專利名稱：重組微生物和使用該重組微生物的脂肪族聚酯的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)將規(guī)定的基因?qū)胨拗魑⑸锒毁x予了期望的功能的重組微生物及使用該重組微生物的脂肪族聚酯的制造方法。
背景技術(shù)：
脂肪族聚酯作為在自然界中容易分解的生物可降解性塑料，以及作為可由糖、植物油等可再生的碳資源合成的“綠色”塑料受到關(guān)注?，F(xiàn)在，作為脂肪族聚酷，實(shí)際利用聚乳酸等具有乳酸骨架的物質(zhì)。作為利用重組微生物來(lái)制造聚乳酸等脂肪族聚酯的技木，已知例如專利文獻(xiàn)I (W0 2006/126796)所公開(kāi)的技木。專利文獻(xiàn)I中公開(kāi)了ー種重組大腸桿菌，其是在成為宿主的大腸桿菌中，導(dǎo)入編碼將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的酶的基因和編碼以乳酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的酶的基因而成的。在專利文獻(xiàn)I所公開(kāi)的技術(shù)中，作為編碼將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的酶的基因，使用源自丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的pet基因。另外，在相同技術(shù)中，作為編碼以乳酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的酶的基因，使用源自假單胞菌(Pseudomonas sp.)61-3株的phaC2基因。但是，在專利文獻(xiàn)I中，不能說(shuō)聚乳酸等脂肪族聚酯的生產(chǎn)率充分，另外用于提高該生產(chǎn)率的各種研究尚不充分。例如，在專利文獻(xiàn)2(W02008/062999)中公開(kāi)以下的嘗試，通過(guò)在源自假單胞菌(Pseudomonassp. )6-19株的phaCl基因中導(dǎo)入特定的變異,提高以乳酰輔酶A作為底物的乳酸均聚物或聚乳酸共聚物的合成能力。如上述那樣的利用重組微生物來(lái)制造聚乳酸等脂肪族聚酯的技木，是在該微生物內(nèi)蓄積脂肪族聚酯，將微生物破碎并回收作為目標(biāo)的脂肪族聚酯的技木?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :W0 2006/126796專利文獻(xiàn)2 W0 2008/062999

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題但是，以往利用重組微生物來(lái)制造聚乳酸等脂肪族聚酯的技木，由于在微生物的內(nèi)部蓄積脂肪族聚酯，因而存在生產(chǎn)率低這樣的問(wèn)題，另外，存在需要用于破碎微生物并回收脂肪族聚酯的復(fù)雜エ序這樣的問(wèn)題。因此，本發(fā)明的目的在于，提供脂肪族聚酯的生產(chǎn)率優(yōu)異的重組微生物的同時(shí)，提供利用該重組微生物的脂肪族聚酯的制造方法。用于解決課題的方法為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明者們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入了丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因和源自規(guī)定的微生物的聚羥基烷酸合酶基因的重組微生物在菌體外生產(chǎn)聚乳酸等脂肪族聚酯，從而完成了本發(fā)明。
SP，本發(fā)明包含以下(I) (11)。(I) ー種脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)以下重組微生物，所述重組微生物是對(duì)宿主微生物導(dǎo)入編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質(zhì)的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因而成的，由培養(yǎng)基回收脂肪族聚酷。(2)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯是以2 5聚物為主的低聚物。(3)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯是具有乳酸骨架的脂肪族聚酷。(4)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯為聚乳 酸。(5)根據(jù)⑴所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為基主培養(yǎng)基。(6)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，將所述重組微生物培養(yǎng)48小時(shí)以上，然后回收所述脂肪族聚酷。(7)根據(jù)(I)所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因，是選自源自泊庫(kù)島食烷菌(Alcanivorax borkumensis)的基因、源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的基因、源自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)的基因、源自菜 根瘤菌(Rhizobiumetli)的基因、源自假單胞菌(Pseudomonas sp.)的基因以及源自死海鹽盒菌(Haloarculamarismortui)的基因的至少一種以上的基因。(8)根據(jù)⑴所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因，是以下的(a) (C)所示的基因(a)編碼包含序列號(hào)6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，(b)編碼包含在序列號(hào)6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中置換、缺失或添加了 I或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列、并且具有上述活性的蛋白質(zhì)的基因，(c)對(duì)具有序列號(hào)5、7、9、11、13、15或17所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格的條件下雜交、并且編碼具有上述活性的蛋白質(zhì)的基因。(9) 一種重組微生物，其是對(duì)宿主微生物導(dǎo)入編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質(zhì)的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因而成的，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因，是選自源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的基因、源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的基因、源自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)的基因、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的基因、源自假單胞菌(Pseudomonas sp.)的基因及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的基因的至少ー種以上的基因。(10)根據(jù)(9)所述的重組微生物，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因，是以下的(a) (C)所示的基因(a)編碼包含序列號(hào)6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，(b)編碼包含在序列號(hào)6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中置換、缺失或添加了 I或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列、并且具有上述活性的蛋白質(zhì)的基因，(c)對(duì)具有序列號(hào)5、7、9、11、13、15或17所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格的條件下雜交、并且編碼具有上述活性的蛋白質(zhì)的基因。(11)根據(jù)(9)所述的重組微生物，其特征在于，所述宿主微生物是大腸桿菌。本說(shuō)明書(shū)包含作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2010-069688號(hào)的說(shuō)明書(shū)和/或附圖記載的內(nèi)容。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠在外部生產(chǎn)脂肪族聚酯的重組微生物。即，本發(fā)明的重組微生物，與現(xiàn)有的重組微生物比較，脂肪族聚酯的生產(chǎn)率優(yōu)異。另外，通過(guò)利用本發(fā)明的重組微生物，可提供生產(chǎn)率優(yōu)異的脂肪族聚酯的制造方法。


圖I是顯示通過(guò)GC-MS測(cè)定各重組大腸桿菌的乳酸聚合物的生產(chǎn)量的結(jié)果的特性圖。圖2是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的的PHA合酶基因(編號(hào)8)、源自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)的PHA合酶基因(編號(hào)I)、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PHA合酶基因(編號(hào)3)、源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的PHA合酶基因(編號(hào)7)及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的PHA合酶基因(編號(hào)10)的任一基因的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸2聚物的結(jié)果的特性圖。圖3是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的PHA合酶基因(編號(hào)8)、源自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)的PHA合酶基因(編號(hào)I)、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PHA合酶基因(編號(hào)3)、源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的PHA合酶基因(編號(hào)7)及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的PHA合酶基因(編號(hào)10)的任一基因的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸3聚物的結(jié)果的特性圖。圖4是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的PHA合酶基因(編號(hào)8)、源自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)的PHA合酶基因(編號(hào)I)、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PHA合酶基因(編號(hào)3)、源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的PHA合酶基因(編號(hào)7)及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的PHA合酶基因(編號(hào)10)的任一基因的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸4聚物的結(jié)果的特性圖。圖5是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的PHA合酶基因(編號(hào)8)、源自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)的PHA合酶基因(編號(hào)I)、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的PHA合酶基因(編號(hào)3)、源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的PHA合酶基因(編號(hào)7)及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的PHA合酶基因(編號(hào)10)的任一基因的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸5聚物的結(jié)果的特性圖。圖6是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號(hào)12)的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸2聚物的結(jié)果的特性圖。圖7是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號(hào)12)的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸3聚物的結(jié)果的特性圖。圖8是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號(hào)12)的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸4聚物的結(jié)果的特性圖。圖9是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號(hào)12)的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸5聚物的結(jié)果的特性圖。圖10是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號(hào)12)的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸6聚物的結(jié)果的特性圖。圖11是顯示對(duì)于導(dǎo)入了源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號(hào)12)的重組大腸桿菌，測(cè)定培養(yǎng)基中的乳酸7聚物的結(jié)果的特性圖。圖12是顯示使用導(dǎo)入了源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號(hào)12)的重組大腸桿菌，研究培養(yǎng)基的種類(lèi)不同造成的乳酸低聚物的生產(chǎn)率的不同的結(jié)果的特性圖。 圖13是顯示使用導(dǎo)入了源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因(編號(hào)12)的重組大腸桿菌，研究培養(yǎng)時(shí)間與乳酸低聚物的生產(chǎn)率的關(guān)系的結(jié)果的特性圖。
具體實(shí)施例方式以下，詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的重組微生物和使用該重組微生物的脂肪族聚酯的制造方法。本發(fā)明的重組微生物，是將丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(pet基因)和規(guī)定的聚羥基烷酸合酶基因?qū)胨拗魑⑸锒傻模⒃谒拗魑⑸锏耐獠可a(chǎn)脂肪族聚酷。另外，在本說(shuō)明書(shū)中所謂“脂肪族聚酷”，不僅表示分子量為數(shù)千 數(shù)萬(wàn)這樣的高分子化合物，還包含単體單元為2 5這樣的(即，ニ聚物 五聚物)低聚物。丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因在本發(fā)明中，作為丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(以下，稱為pet基因)，沒(méi)有特別限定，只要是編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質(zhì)的基因則可使用任何基因。SP，pet基因可以使用編碼具有丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的任何基因。所謂丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性，是指催化將輔酶A轉(zhuǎn)移至丙酸的反應(yīng)的活性。即，將催化由適當(dāng)?shù)妮o酶A底物將輔酶A轉(zhuǎn)移至丙酸的反應(yīng)的活性，稱為丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性。該丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶，不僅對(duì)丙酸，對(duì)于乳酸也可由輔酶A底物轉(zhuǎn)移輔酶A。表I顯示到目前為止所報(bào)告的pet基因的來(lái)源(微生物名)的代表例、和公開(kāi)了編碼它們的堿基序列信息的文獻(xiàn)信息。[表 I]
微生物名文獻(xiàn)信息
丙酸梭菌Eur. J. Biochem., 2002, Vol. 269，pp.372-380埃氏巨型球菌 United States Patent 7186541
金黃色葡萄成菌 Eur. J. Biochem., 2002，Vol. 269, pp.372-380 大腸桿菌Eur. J. Biochem., 2002, Vol. 269, pp.372-380在本發(fā)明中，除了上述表I以外，可利用目前為止報(bào)告的pet基因的任ー種。另外，在具有丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的范圍內(nèi)，即使是包含在已知的PCT的氨基酸序列中缺失、置換或添加了 I個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的氨基酸序列的蛋白質(zhì)也可利用。另外，在關(guān)于Pct的氨基酸序列使用的用語(yǔ)所謂“數(shù)個(gè)”是指I 50個(gè)，優(yōu)選I 25個(gè)，更優(yōu)選10個(gè)以下。丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的催化劑活性可按照例如A. E. Hofmeister等(Eur. J. Biochem.,第206卷，第547-552頁(yè))記載的方法來(lái)測(cè)定。作為一例，作為pet基因，可舉出源自埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)的基因和源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因。序列號(hào)I顯示源自埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)的pet基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號(hào)2顯示由該pet基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。另外，序列號(hào)3顯示源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的pet基因中的編 碼區(qū)的堿基序列,序列號(hào)4顯示由該pet基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。包含這些序列號(hào)2或4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，具有丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性，尤其具有以乳酸作為底物來(lái)合成乳酰輔酶A的活性。另外，在本發(fā)明中，作為pet基因，并不限定于具有編碼序列號(hào)2或4所示的氨基酸序列的堿基序列的基因，還可以是包含在該氨基酸序列中缺失、置換或添加了 I或多個(gè)氨基酸序列的氨基酸序列、并且具有將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質(zhì)。在這里，作為多個(gè)氨基酸，表示例如為I 20個(gè)、優(yōu)選I 10個(gè)、更優(yōu)選I 7個(gè)、進(jìn)ー步優(yōu)選I個(gè) 5個(gè)、特別優(yōu)選I個(gè) 3個(gè)。進(jìn)而，在本發(fā)明中，作為pet基因，還可以是編碼下述蛋白質(zhì)的基因所述蛋白質(zhì)具有相對(duì)于序列號(hào)2或4所示的氨基酸序列具有例如70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的序列類(lèi)似性的氨基酸序列，并且具有將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的活性。在這里，序列類(lèi)似性的值，是指使用安裝了 blast算法的計(jì)算機(jī)程序及存儲(chǔ)了基因序列信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)默認(rèn)的設(shè)定所求得的值。進(jìn)而，在本發(fā)明中，作為pet基因，還可以是包含對(duì)具有序列號(hào)I或3所示堿基序列的基因的至少一部分在嚴(yán)格的條件下雜交的多核苷酸，并且編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質(zhì)的基因。在這里，所謂嚴(yán)格的條件，是指形成所謂特異性雜種，而不形成非特異性雜種的條件?？膳e出例如，在45°C、6XSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)下雜交，然后在50 65°C、0. 2 1XSSC、0. 1%SDS下洗滌，或者作為這樣的條件，可舉出在65 70°C、1XSSC下雜交，然后在65 70°C、0. 3XSSC下洗滌。雜交可通過(guò)J. Sambrooket al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring HarborLaboratory(1989)所記載的方法等現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行。另外，氨基酸的缺失、置換或添加，是通過(guò)以本技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法來(lái)改變編碼上述轉(zhuǎn)錄因子的堿基序列來(lái)進(jìn)行。為了在堿基序列中導(dǎo)入突變，可通過(guò)Kunkel法或Gappedduplex (缺ロ雙鏈體)法等的公知方法或依據(jù)這些公知方法的方法來(lái)進(jìn)行，例如，使用利用了定點(diǎn)誘變法的突變導(dǎo)入用試劑盒(例如Mutant-K或Mutant-G(都是商品名，TAKARABio社制))等，或者使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列試劑盒(商品名，TAKARABio社制)導(dǎo)入突變。另外，作為突變導(dǎo)入方法，可以是使用以EMS(甲磺酸こ酷)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍、其他的致癌性化合物為代表的化學(xué)誘變劑的方法，也可以是利用以X射線、α射線、β射線、Y射線、離子束所代表的放射線處理和/或紫外線處理的方法。聚羥基烷酸合酶基因在本發(fā)明中，作為聚羥基烷酸合酶基因(也稱為PHA合酶基因)，使用選自源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的基因、源自海王生絲單胞菌(Hyphomonasneptunium)的基因、源自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobactersphaeroides)的基因、源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的基因、源自假單胞菌(Pseudomonas sp.)的基因及源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的基因的至少ー種以上的基因。特別是作為PHA合酶基因，優(yōu)選使用源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的基因和/或源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的基因。另外，所謂PHA合酶基因，是編碼具有以輕酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因。在這里，作為源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的基因，優(yōu)選使用源自在ATCC以保藏號(hào)700651保藏的SK2株的PHA合酶基因。另外，作為源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)的基因,優(yōu)選使用源自在NBRC以保藏號(hào)14232保藏的株的PHA合酶基因。作為源自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)的基因，優(yōu)選使用源自在ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，American Type Culture Collection)以保藏號(hào) BAA-808D保藏的株的PHA合酶基因。作為源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)的基因，優(yōu)選使用源自在NBRC(日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中心，NITE Biological ResourceCenter)以保藏號(hào)15573保藏的CFN株的PHA合酶基因。作為源自假單胞菌(Pseudomonassp.)的基因，優(yōu)選使用源自在JCM(日本微生物菌種保藏中心，Japan CollectionofMicroorganisms)以保藏號(hào)10015保藏的61_3株的PHA合酶基因。作為源自死海鹽盒菌(Haloarcula marismortui)的基因，優(yōu)選使用源自在JCM以保藏號(hào)8966保藏的株的PHA合酶基因。具體地說(shuō)，序列號(hào)5顯示源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis) (ATCC700651)的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號(hào)6顯示由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。序列號(hào)7顯示源自海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium) (NBRC 14232)的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號(hào)8顯示由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。另外，作為源自類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides) (BAA-808D)的基因，可舉出由保藏號(hào)YP354337所特定的PHA合酶基因及由保藏號(hào)ΑΒΑ79557所特定的PHA合酶基因。序列號(hào)9顯示由保藏號(hào)ΥΡ354337所特定的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號(hào)10顯示由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。序列號(hào)11顯示由保藏號(hào)ΑΒΑ79557所特定的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號(hào)12顯示由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。序列號(hào)13顯示源自菜豆根瘤菌(Rhizobium etli) CFN株的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號(hào)14顯示由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。序列號(hào)15顯示源自假單胞菌(Pseudomonas sp. )61_3株的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列,序列號(hào)16顯示由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。序列號(hào)17顯示源自死海鹽盒菌(Haloarculamarismortui) (JCM8966)的PHA合酶基因中的編碼區(qū)的堿基序列，序列號(hào)18顯示由該基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。另外，在本發(fā)明中，作為PHA合酶基因，不限定于具有編碼由上述具體的序列號(hào)所特定的氨基酸序列的堿基序列的基因，也可以是編碼下述蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)包含在該氨基酸序列中缺失、置換或添加了 I或多個(gè)氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有以乳酰輔酶A作為底物合成聚乳酸的活性。在這里，作為多個(gè)氨基酸，是指例如I 20個(gè)、優(yōu)選I 10個(gè)、更優(yōu)選I 7個(gè)、進(jìn)ー步優(yōu)選I個(gè) 5個(gè)、特別優(yōu)選I個(gè) 3個(gè)。進(jìn)而，在本發(fā)明中，作為PHA合酶基因，還可以是編碼下述蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)具有相對(duì)于由上述具體的序列號(hào)所特定的氨基酸序列例如具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上的序列類(lèi)似性的氨基酸序列，并且具有以乳酰輔酶A作為底物合成聚乳酸的活性。在這里，序列類(lèi)似性的值是指使用安裝了 blast算法的計(jì)算機(jī)程序及存儲(chǔ)了基因序列信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)默認(rèn)的設(shè)定所求得的值。進(jìn)而，在本發(fā)明中，作為PHA合酶基因，還可以是包含對(duì)具有由上述具體的序列號(hào)所特定的堿基序列的基因的至少一部分在嚴(yán)格的條件下雜交的多核苷酸，并且編碼具有以乳酰輔酶A作為底物合成聚乳酸的活性的蛋白質(zhì)的基因。另外，所謂嚴(yán)格的條件，與“丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因”欄中所示的條件含義相同。
另外，對(duì)于氨基酸的缺失、置換或添加，可應(yīng)用“丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因”欄中所示的方法。特別是本發(fā)明的重組微生物是導(dǎo)入了上述的PHA合酶基因的重組微生物，因此可在微生物的體外生產(chǎn)脂肪族聚酯的低聚物、特別是乳酸低聚物。在這里，可制造根據(jù)使用的PHA合酶基因的種類(lèi)不同而不同的聚合度的低聚物。通過(guò)導(dǎo)入了源自泊庫(kù)島食燒菌(Alcanivorax borkumensis)的PHA合酶基因的重組微生物，可制造4聚物及5聚物的脂肪族聚酯的低聚物(例如乳酸低聚物)。另外，通過(guò)導(dǎo)入了源自海王生絲單胞菌(Hyphomonasneptunium)的PHA合酶基因的重組微生物,可制造4聚物的脂肪族聚酯的低聚物(例如乳酸低聚物)。宿主微生物在本發(fā)明中，作為宿主微生物，可舉出例如假單胞菌(Pseudomonassp. )61-3株等假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌、真氧產(chǎn)堿桿菌(Ralstoniaeutropha)等青枯雷爾氏屬(Ralstonia)細(xì)菌、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)等芽胞桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌、大腸桿菌(Escherichia coli)等埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細(xì)菌、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等酵母屬(Saccharomyces)酵母、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)等假絲酵母屬(Candida)酵母等。作為宿主微生物，特別優(yōu)選使用大腸桿菌。用于在宿主細(xì)胞中導(dǎo)入上述的基因的載體，只要在宿主中可自主復(fù)制即可，優(yōu)選質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA的形式。作為用于導(dǎo)入大腸桿菌的載體的例子，可分別舉出PBR322、pUC18、pBLuescriptll等質(zhì)粒DNA、EMBL3、M13、λ gtll等卩遼菌體DNA等。另外作為用于導(dǎo)入酵母的載體的例子，可舉出YEpl3、YCp50等?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因重組技術(shù)將上述基因的兩方或一方插入載體。另外在重組時(shí)，優(yōu)選在能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的下游連接上述基因。作為啟動(dòng)子，只要是能在宿主中調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子則可使用任ー種。例如，在使用大腸桿菌作為宿主的情況下，可使用trp啟動(dòng)子、Lac啟動(dòng)子、PL啟動(dòng)子、PR啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子等，使用酵母作為宿主的情況下，可使用gaLl啟動(dòng)子、gaLlO啟動(dòng)子等。另外，載體中可以根據(jù)需要連接可以在將要導(dǎo)入基因的微生物中利用的終止子序列、增強(qiáng)子序列、剪接信號(hào)序列、多聚A添加信號(hào)序列、核糖體結(jié)合序列(SD序列)、選擇標(biāo)志物基因等。作為選擇標(biāo)志物基因的例子，除了氨芐青霉素耐性基因、四環(huán)素耐性基因、新霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、氯霉素耐性基因等耐藥性基因以外，可舉出與氨基酸或核酸等營(yíng)養(yǎng)素的細(xì)胞內(nèi)生物合成相關(guān)的基因，或者編碼螢光素酶等的熒光蛋白質(zhì)的基因等。上述載體可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法導(dǎo)入微生物。作為將載體導(dǎo)入微生物的方法，可舉出例如磷酸鈣法、電穿孔法、原生質(zhì)體法、醋酸鋰法、接合傳達(dá)法、使用鈣離子的方法等。脂肪族聚酯的制造將上述的pet基因及PHA合酶基因?qū)胨拗魑⑸锼玫降闹亟M微生物，用含有碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成蓄積脂肪族聚酯的低聚物，然后，回收脂肪族聚酯的低聚物，由此可制造作為目標(biāo)的脂肪族聚酯的低聚物。該重組微生物通過(guò)糖代謝途徑由糖合成乳酸，通過(guò)由pet基因編碼的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A。另外，該重組微生物通過(guò)由PHA合酶基因編碼的PHA合酶以乳酰輔酶A作為底物來(lái)合成作為構(gòu)成単元含有乳酸的脂肪族聚酯的低聚物。作為該低聚物，可以是構(gòu)成單元僅包含乳酸的聚乳酸(均 聚物)，也可以是作為構(gòu)成単元包含乳酸和除乳酸以外的羥基烷酸的乳酸系共聚物。另外，作為在培養(yǎng)基中生產(chǎn)的低聚物，主要為ニ聚物 五聚物。在這里所謂“主要”，是指培養(yǎng)基所含的脂肪族聚酯成分中的50%以上、優(yōu)選70%以上、更優(yōu)選90%以上為上述低聚物。合成聚乳酸(均聚物)時(shí)，在培養(yǎng)基中不添加除乳酸以外的羥基烷酸，或者使宿主微生物中的乳酸以外的羥基烷酸生物合成途徑缺失。另ー方面，在合成作為構(gòu)成單元包含乳酸和除乳酸以外的羥基烷酸的乳酸系共聚物時(shí)，在培養(yǎng)基中可添加除乳酸以外的羥基烷酸即可，另外，也可以對(duì)宿主微生物賦予除乳酸以外的羥基烷酸生物合成途徑。特別是本發(fā)明的重組微生物是菌體內(nèi)不蓄積脂肪族聚酷，而在菌體外部制造脂肪族聚酯的低聚物的重組微生物。因?yàn)楸景l(fā)明的重組微生物在菌體外蓄積脂肪族聚酯，所以不需要為了提高脂肪族聚酯的生產(chǎn)率而提高菌體的增殖效率。因此，本發(fā)明的重組微生物即使使用含有可生長(zhǎng)的程度的營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，也可以高生產(chǎn)脂肪族聚酯的低聚物。因此，通過(guò)利用本發(fā)明的重組微生物，可以低成本實(shí)現(xiàn)脂肪族聚酯的低聚物的生產(chǎn)率。與此相對(duì)，在菌體內(nèi)蓄積脂肪族聚酯的重組微生物的情況下，為了提高脂肪族聚酷的生產(chǎn)率，采取通過(guò)提高重組微生物的增殖效率來(lái)提高菌體量的方針。這種情況下，為了提高重組微生物的增殖效率，必須使用營(yíng)養(yǎng)價(jià)高的培養(yǎng)基，因而成本非常高。另外，在菌體內(nèi)蓄積脂肪族聚酯的重組微生物的情況下，必須在菌體內(nèi)蓄積脂肪族聚酯的階段的比較早的時(shí)期終止培養(yǎng)。與此相對(duì)，本發(fā)明的重組微生物由于在菌體外制造脂肪族聚酯的低聚物，因此可長(zhǎng)時(shí)間繼續(xù)培養(yǎng)，并可生產(chǎn)脂肪族聚酯的低聚物。特別是本發(fā)明的重組微生物優(yōu)選ー邊繼續(xù)培養(yǎng)，一邊在取出一部分培養(yǎng)基的同時(shí)補(bǔ)加補(bǔ)加培養(yǎng)基或培養(yǎng)基成分的一部分的補(bǔ)料分
批培養(yǎng)。另ー方面，培養(yǎng)本發(fā)明的重組微生物而生產(chǎn)脂肪族聚酯的低聚物時(shí)，雖沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選使用含有通常的碳源等的低成本的培養(yǎng)基，例如基主培養(yǎng)基。作為碳源，可舉出例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等碳水化合物。另外，還可以將碳數(shù)4以上的油脂相關(guān)物質(zhì)作為碳源。作為碳數(shù)4以上的油脂相關(guān)物質(zhì)，可舉出玉米油、大豆油、紅花油、向日葵油、橄欖油、椰子油、棕櫚油、菜籽油、魚(yú)油、鯨油、豬油或牛油等天然油脂、丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸或肉豆蘧酸等脂肪酸或這些脂肪酸的酷、辛醇、月桂醇、油醇或鯨蠟醇等或這些醇的酯等。作為氮源，可舉出例如氨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等銨鹽，以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿等。作為無(wú)機(jī)物，可舉出例如磷酸ニ氫鉀、磷酸氫ニ鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化納等。關(guān)于培養(yǎng)，通常在振蕩培養(yǎng)等的好氧條件下，在25 37°C的范圍，優(yōu)選在上述pet基因及PHA合酶基因表達(dá)之后進(jìn)行48小時(shí)以上。培養(yǎng)中可在培養(yǎng)基中添加卡那霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素等抗生素。在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下導(dǎo)入上述pet基因及PHA合酶基因任一方或兩方的情況下，優(yōu)選在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)由 該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的因子，然后進(jìn)行72小時(shí)以上。特別優(yōu)選培養(yǎng)導(dǎo)入了上述的pet基因及PHA合酶基因的重組大腸桿菌，制造乳酸低聚物。通過(guò)該方法，即使不在培養(yǎng)基添加乳酸等構(gòu)成目標(biāo)聚合物的単體成分，也可制造乳酸低聚物，在制造成本的方面有利。另外，乳酸低聚物等脂肪族聚酯的低聚物的回收可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。例如，可由培養(yǎng)液通過(guò)離心分離進(jìn)行集菌來(lái)除去菌體成分，并由除去菌體后的培養(yǎng)基按照規(guī)定方法回收乳酸低聚物等脂肪族聚酯的低聚物。回收的乳酸低聚物等脂肪族聚酯的低聚物的確認(rèn)，可通過(guò)通常的方法、例如氣相色譜法和/或核磁共振法等進(jìn)行。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限定于以下的實(shí)施例。[實(shí)施例I]各種的PHA合酶基因的評(píng)價(jià)在本實(shí)施例中，對(duì)于各種的PHA合酶基因，評(píng)價(jià)與源自埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)的pet基因同時(shí)表達(dá)時(shí)的乳酸低聚物的生產(chǎn)率。首先制作用于導(dǎo)入源自埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)的pet基因的載體PTV118N-M.E PCT0通過(guò)常法取得埃氏巨型球菌(M. elsdenii) (ATCC17753)的基因組，通過(guò)PCR法取得pet基因。作為用于擴(kuò)增含有源自埃氏巨型球菌(Melsdenii)的pet基因的DNA 片段的引物，使用 MePCTN :5’ -atgagaaaagtagaaatcattac-3’ (序列號(hào) 19)及 MePCTC 5’ -ttattttttcagtcccatgggaccgtcctg-3’(序列號(hào)20)。另外，引物的堿基序列參考專利W002/42418所記載的序列。由基因組的pet基因的擴(kuò)增在以下的條件下進(jìn)行。PCR(酶KOD plus) (94°C I分鐘)X 1，(940C O. 5分鐘、50°C O. 5分鐘、72°C 2分鐘)X 30、(94°C 2分鐘)。將擴(kuò)增片段導(dǎo)入TOPO BluntII載體，進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在所報(bào)告的序列和堿基序列中有97. 8%的同源，在氨基酸序列中僅I處不同。通過(guò)將由上述的PCR得到的源自埃氏巨型球菌(M. elsdenii)的pet基因插入PTV118N載體(タカラバイォ社制)的EcoRl-PstI之間來(lái)制作表達(dá)質(zhì)粒pTV118N-M. E PCT0接著，將本例研究的PHA合酶基因一覽不于表2。在表2中，對(duì)于編號(hào)I的類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)及編號(hào) 4 的深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum),發(fā)現(xiàn)了以不同的注冊(cè)號(hào)登記的多個(gè)基因，因而對(duì)于這樣的多個(gè)基因進(jìn)行研究。表 權(quán)利要求
1.一種脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)以下重組微生物，所述重組微生物是對(duì)宿主微生物導(dǎo)入編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質(zhì)的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因而成的， 由培養(yǎng)基回收脂肪族聚酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯是以2 5聚物為主的低聚物。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯是具有乳酸骨架的脂肪族聚酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述脂肪族聚酯為聚乳酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，將所述重組微生物培養(yǎng)48小時(shí)以上，然后回收所述脂肪族聚酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因，是選自源自泊庫(kù)島食烷菌的基因、源自海王生絲單胞菌的基因、源自類(lèi)球紅細(xì)菌的基因、源自菜豆根瘤菌的基因、源自假單胞菌的基因以及源自死海鹽盒菌的基因的至少一種以上的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪族聚酯的制造方法，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因，是以下的(a) (C)所示的基因 (a)編碼包含序列號(hào)6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因， (b)編碼包含在序列號(hào)6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中置換、缺失或添加了 I或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列、并且具有上述活性的蛋白質(zhì)的基因， (c)對(duì)具有序列號(hào)5、7、9、11、13、15或17所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格的條件下雜交、并且編碼具有上述活性的蛋白質(zhì)的基因。
9.一種重組微生物，其是對(duì)宿主微生物導(dǎo)入編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質(zhì)的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因而成的，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因，是選自源自泊庫(kù)島食烷菌的基因、源自海王生絲單胞菌的基因、源自類(lèi)球紅細(xì)菌的基因、源自菜豆根瘤菌的基因、源自假單胞菌的基因及源自死海鹽盒菌的基因的至少一種以上的基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組微生物，其特征在于，所述編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因，是以下的(a) (C)所示的基因 (a)編碼包含序列號(hào)6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因， (b)編碼包含在序列號(hào)6、8、10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中置換、缺失或添加了 I或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列、并且具有上述活性的蛋白質(zhì)的基因， (c)對(duì)具有序列號(hào)5、7、9、11、13、15或17所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)格的條件下雜交、并且編碼具有上述活性的蛋白質(zhì)的基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組微生物，其特征在于，所述宿主微生物是大腸桿菌。
全文摘要
在使用重組微生物的脂肪族聚酯的制造中，提高脂肪族聚酯生產(chǎn)率。培養(yǎng)以下重組微生物，所述重組微生物是對(duì)宿主微生物導(dǎo)入編碼具有將乳酸轉(zhuǎn)換為乳酰輔酶A的活性的蛋白質(zhì)的基因、和編碼具有以羥酰輔酶A作為底物來(lái)合成聚羥基烷酸的活性的蛋白質(zhì)的基因而成的；由培養(yǎng)基回收脂肪族聚酯。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102844439SQ20118001580
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者村松正善, 神戶浩美, 伊藤正和, 島村隆, 幸田勝典 申請(qǐng)人:豐田自動(dòng)車(chē)株式會(huì)社