專利名稱：一種山羊口瘡病毒毒力弱化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山羊口瘡病毒毒力弱化方法，具體涉及利用犢牛睪丸細(xì)胞系將山羊口瘡病毒連續(xù)傳代培養(yǎng)使其毒力弱化的方法。背景技術(shù)：
羊傳染性膿皰俗稱羊口瘡(Orf virus)，是綿羊和山羊的一種由口瘡病毒所致的人獸共患傳染病，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為需申報類動物疾病，我國將其列為一類動物疫病。本病幾乎分布于世界所有養(yǎng)羊國家，自然情況下主要侵害綿羊和山羊，山羊較為多發(fā)。本病常呈群發(fā)性流行，3飛月齡羔羊最易感染，成年羊發(fā)病較少，病羊和帶毒羊是本病的傳染源。病毒可隨病羊的唾液、膿皰和水皰分泌物以及脫落的痂皮排出，其傳播途徑主要是經(jīng)損傷的皮膚或黏膜而感染。健康羊與病羊直接接觸，或接觸被病羊污染的飼槽、飼料、飲水、用具、墊草、牧場及廄舍等而感染。目前，在羊口瘡的高發(fā)區(qū)，并沒有商品化的羊口瘡疫苗進(jìn)行生產(chǎn)和銷售。在上世紀(jì) 80年代，蘭州畜牧獸醫(yī)研究所曾經(jīng)選育出毒力弱化的羊口瘡病毒毒株，達(dá)到了很好的保護(hù)率。但是隨著羊口瘡的流行，大量的地方株被鑒定，羊口瘡病毒出現(xiàn)了諸多的血清型，原來的弱毒株并不能為所有的山羊提供有效的保護(hù)。而且以前的弱毒株的弱化是利用的羊口瘡野毒株在原代犢牛睪丸細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，獲得細(xì)胞培養(yǎng)物，加入適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑后加工而成的，這樣就需要大量的犢牛睪丸進(jìn)行分離培養(yǎng)，耗費時間和財力。同時，在利用犢牛睪丸細(xì)胞進(jìn)行傳代時，由于犢牛的睪丸來源不穩(wěn)定，容易造成批次間的差異性。同時犢牛來源的檢疫不完善會造成疫苗生產(chǎn)的污染。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述背景技術(shù)中的不足之處，提供一種山羊口瘡病毒毒力弱化方法， 其利用犢牛睪丸細(xì)胞系，通過羊口瘡病毒的連續(xù)傳代培養(yǎng)，致使羊口瘡病毒毒力致弱，為羊口瘡病毒弱毒疫苗的制備與生產(chǎn)提供了穩(wěn)定可靠的方法，用以獲得大量的穩(wěn)定的疫苗。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于包括以下步驟1)羊口瘡病毒的分離與初步培養(yǎng)；2)羊口瘡病毒在犢牛睪丸細(xì)胞系連續(xù)傳代培養(yǎng)直到毒力弱化。步驟1)中，羊口瘡病毒的初步培養(yǎng)采用犢牛睪丸細(xì)胞系培養(yǎng)，犢牛睪丸細(xì)胞系的培養(yǎng)液為M199、DMEM (高糖)、RPMI_1640培養(yǎng)基。(此三類培養(yǎng)基皆可以用于犢牛睪丸細(xì)胞系的培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基含10%的犢牛血清，犢牛睪丸細(xì)胞系在37°C，5%0)2培養(yǎng)2 3天可以用于接種病毒)
步驟1)中，羊口瘡病毒分離于患病山羊的口唇部結(jié)痂。步驟2)中，犢牛睪丸細(xì)胞系是通過導(dǎo)入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄基因(hTERT)方法制備的。步驟2)中，羊口瘡病毒連續(xù)傳代到85代以后直到毒力弱化?，F(xiàn)有的羊口瘡病毒毒力弱化，需要以新生犢牛睪丸為原料，采用常規(guī)的原代細(xì)胞制備方法制備出睪丸原代細(xì)胞，用以增殖羊口瘡病毒，經(jīng)80余代次才能達(dá)到毒力弱化目的。然而，原代細(xì)胞有制備程序復(fù)雜、批次間細(xì)胞質(zhì)量數(shù)量差異等缺點。
本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下不需要采集制備睪丸原代細(xì)胞，直接用本種子細(xì)胞系，進(jìn)行羊口瘡病毒傳代弱化毒力。傳代細(xì)胞生物學(xué)性能穩(wěn)定，批次間細(xì)胞質(zhì)量穩(wěn)定，批次之間差異很小。細(xì)胞系用于弱化病毒更適于實驗室操作相對于制備原代睪丸細(xì)胞，其技術(shù)操作程序簡單、省時，價格便宜。四、附圖表說明


圖1為未接種羊口瘡病毒細(xì)胞系細(xì)胞圖； 圖2為接種4 后病變，細(xì)胞變圓，脫落圖； 圖3為接種后大量細(xì)胞變圓，出現(xiàn)空斑圖。五具體實施例方式
本發(fā)明為一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，包括以下步驟1)羊口瘡病毒的分離與初步培養(yǎng)；2)羊口瘡病毒在犢牛睪丸細(xì)胞系連續(xù)傳代培養(yǎng)直到毒力弱化。羊口瘡病毒的初步培養(yǎng)采用犢牛睪丸細(xì)胞系培養(yǎng)，犢牛睪丸細(xì)胞系的培養(yǎng)液為M199、DMEM (高糖)、 RPMI-1640培養(yǎng)基。(此三類培養(yǎng)基皆可以用于犢牛睪丸細(xì)胞系的培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基含10% 的犢牛血清，犢牛睪丸細(xì)胞系在37°C，5%0)2培養(yǎng)2 3天可以用于接種病毒。羊口瘡病毒分離于患病山羊的口唇部結(jié)痂。犢牛睪丸細(xì)胞系是通過導(dǎo)入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄基因(hTERT)方法制備的。羊口瘡病毒連續(xù)傳代到85代以后直到毒力弱化。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的使用范圍(參見圖1-3)。1、山羊口瘡病毒的分離與初步培養(yǎng)
采集患病奶山羊的口唇結(jié)痂，加入8 IOml的無菌PBS緩沖液進(jìn)行浸泡，同時加入3 5倍正常用量的青鏈霉素。M 3 后研磨，把懸濁液置于4°C過夜。第二天取出懸濁液 4000rpm,離心lOmin，取上清液0. 22 m濾膜過濾除菌，300 L 500 L接種犢牛睪丸細(xì)胞系，連續(xù)盲傳5代后，再接種犢牛睪丸細(xì)胞系后的48h、％h可觀察到細(xì)胞病變。2、羊口瘡病毒在犢牛睪丸細(xì)胞系連續(xù)傳代培養(yǎng)直到毒力弱化
當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到809Γ90%后或細(xì)胞變圓，-20°C冰凍細(xì)胞培養(yǎng)液Mh以上，反復(fù)凍融3 次，然后無菌收集細(xì)胞培養(yǎng)物。同時以此代病毒接種細(xì)胞系，進(jìn)行病毒傳代，病毒傳代到第 85代，細(xì)胞產(chǎn)生病變變慢(7 10天)。利用此羊口瘡病毒對山羊進(jìn)行口唇劃痕接種，觀察產(chǎn)生病變情況，此病毒的接種組產(chǎn)生了明顯輕于強毒株的病變，并且口唇部病變的持續(xù)時間短于強毒株(參見表1)表1為羊口瘡病毒毒力弱化效果測定，即此細(xì)胞系可以用于羊口瘡病毒弱毒制備。
權(quán)利要求
1.一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于包括以下步驟1)羊口瘡病毒的分離與初步培養(yǎng)；2)羊口瘡病毒在犢牛睪丸細(xì)胞系連續(xù)傳代培養(yǎng)直到毒力弱化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于步驟 1)中，羊口瘡病毒的初步培養(yǎng)采用犢牛睪丸細(xì)胞系培養(yǎng)，犢牛睪丸細(xì)胞系的培養(yǎng)液為M199、 DMEM高糖、RPMI-1640培養(yǎng)基；完全培養(yǎng)基含10%的犢牛血清，犢牛睪丸細(xì)胞系在37°C，5% CO2培養(yǎng)5-7天可以用于接種病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于步驟1)中，羊傳染性膿皰病毒分離于患病山羊的口唇部結(jié)痂。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于步驟2)中，犢牛睪丸細(xì)胞系是通過導(dǎo)入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄基因(hTERT)方法制備的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其特征在于步驟 2)中，羊口瘡病毒連續(xù)傳代到85代以后直到毒力弱化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種山羊傳染性膿皰病毒毒力弱化方法，其利用犢牛睪丸細(xì)胞系，通過羊口瘡病毒的連續(xù)傳代培養(yǎng)，致使羊口瘡病毒毒力致弱，為羊口瘡病毒弱毒疫苗的制備與生產(chǎn)提供了穩(wěn)定可靠的方法，用以獲得大量的穩(wěn)定的疫苗。本發(fā)明包括以下步驟1)羊口瘡病毒的分離與初步培養(yǎng)；2)羊口瘡病毒在犢牛睪丸細(xì)胞系連續(xù)傳代培養(yǎng)直到毒力弱化。步驟1)中，羊口瘡病毒的初步培養(yǎng)采用犢牛睪丸細(xì)胞系培養(yǎng)，犢牛睪丸細(xì)胞系的培養(yǎng)液為M199、DMEM(高糖)、RPMI-1640培養(yǎng)基。步驟1)中，羊傳染性膿皰病毒分離于患病山羊的口唇部結(jié)痂。步驟2)中，犢牛睪丸細(xì)胞系是通過導(dǎo)入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄基因(hTERT)方法制備的。
文檔編號C12N7/08GK102533681SQ20111045283
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者尚川川, 田婷婷, 羅軍, 陳德坤 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)