專利名稱：一種ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病是一類疾病，包括帕金森、阿爾茨海默等疾病，目前尚無有效、特異療法，干細(xì)胞移植替代療法具有良好的前景。移植入體內(nèi)干細(xì)胞來源的神經(jīng)元必須能與宿主神經(jīng)系統(tǒng)存留的神經(jīng)元之間建立有功能的突觸聯(lián)系，才能恢復(fù)突觸信息的傳遞。目前的多種研究只是在形態(tài)學(xué)方面提供了間接證據(jù)，尚未在功能上尤其是傳遞信息的突觸層
面闡明該問題。光遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展可以解決該問題。利用遺傳學(xué)技術(shù)使細(xì)胞表達(dá)光敏感蛋白，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞功能的光學(xué)控制，斯坦福大學(xué)的Deisseroth教授等將這種結(jié)合光學(xué)和遺傳學(xué)結(jié)合的技術(shù)稱為光遺傳學(xué)技術(shù)。光敏感蛋白是能夠被光激活的一類膜蛋白，廣泛分布于原核生物、植物以及動(dòng)物的視覺系統(tǒng)中，目前在光控神經(jīng)元研究中廣泛應(yīng)用的是光敏感蛋白(Channelrhodopsin-2,簡(jiǎn)稱ChR2)。ChR2是從單細(xì)胞綠藻中分離出來的一種感光性膜表達(dá)陽離子通道蛋白，能夠通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)表達(dá)在神經(jīng)元的細(xì)胞膜上，當(dāng)在低能量470nm藍(lán)光瞬間(5-15ms)照射下，ChR2通道打開，Na+、Ca2+等陽離子進(jìn)入胞內(nèi)引起細(xì)胞去極化從而產(chǎn)生動(dòng)作電位，而且不會(huì)影響神經(jīng)元生物活性，因此是目前最常用的光敏感蛋白。通過基因轉(zhuǎn)染，使干細(xì)胞同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)ChR2_GFP，其中GFP (綠色熒光蛋白，英文為green fluorescent protein,簡(jiǎn)稱GFP)用于示蹤干細(xì)胞,ChR2用于刺激細(xì)胞；移植入體內(nèi)后，干細(xì)胞來源的神經(jīng)元穩(wěn)定表達(dá)ChR2和GFP，通過GFP示蹤其位置，同時(shí)470nm激光光刺激表達(dá)ChR2的干細(xì)胞分化來源神經(jīng)元細(xì)胞，同時(shí)通過膜片鉗技術(shù)記錄宿主神經(jīng)元的突觸后電流，研究移植干細(xì)胞來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)元細(xì)胞的功能整合，為臨床干細(xì)胞移植治療變性疾病提供理論依據(jù)。然而，快速構(gòu)建、篩選重組細(xì)胞株不是一件容易的事，提高重組基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株的構(gòu)建篩選效率也一直是重組干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的重要內(nèi)容之一，一種好的構(gòu)建、篩選方法可以節(jié)省大量的人力、物力，并加快科學(xué)研究的步伐。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株，所述細(xì)胞株為能穩(wěn)定表達(dá)光敏感蛋白(channelrhodopsin-2, ChR2)和綠色突光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)的重組 C17. 2 神經(jīng)干細(xì)胞株。本發(fā)明的另一目的是提供一種構(gòu)建ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株的方法，包括如下步驟第一步，重組慢病毒的構(gòu)建和篩選接種293FT細(xì)胞于加有10%FBS+DMEM培養(yǎng)基的24孔板中，每孔細(xì)胞接種細(xì)胞數(shù)為I X IO5個(gè)，然后用慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锖虲hR2-GFP慢病毒表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述293FT細(xì)胞,24小時(shí)換為含1%FBS DMEM培養(yǎng)液，48小時(shí)5000rpm離心5min收集培養(yǎng)液上清，0. 45 u m的PVDF膜過濾所述上清得重組慢病毒液。以標(biāo)準(zhǔn)病毒液I X IO8Cfu / L為對(duì)照，將重組慢病毒液和標(biāo)準(zhǔn)病毒液按感染復(fù)數(shù)值分別設(shè)5個(gè)梯度1、3、5、10和20，感染293FT細(xì)胞并于24小時(shí)后根據(jù)綠色熒光細(xì)胞的強(qiáng)度和數(shù)量確定病毒滴度，當(dāng)表達(dá)GFP的細(xì)胞超過95%、慢病毒液滴度達(dá)I. OX IO8Cfu / L的重組慢病毒液用于下一步實(shí)驗(yàn)。第二步，重組C17. 2神經(jīng)干細(xì)胞株的構(gòu)建和篩選C17. 2神經(jīng)干細(xì)胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37°C、5%C02 6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞至50%融合時(shí)每孔更換Iml新的10%FBS (胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基，加入Iul所述重組慢病毒液，同時(shí)加入病毒感染輔助劑Polybrene使終濃度為8 u g/ml，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，換為DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞80%_90%貼壁時(shí)以密度2X IO4 / ml傳代至IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。在熒光顯微鏡下在所述IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿的底部標(biāo)記表達(dá)GFP的細(xì)胞群，PBS清洗3遍后，將0. 05%胰酶-EDTA滴在剪成直徑3mm的無菌濾紙片上，含有胰酶的濾紙片貼在已經(jīng)標(biāo)記GFP的細(xì)胞群上面，370C 3min后，將濾紙片加入新的含有10%FBS DMEM培養(yǎng)基的IOcm平皿中，終止消化，輕輕吹打，使黏附在濾紙片的細(xì)胞分散在平皿中，4天后，通過FACS分選出表達(dá)GFP 0.5%比率的細(xì)胞，并以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度傳至96孔板中。再通過免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)和全細(xì)胞對(duì)光反應(yīng)膜片鉗鑒定獲得重組ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株。本發(fā)明中，ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株可以同時(shí)穩(wěn)定表達(dá)ChR2_GFP，且可以穩(wěn)定傳代，并且470nm藍(lán)光刺激能引起細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)向電流。本發(fā)明方法構(gòu)建重組干細(xì)胞，尤其是利用濾紙片消化法提高了 GFP陽性細(xì)胞的比率，有利于流式(FACS)分選，提高了實(shí)驗(yàn)效率。本發(fā)明的細(xì)胞株可用于移植干細(xì)胞分化來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)系統(tǒng)功能整合的在體及離體研究，為干細(xì)胞移植后分化來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)系統(tǒng)功能整合的研究提供一個(gè)良好的平臺(tái)。


圖I為本發(fā)明ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株的光學(xué)顯微鏡圖；圖2為本發(fā)明免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株表達(dá)ChR2-GFP蛋白和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin蛋白的熒光圖；圖3為本發(fā)明全細(xì)胞對(duì)光反應(yīng)膜片鉗鑒定ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株的對(duì)470nm藍(lán)光刺激反應(yīng)能力的電流具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍。本發(fā)明不限于下述實(shí)施方式或?qū)嵤├?，凡不違背本發(fā)明精神所做出的修改及變形，均應(yīng)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明構(gòu)建ChR2_GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)例第一步，重組慢病毒的構(gòu)建和篩選接種293FT細(xì)胞于加有10%FBS+DMEM培養(yǎng)基的24孔板中，每孔細(xì)胞接種細(xì)胞數(shù)為I X IO5個(gè)，然后用慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锖虲hR2-GFP慢病毒表達(dá)質(zhì)粒(購買于Addgene公司)共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞；24小時(shí)換為含1%FBS DMEM培養(yǎng)液；48小時(shí)收集細(xì)胞，5000rpm離心5min, 0. 45 u m的PVDF膜過濾上清后用作待測(cè)病毒液(重組慢病毒液)；以標(biāo)準(zhǔn)病毒液IXlO8Cfu / L為對(duì)照，將待測(cè)病毒液和標(biāo)準(zhǔn)病毒液按感染復(fù)數(shù)值分別設(shè)5個(gè)梯度1、3、5、10和20，感染293T細(xì)胞并于24小時(shí)觀察綠色熒光細(xì)胞的強(qiáng)度和數(shù)量以確定病毒滴度，將表達(dá)GFP的細(xì)胞超過95%，病毒液滴度達(dá)I. OX IO8Cfu / L的重組慢病毒液用于下一步實(shí)驗(yàn)。
第二步，轉(zhuǎn)導(dǎo)C17. 2神經(jīng)干細(xì)胞株，熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)(fluorescenceactivated cell sorting,簡(jiǎn)稱FACS)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株C17. 2神經(jīng)干細(xì)胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37°C、5%C02 6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞至50%左右融合，首先換為lmllO%FBS (胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基，再取Iul (I.OX IO8Cfu / L)含有ChR2_GFP基因的慢病毒加入培養(yǎng)液 中，同時(shí)加入病毒感染輔助劑Polybrene(終濃度8iig / ml )，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，換為正常DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代至IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中(2X IO4 / ml)，同時(shí)在熒光顯微鏡下在IOcm平皿的底部標(biāo)記表達(dá)GFP的細(xì)胞群，然后PBS清洗3遍，然后將0. 05%胰酶-EDTA(Gibco)滴在剪成直徑3mm的無菌濾紙片上，含有胰酶的濾紙片貼在已經(jīng)標(biāo)記GFP的細(xì)胞群上面，37°C 3min后，將濾紙片加入新的含有10%FBS DMEM培養(yǎng)基的IOcm平皿中，終止消化，輕輕吹打，使黏附在濾紙片的細(xì)胞分散在平皿中，4天后，通過FACS分選出表達(dá)GFP 0. 5%比率的細(xì)胞，并以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度傳至96孔板中。FACS分選出的ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株的光學(xué)顯微鏡圖如圖I所示，呈單克隆樣成長(zhǎng)。將分選的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)ChR2_GFP蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)方法為a. ChR2-GFP的基因工程化干細(xì)胞以I X IO5 / ml的密度接種于預(yù)先放入滅菌的直徑為12mm的圓玻璃爬片的24孔板內(nèi)，用固定液4%多聚甲醛溶液固定，再棄固定液，PBS振洗 3 X5min。b.每孔加 200 V- I 4°C保存的 0. 1% triton,室溫孵育 IOmin, PBS 振洗 3X5min。c.每孔加200 U I濃度為10%正常山羊血清工作液，室溫孵育30min。d.吸去多余液體,加300 ii I含有1:200 Rabbit-anti_GFP—抗(碧云天生物技術(shù)研究所)和 1:300 Mouse-anti-Nestin (Abeam) 一抗，37°C孵育 Ih 后，4°C過夜。e.次日，PBS 振洗 3X5min。f.加入300 ill I 200的FITC-標(biāo)記的山羊抗兔IgG和Cy3_標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，37°C孵育lh。g. PBS 振洗 3 X 5min。h. DAPI 染色后，PBS 振洗 3 X 5min。i. GVA水溶性封片劑封片，Olympus DP71數(shù)碼顯微照相機(jī)照相。免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)ChR2_GFP蛋白的表達(dá)的熒光圖如圖2所示，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，綠色熒光為GFP蛋白即說明了 ChR2-GFP蛋白的表達(dá)，紅色熒光為神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin蛋白的表達(dá)。由此說明成功獲得ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株。將分選的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞對(duì)光反應(yīng)膜片鉗鑒定對(duì)光反應(yīng)能力，實(shí)驗(yàn)方法為在暗室內(nèi)將細(xì)胞爬片置于灌流槽中，用室溫下氧飽和的細(xì)胞外液灌流(l_2ml/min)。選擇表面光潔、折光性強(qiáng)的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)，玻璃微電極拉制好并充灌適量的電極內(nèi)液(葡萄糖酸鉀 140mM, MgCl2 2mM, K2ATP2mM, EGTA I. ImM, HEPES 10mM)，調(diào)節(jié)微操縱器，使電極尖端接近細(xì)胞，利用特定的測(cè)試方波電脈沖形成封接，Giga歐(IO9 Q )封接完成后穩(wěn)定Imin,輕輕吸破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞膜片鉗模式，細(xì)胞穩(wěn)定2min后，立即記錄其靜息膜電位(RMP)、膜電容(Cm)及膜阻抗。電壓鉗模式下將膜電位鉗制在_25mV，同時(shí)給予470nm藍(lán)光刺激，記錄細(xì)胞對(duì)光反應(yīng)電流。細(xì)胞對(duì)470nm藍(lán)光刺激反應(yīng)能力的電流圖如圖3所示，光反應(yīng)電流最大可為150pA，也說明成功獲得ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技 術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株，其特征在于所述細(xì)胞株為能穩(wěn)定表達(dá)光敏感蛋白(ChR2)和綠色熒光蛋白(GFP)的重組C17. 2神經(jīng)干細(xì)胞株。
2.—種構(gòu)建權(quán)利要求I所述的ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株的方法，其特征在于包括如下步驟 第一步，重組慢病毒的構(gòu)建和篩選 接種293FT細(xì)胞于加有10%FBS+DMEM培養(yǎng)基的24孔板中，每孔細(xì)胞接種細(xì)胞數(shù)為I X IO5個(gè)，然后用慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锖虲hR2-GFP慢病毒表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染所述293FT細(xì)胞,24小時(shí)換為含1%FBS DMEM培養(yǎng)液，48小時(shí)5000rpm離心5min收集培養(yǎng)液上清，O. 45 μ m的PVDF膜過濾所述上清得重組慢病毒液。
以標(biāo)準(zhǔn)病毒液I X IO8Cfu / L為對(duì)照，將所述重組慢病毒液和標(biāo)準(zhǔn)病毒液按感染復(fù)數(shù)值分別設(shè)5個(gè)梯度1、3、5、10和20，感染293FT細(xì)胞并于24小時(shí)后根據(jù)綠色熒光細(xì)胞的強(qiáng)度和數(shù)量確定病毒滴度，當(dāng)表達(dá)GFP的細(xì)胞超過95%、慢病毒液滴度達(dá)I. OX IO8Cfu / L的重組慢病毒液用于下一步實(shí)驗(yàn)。
第二步，重組C17. 2神經(jīng)干細(xì)胞株的構(gòu)建和篩選 C17. 2神經(jīng)干細(xì)胞株用10%FBS(胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37°C、5%C026孔板細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞至50%融合時(shí)每孔更換Iml新的10%FBS (胎牛血清)+5%馬血清+DMEM培養(yǎng)基，加入Iul所述重組慢病毒液，同時(shí)加入病毒感染輔助劑Polybrene使終濃度為8 μ g/ml，轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，換為DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞80%_90%貼壁時(shí)以密度2 X IO4 /ml傳代至IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。
在熒光顯微鏡下在所述IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿的底部標(biāo)記表達(dá)GFP的細(xì)胞群，PBS清洗3遍后，將O. 05%胰酶-EDTA滴在剪成直徑3mm的無菌濾紙片上，含有胰酶的濾紙片貼在已經(jīng)標(biāo)記GFP的細(xì)胞群上面，37°C 3min后，將濾紙片加入新的含有10%FBS DMEM培養(yǎng)基的IOcm平皿中，終止消化，輕輕吹打，使黏附在濾紙片的細(xì)胞分散在平皿中，4天后，通過FACS分選出表達(dá)GFP O. 5%比率的細(xì)胞，并以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度傳至96孔板中。再通過免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)和全細(xì)胞對(duì)光反應(yīng)膜片鉗鑒定獲得重組ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株及其構(gòu)建方法，所述細(xì)胞株為能穩(wěn)定表達(dá)光敏感蛋白(ChR2)和綠色熒光蛋白(GFP)的重組C17.2神經(jīng)干細(xì)胞株；通過構(gòu)建重組慢病毒、轉(zhuǎn)導(dǎo)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞株以及篩選獲得重組ChR2-GFP基因工程化神經(jīng)干細(xì)胞株；本發(fā)明的細(xì)胞株可用于移植干細(xì)胞分化來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)系統(tǒng)功能整合的在體及離體研究，為干細(xì)胞移植后分化來源的神經(jīng)元與宿主神經(jīng)系統(tǒng)功能整合的研究提供一個(gè)良好的平臺(tái)；本發(fā)明構(gòu)建重組干細(xì)胞方法，尤其是利用濾紙片消化法，提高了GFP陽性細(xì)胞的比率，有利于流式FACS分選，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102978164SQ201210459119
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者王少軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院