR-630、6 為 hsa-miR-1915。圖 4 為檢驗(yàn) pGL3-MRP-2-3' UTR-promoter 質(zhì)粒在 HCTl 16/L-0HP 細(xì)胞中篩選出的對(duì)于MRP-2基因有抑制作用的microRNA，1為hsa_miR-148a、2為hsa_miR-222、3為 hsa-miR-297>4 % hsa-miR-630>5 % hsgi_miR_1915。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的含有MRP-2基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建和應(yīng)用的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)說明。
實(shí)施例1、構(gòu)建含有MRP-2基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒一、試驗(yàn)材料
1、菌株、質(zhì)粒
(1)菌株大腸桿菌E.C0liDH5a，耐藥性型大腸癌細(xì)胞株HCT116/L-0HP由華東理工大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)，對(duì)于奧沙利鉬的IC5tl為167μ g/ml，耐藥倍數(shù)為9. 7 ；
(2)質(zhì)粒pGL3-promoter和pRL_SV40為本實(shí)驗(yàn)室保存。2、生化試劑
(1)ExTaq酶，限制性內(nèi)切酶 Hindlll，NcoI 和 DNA Ligation Kit 購(gòu)自 TaKaRa 公司。 DL2000 marker 和 λ DNA/Hind III marker 購(gòu)自上海 MajorBio 公司。PRMI 1640 培養(yǎng)液 (Hyclone)； Lipofect Transfection Reagent (TIANGEN, Beijing)；
(2)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自KenReal公司。質(zhì)?；厥赵噭┖泻虳NA片段回收試劑盒購(gòu)自Tiangen公司；
(3)小牛血清購(gòu)自民海生物公司。BSA，NaCl，NaF,Tris, EDTA, Trytone，Yeast Extract, PMSF, PAGE, SDS, Tween-20，G250，硼酸，甘氨酸，亮肽，蛋白顯影液等試劑購(gòu)自上海MajorBio 公司。MRP-2，β-actin抗體購(gòu)買于cell signal公司。3、主要試劑的配制
100mg/mL 牛血清白蛋白(BSA):稱取 BSA 0. Ig 溶于 ImL 0. 15 M NaCl, - 20° C 保存。 制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用0. 15M NaCl進(jìn)行100倍稀釋成lmg/mL，一 20° C保存。蛋白電泳緩沖液(5X):稱取Tris 15. lg，甘氨酸94g，SDS 5g溶于IL超純水，室溫保存。蛋白轉(zhuǎn)移緩沖液(5X )稱取Tris 29g，甘氨酸14. 5g，SDS 1. 85g溶于IL超純水， 室溫保存。臨用前稀釋為IX，每升加入甲醇200 mL。1.5 M Tris ‘ HCl CpH 8. 8)稱取 Tris 45. 43g 溶于 200mL，濃鹽酸調(diào) pH 至 8. 8， 超純水定容至250 mL，4° C保存。0. 5 M Tris · HCl (pH 6. 8)稱取 Tris 15. 14g 溶于 200mL，濃鹽酸調(diào) pH 至 6. 8， 超純水定容至250 mL，4° C保存。30%丙烯酰胺稱取丙烯酰胺29g，甲叉雙丙烯酰胺Ig溶于100 mL，濾紙過濾于棕色瓶中4° C保存。TBS緩沖液(5X )稱取Tris 24. 2g，NaCl 80g溶于IL超純水，室溫保存。TBST 緩沖液(含 0. 1% Tween-20 的 TBS 緩沖液):量取 Tween-20 ImL 溶于 IL TBS, 即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液)稱取脫脂奶粉5g溶于IOOmL TBST，溶
解后4° C保存。G250考馬斯亮藍(lán)溶液(測(cè)蛋白含量專用)稱取G250 lOOmg，溶于50mL 95%乙醇， 量取IOOmL磷酸，超純水定容至1L，濾紙過濾，4° C保存。1 M Tris · HCl CpH 7. 5)稱取 Tris 30. 29g 溶于 200mL 超純水，濃鹽酸調(diào) pH 至 8. 8，超純水定容至250 mL，4° C保存。1 M DTT 稱取 DTT 3. 085g 溶于 20mL 0. OlM 乙酸鈉溶液，-20° C 保存。20mg/mL PMSF 稱取 PMSF 0. 2g 溶于 IOmL 異丙醇，-20° C 保存。
細(xì)胞總蛋白提取液稱取NaCl 0. 73g，NaF 0. 524g，EDTA 0. 931g，SDS 0. 25g，去氧膽酸鈉 2. 5g，量取 Triton-100 2. 5mL, 1 M Tris · HCl (pH 7.5) 2. 5mL，超純水定容至 250mL，4° C 保存。用時(shí)每毫升提取液中加 1 μ L DTT(lM)、5yL PMSF (20mg/mL)、10 μ L 亮肽(2. 5mg/mL)即可。SDS-聚丙烯酰胺分離膠(5mL)
權(quán)利要求
1.一種含有MRP-2基因3' UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述報(bào)告基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶基因。
2.權(quán)利要求1所述的一種含有MRP-2基因3'UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)用pGL3-pr0m0ter質(zhì)粒轉(zhuǎn)化常規(guī)制備的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增，堿裂解法制備pGL3-pr0m0ter質(zhì)粒，電泳檢測(cè)質(zhì)粒的純度和含量，用NcoI和HindIII對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，試劑盒凝膠回收大片段的酶切產(chǎn)物；(2)MRP-2基因的3'UTR序列的克隆、酶切及純化，所用的引物為引物 1: 5' - CCCAAGCTTTGGGTTAGAAAAGGAC -3'；引物 2: 5' - CATGCCATGGTTCAGGACAGTGGTTGT -3'；以基因組DNA為模板，利用常規(guī)PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，用試劑盒凝膠回收PCR產(chǎn)物，將回收的PCR產(chǎn)物用NcoI和HindIII雙酶切；(3)將上述獲得的pGL3-pr0m0ter載體和MRP-2基因3'UTR片段進(jìn)行連接反應(yīng)；(4)篩選重組子，將上述連接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)過含有氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化子的平板上隨即挑取菌落，擴(kuò)增培養(yǎng)后用堿裂解法少量提取質(zhì)粒備用，經(jīng)過酶切、PCR、測(cè)序鑒定。
3.權(quán)利要求1所述的一種含有MRP-2基因3'UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒在篩選抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種含有MRP-2基因3'UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒在篩選抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的應(yīng)用，其特征在于，用pGL3_MRP-2_3 ‘ UTR-promoter質(zhì)粒聯(lián)合海腎熒光素酶pRL_SV40質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染耐藥型腫瘤細(xì)胞系，通過同時(shí)檢測(cè)兩種熒光素酶活性來反應(yīng)microRNA對(duì)MRP-2基因3 ‘ UTR活性的抑制作用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種含有MRP-2基因3'UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒在篩選抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的應(yīng)用，其特征在于，所述耐藥型腫瘤細(xì)胞系為結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116/L-0HP。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有MRP-2基因3′UTR和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒及其應(yīng)用，將構(gòu)建的MRP-2基因3′UTR報(bào)告基因載體與pRL-SV40載體及所需篩選的microRNA共轉(zhuǎn)染到耐藥型的結(jié)腸癌細(xì)胞系中，通過同時(shí)檢測(cè)螢火蟲和海腎熒光素酶的活性來反應(yīng)microRNA對(duì)于MRP-2基因3′UTR區(qū)的抑制活性，從而建立靶向篩選逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的microRNA的方法。該方法在篩選逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的microRNA、研究逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥與microRNA之間的作用機(jī)理以及研究腫瘤細(xì)胞多藥耐藥microRNA水平的機(jī)制方面有極佳的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102492712SQ201110437408
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者劉建文, 徐可, 梁欣, 江林, 沈克, 程卓安 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)