專利名稱：從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是微生物領(lǐng)域中的菌種分離方法，具體的是一種從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法。
背景技術(shù)：
目前人們可分離培養(yǎng)的微生物只占世界上微生物總量的1%左右，還有99%的微生物目前沒(méi)有分離得到純培養(yǎng)菌株。對(duì)于好氧菌的純培養(yǎng)的分離與純化技術(shù)自1880年Koch 發(fā)明的平板分離法以來(lái)已有130多年的歷史了，稀釋平板涂布法、稀釋混合平板法、平板劃線法、顯微操作器單細(xì)胞挑取法都是常規(guī)的分離和純化微生物的方法。前三種方法不需要特殊昂貴的儀器設(shè)備，極易操作，一般情況下都能順利進(jìn)行，達(dá)到好的效果。對(duì)于厭氧微生物的分離與培養(yǎng)有著特殊性，主要是采取各種方法使他們處于沒(méi)有氧的環(huán)境或氧化還原點(diǎn)位低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于厭氧要求相對(duì)較低的一般厭氧菌的培養(yǎng)主要有堿性焦性沒(méi)食子酸法、庖肉培養(yǎng)基法，這兩種方法是最常用的厭氧培養(yǎng)技術(shù)，雖然兩種方法無(wú)需特殊昂貴的設(shè)備操作簡(jiǎn)單，適用于任何可密封的容器，可迅速建立厭氧環(huán)境，但其缺點(diǎn)是在氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量的有毒氣體，會(huì)抑制某些厭氧菌的生活，其中庖肉培養(yǎng)基法多應(yīng)用于厭氧的芽孢菌的分離與保存中。對(duì)于嚴(yán)格厭氧菌的分離和培養(yǎng)主要有 Hungate滾管技術(shù)、厭氧罐法、厭氧手套操作培養(yǎng)箱，以上方法操作復(fù)雜對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求也比較高并且試驗(yàn)成本很高，但也有其自身的優(yōu)點(diǎn)，就是可以保證環(huán)境的絕對(duì)厭氧，也不會(huì)產(chǎn)生任何有毒的物質(zhì)而抑制微生物的生長(zhǎng)。纖維素分解復(fù)合菌系是一組以高溫期堆肥為原料富集獲得的具有高效穩(wěn)定分解纖維素能力的細(xì)菌復(fù)合群體(一組木質(zhì)纖維素分解菌復(fù)合系的篩選及培養(yǎng)條件對(duì)分解活性的影響，王偉東、崔宗均、?？×帷阏?、劉建斌，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，9 (5) 7 11,2004), 為了研究其微生物組成，篩選出分解能力更強(qiáng)的菌株，需要將復(fù)合菌系進(jìn)行分離，分離出具有分解纖維素功能的單菌。但是在現(xiàn)有研究中，得到具有分解纖維素功能的單菌比較困難， 因?yàn)槔w維素分解復(fù)合菌系中具有分解纖維素功能的菌株通常為厭氧菌，并且在分離的過(guò)程中需要隨時(shí)觀察降解纖維素的能力，以上提到的幾種厭氧菌分離方法均不適宜。分解纖維素的厭氧菌的分離關(guān)鍵點(diǎn)在于1、單菌的分離；2、單菌功能的隨時(shí)檢測(cè)。目前一般采用 Hungate厭氧管技術(shù)，Hungate厭氧管能隨時(shí)觀察纖維素降解的情況，但不便進(jìn)行單菌分離操作，易染菌，因?yàn)镠ungate厭氧管體比較長(zhǎng)，即便產(chǎn)生了單個(gè)菌落，菌落在挑出時(shí)難度也比較大，容易碰倒其他菌落、挑出時(shí)極易與管壁接觸，造成挑出的單菌不純，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)； 而厭氧罐不便隨時(shí)觀察菌種降解纖維素情況。因此，需要發(fā)明一種能夠適合分解纖維素的厭氧菌的分離方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題提供一種從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，解決目前Hungate厭氧管挑出菌落困難，容易染菌，造成菌落不純以及厭氧罐法無(wú)法隨時(shí)觀察菌種降解纖維素情況的問(wèn)題。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，包括以下步驟
A、將纖維素分解復(fù)合菌系用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5 8天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1% 21 ；
B、取出菌液用磷酸緩沖液(以下簡(jiǎn)稱PBS)按照1:10000 1000000的體積比進(jìn)行稀
釋；
C、稀釋后的菌液用平板培養(yǎng)，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5% 1%，在50°C培養(yǎng)5 8天；
D、挑取單個(gè)菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5 8天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1% 21 ；
E、取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5 8 天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5% 1% ；
所述的A、D、E步驟在Himgate厭氧管中進(jìn)行，C步驟在厭氧罐中進(jìn)行。重復(fù)D、E步驟3 4次。所述的濾紙被秸稈取代。采用上述技術(shù)方案的積極效果本發(fā)明根據(jù)纖維素降解實(shí)驗(yàn)的實(shí)際問(wèn)題，將 Hungate厭氧管和厭氧罐結(jié)合使用，用Himgate厭氧管進(jìn)行平行培養(yǎng)，并能夠肉眼觀察秸稈或?yàn)V紙的降解情況，便于功能驗(yàn)證，克服了厭氧罐法觀察不方便的問(wèn)題，同時(shí)采用厭氧罐中的平板分離出單個(gè)菌落，從平板上挑出單個(gè)菌落是比較容易的，避免了菌落之間的相互接觸，防止菌落污染，單菌率更高，方便后續(xù)步驟的進(jìn)行，這樣就克服了 Himgate厭氧管挑菌困難，容易產(chǎn)生污染的問(wèn)題；本方法綜合了兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，適于從纖維素分解復(fù)合菌系中分離出能夠分解纖維素的功能性厭氧菌株，大大提高了分離效率。


圖1是本發(fā)明的流程示意圖2是菌落的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1
圖1是本發(fā)明的流程示意圖，如圖所示，首先在Hungate厭氧管中，將纖維素分解復(fù)合菌系用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)8天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的 1%，取出菌液用PBS按照1:10000的體積比進(jìn)行稀釋。取稀釋后的菌液涂布在平板上，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5%，于厭氧罐中在50°C培養(yǎng)8天。待長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)6天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1%，篩選出能夠降解濾紙的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的 0. 5%，重新產(chǎn)生單菌落，得到單菌，此過(guò)程均在Himgate厭氧管中進(jìn)行。
4
其中，厭氧菌液體培養(yǎng)基的配方是每Ikg中含有KCl 0. 2g，K2HPO3 3. 5g，KH2PO3 1.5g，NaCl 1. 0g，NH4Cl 1. Og, MgCl 20. 5g，酵母粉 2. 0g，蛋白胨 2. 0g，半胱氨酸 0. 5g，微量元素5g，維生素lg，刃天青l(xiāng)g，余量為水。其中，刃天青為指示劑，在缺氧條件下，刃天青不顯色，而一旦進(jìn)入氧氣后，刃天青則顯示紅色。半胱氨酸的作用是使其與液體環(huán)境中的氧進(jìn)行氧化反應(yīng)生成胱氨酸進(jìn)而消耗氧，保證無(wú)氧環(huán)境。厭氧菌固體培養(yǎng)基是在厭氧菌液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上每Ikg中添加20g的瓊脂。微量元素配方為每Ikg 中含有 FeCl2 · 4H20 1. 5g，MnCl2 · 4H20 IOOmg, CoCl2 · 6H20 190mg, NiCl2 · 6H20 24mg, ZnCl2 70mg, H3BO3 6mg, CuCl2 · 2H20 2mg, NaMoO4 · 2H20 36mg，余量為水。維生素配方為每Ikg中含有核黃素0. Ig,硫胺素0. 2g，尼克酰胺0. 2g，吡哆胺 0. 5g，泛酸0. lg，生物素0. 02g，氰鈷胺素0. lg，對(duì)氨基苯甲酸0. lg，葉酸0. 05g，硫辛酸 0. 05g，余量為水。PBS 配方為每 Ikg 中含有 KCl 0. 2g, NaCl 8. 0g, Na2HPO3 1. 44g, KH2PO3 0. 24g, 1% (重量比)L-鹽酸半胱氨酸，pH為7. 4。實(shí)施例2
首先在Hungate厭氧管中，將纖維素分解復(fù)合菌系用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的2%，取出菌液用PBS按照1:100000的體積比進(jìn)行稀釋。取稀釋后的菌液涂布在平板上，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的1%，于厭氧罐中在50°C培養(yǎng)7天。待長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的洲，篩選出能夠降解濾紙的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的1%，重新產(chǎn)生單菌落，此過(guò)程均在 Himgate厭氧管中進(jìn)行。為了使單菌更純，挑取單個(gè)菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的2%，再取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的1%。 挑取單個(gè)菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的2%，再取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的1%。挑取單個(gè)菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的2%，再取能夠降解濾紙的菌液， 用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的1%。挑取單個(gè)菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的洲，再取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)6天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的1%，產(chǎn)生單菌。其中，各種試劑的配方同實(shí)施例1。實(shí)施例3
首先在Hungate厭氧管中，將纖維素分解復(fù)合菌系用添加有秸稈的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)6天，秸稈占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1%，取出菌液用PBS按照1:1000000的體積比進(jìn)行稀釋。取稀釋后的菌液涂布在平板上，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5%，于厭氧罐中在50°C培養(yǎng)5天。待長(zhǎng)出菌落后，挑取單個(gè)菌落用添加有秸稈的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)8天，秸稈占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1%，篩選出能夠降解秸稈的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)8天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5%，重新產(chǎn)生單菌落，此過(guò)程均在Himgate厭氧管中進(jìn)行。為了使單菌更純，挑取單個(gè)菌落用添加有秸稈的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)8天，秸稈占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1%，篩選出能夠降解秸稈的菌液后， 用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)8天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5%。挑取單個(gè)菌落用添加有秸稈的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)8天，秸稈占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1%，篩選出能夠降解秸稈的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)8天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5%。挑取單個(gè)菌落用添加有秸稈的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)8天，秸稈占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1%，篩選出能夠降解秸稈的菌液后，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)8天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5%，產(chǎn)生單菌。其中，各種試劑的配方同實(shí)施例1。試驗(yàn)例1
圖2是菌落的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠圖譜，如圖所示，將實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3中得到的單菌落，采用氯苯法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 1492R (5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，)，常規(guī) PCR 方法擴(kuò)增菌株的16S rDNA基因片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)照相，結(jié)果如圖2所示，M為marker，1、2、3分別代表實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3，所有擴(kuò)增條帶為單一條帶，無(wú)雜帶，分子量為1500bp，可以確定菌落為單菌。試驗(yàn)例2
分別挑取實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3中得到的單菌落，接種到添加有秸稈的厭氧菌液體培養(yǎng)基中，秸稈占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的2%，以沒(méi)有接菌的培養(yǎng)基做對(duì)照，在50°C培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，取出秸稈，烘干后分別稱重，實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3中的秸稈分別減重55. 6%,53. 5%,49. 8%，而對(duì)照中的秸稈減重小于1. 0%。因此，篩選出的單菌表現(xiàn)出了很強(qiáng)的降解纖維素的能力。
權(quán)利要求
1.一種從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，其特征在于該方法包括以下步驟A、將纖維素分解復(fù)合菌系用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5 8天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1% 21 ；B、取出菌液用PBS按照1:10000 1000000的體積比進(jìn)行稀釋；C、稀釋后的菌液用平板培養(yǎng)，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5% 1%，在50°C培養(yǎng)5 8天；D、挑取單個(gè)菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5 8天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1% 21 ；E、取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50°C培養(yǎng)5 8 天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0. 5% 1% ；所述的A、D、E步驟在Himgate厭氧管中進(jìn)行，C步驟在厭氧罐中進(jìn)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，其特征在于還包括重復(fù)D、E步驟3 4次。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，其特征在于所述的濾紙被秸稈取代。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，將Hungate厭氧管和厭氧罐結(jié)合使用，Hungate厭氧管用于肉眼觀察纖維素的降解情況，根據(jù)功能篩選菌株，厭氧罐中的平板分離出單個(gè)菌落。該方法綜合了兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，適于從纖維素分解復(fù)合菌系中分離出能夠分解纖維素的功能性厭氧菌株，大大提高了分離效率。
文檔編號(hào)C12N1/22GK102424812SQ20111045272
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者劉權(quán), 晏磊, 溫雪, 王偉東, 王彥杰, 王艷霞, 高亞梅 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)