專利名稱：：一種低溫脂肪酶菌株、低溫脂肪酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種低溫脂肪酶、該酶的產(chǎn)生菌及其制造方法。具體就是，本發(fā)明涉及一種由耐低溫微生物菌種產(chǎn)生的、在較低的溫度下具有較高活性的脂肪酶，及其利用該微生物菌種生產(chǎn)低溫脂肪酶的生產(chǎn)方法。技術(shù)背景脂肪酶(丄z)^e)是一種在自然界中普遍存在的酶類。按其來(lái)源不同，可分為動(dòng)物脂肪酶、植物脂肪酶及微生物脂肪酶三大類。其中，微生物脂肪酶因其生產(chǎn)容易、易于擴(kuò)大等特點(diǎn)及其對(duì)脂肪類物質(zhì)特異性的分解特性，使其在洗滌、食品加工、皮革加工、助消化劑、有機(jī)合成化工產(chǎn)品、香料、藥物制備、油脂加工等方面得到廣泛應(yīng)用，成為世界主要工業(yè)用酶制劑之一。八十年代以后，脂肪酶在開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面的研究加速，顯示出良好的應(yīng)用前景?？僧a(chǎn)生脂肪酶的微生物菌種主要有以細(xì)菌和霉甜為主，有些酵母菌也可產(chǎn)脂肪酶。因此菌種特性的差異性，使其產(chǎn)生的脂肪酶在酶學(xué)特性上存在差異性，以下為目前脂肪酶研究的主要研究菌種及其產(chǎn)生的脂肪酶的特性。假單胞菌屬菌H-1(尸化Womo"wH-l),其產(chǎn)生的脂肪酶最適反應(yīng)溫度為47。C以上(Fmfen'cAfon'erave",章克昌從非洲土壤中分離新的產(chǎn)生脂肪酶的細(xì)菌無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)才艮2000，19(1):41-44);鏈霉菌Z94-2，其產(chǎn)生的脂肪酶最適酶解條件為37°C、pH9.4~10.2(周曉云，黃建寧，歐志敏，王慧中，王榮偉鏈霉菌Z94-2堿性脂肪酶產(chǎn)生條件及酶學(xué)性質(zhì)微生物學(xué)報(bào)2000，40(1):75-79);擴(kuò)展青霉，其產(chǎn)生的脂肪酶最適酶解條件為36°C、pH79(鄭毅，龔福生，施巧琴，吳松剛擴(kuò)展青霉脂肪酶催化性質(zhì)的研究藥物生物技術(shù)2000，7(2):98誦101);毛霉(Mwcww.)M2菌林，其產(chǎn)生的脂肪酶最適酶解條件為50°C、pH8.0(肖春玲，宋欣毛霉脂肪酶的研究生物學(xué)通4艮1998，25(5):274-277);青霉菌林4041,其產(chǎn)生的脂肪酶最適酶解條件為25°C、pH10.0(鄒顯章，李江華洗滌劑用酶的研究與開(kāi)發(fā)一新型堿性脂肪酶無(wú)錫輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)1994，13(1):201國(guó)207);根霉屬(//^op"力脂肪酶產(chǎn)生菌NQ23，其產(chǎn)生的脂肪酶最適酶解條件為50°C、pH7.0(喬紅群，徐虹，付閃雷，歐陽(yáng)平凱脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶性質(zhì)南京化工大學(xué)學(xué)報(bào)1998,1:15-19);華根霉(7/2izo/w;sc/z/"e"^CCTCCM201021)其產(chǎn)生的脂肪酶最適酶解溫度為40。C、pH7.5(徐巖一種脂肪酶產(chǎn)生菌及其篩選方法和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用公開(kāi)號(hào)CN1443841A);無(wú)花果絲孢酵母(7Hc/zo^7力gw/M)其產(chǎn)生的酶最適酶解條件為40°C、pH8.0(張苓花，王運(yùn)吉脂肪酶產(chǎn)生菌分離'、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究生物技術(shù)1996,6(1):12-16);異常畢赤酵母(P/c/2/a朋oma/a)1013，其產(chǎn)生的酶最適酶解條件為48°C、pH4.8(章文賢，蔣詠梅，施巧琴，吳松剛異常畢赤酵母產(chǎn)生耐溫酸性脂肪酶的研究福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)2000,9:72-82);南極，支絲酵母菌(CL4wtorc"'ca)DMS-3855,其產(chǎn)生的酶最適酶解條件為70°C、pH8.5(劉均洪，邱龍輝，徐軍偉，張媛媛南極假絲酵母脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)化學(xué)工業(yè)與工程技術(shù)2005,2:1-4);假單孢菌Bll-l，其產(chǎn)生的脂肪酶最適酶解條件為45°C、pH8.0五"v/ra脂ewto/Mfcra6/o/ogyFe6.79站，必6畫(huà)邦7);以為受體構(gòu)建的基因工程菌林，所產(chǎn)生的脂肪酶最適酶解溫度為6070。C、pH9.0,具有較高的熱穩(wěn)定性(向華，張健，周堅(jiān)，田宇清，譚華榮，熱穩(wěn)定脂肪酶及其編碼基因與應(yīng)用和專用工程菌公開(kāi)號(hào)CN1552866A);'假單胞菌屬(尸sc"必wowos)菌產(chǎn)生的脂肪酶最佳作用溫度為55~65°C、pH10-12(石田禮子，鈴木雅博，小綠隆司，崎元和范，新領(lǐng)的脂肪酶、產(chǎn)生該脂肪酶的微生物、該脂肪酶的制造方法及用途C12N9/20);j氐溫孩b求菌(^fcracocc^awtorc"cws)T2所產(chǎn)生的j氐溫脂肪酶最適酶解溫度為35。C、pH8.0(劉洪杣，馬延和，薛燕芬，周培謹(jǐn)一種低溫脂肪酶及其編碼基因與生產(chǎn)方法公開(kāi)號(hào)CN1611600A);適冷性海洋酵母(K3Traw/a/i^o/"/ca)5o;w&ea-9145，所產(chǎn)生的l氐溫脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為35。C,在0。C時(shí)保存20%的相對(duì)酶活力，最適pH8.5、pH4.0~9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性差(邵鐵娟，孫謐，鄭家聲，王躍軍，邱秀寶，Bo/^&ea"/"海洋低溫堿性脂肪酶研究微生物學(xué)報(bào)2004,6:789-792);南大洋深海嗜冷菌22521021,其產(chǎn)生的酶最適酶解條件為35°C、pH7.5;深海適冷假單胞菌(尸"wdowo"ossp.)KB700A產(chǎn)的低溫脂肪酶的最適酶活性溫度也為35°C;方金瑞從深海泥樣分離到的菌林EQ223產(chǎn)的低溫脂肪酶的最適作用溫度為10。C;適冷菌(尸"^owo"wsp.)B1121,產(chǎn)生的冷適應(yīng)脂肪酶最適作用溫度為45。C(林學(xué)政，楊秀霞，邊際，黃曉航，南大洋深海嗜冷菌2-5-10-1及其低溫脂肪酶的研究海洋學(xué)報(bào)2005,5:154-158);氣單孢菌屬菌(^erawo"msp.)LPB4，所產(chǎn)生的低溫酶最適酶解溫度為10。C(//""-AT/丄eeAf/"扁Jwwgy4/m_Kw<a^5b"gMw^遷3，);假單孢菌i^wdomo"os>ag/，所產(chǎn)生的低溫脂肪酶最適酶解溫度為29°C、pH8,0(C/aw&aj/《w減ZwcaZ)eGVo/a，G7aw/wca5^wtoms叫Zi//a，2)耐冷假單胞菌屬(/^ewifowo"a^BTsl0022，該菌脂肪酶的最適酶解溫度為24。C、10。C可保持35。/。的相對(duì)酶活力；pH為8.0,在pH79范圍內(nèi)具有較高的酶學(xué)特性(俞勇，李會(huì)榮，陳波，曾胤新，任大民，低溫脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其部分酶學(xué)性質(zhì)高技術(shù)通訊2003,10:89-93);嗜冷桿菌屬(尸^c/zra^"ersp.)7195，該菌林所分泌的脂肪酶最適作用溫度為3(TC，最適pH值為9.0,對(duì)熱敏感，60。C熱處理10min,剩余酶活為30%,是典型的低溫酶。(張金偉，曾潤(rùn)穎，南，及產(chǎn)低溫脂肪酶菌抹尸矽c/ra6acfersp.7195的選育、發(fā)酵條件及酶學(xué)性質(zhì)研究生物不茲學(xué)2006,6(1):6-10);發(fā)光桿菌屬(尸/oto6a"en'wm)D2菌林所產(chǎn)脂肪酶的最適作用溫度在35""C左右，證明其脂肪酶為低溫酶，最適pH值為8(林容霞，馬延和，譚天偉，低溫脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及鑒定北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)2006,33(1):31-35)?，F(xiàn)報(bào)道的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌主要以細(xì)菌為主，兼以少量真菌，而這些菌中有些菌株所產(chǎn)生的低溫脂肪酶由于其最適酶解罕度過(guò)低(<20°C)存在中溫條件下不穩(wěn)定、使用與保藏中同樣需消耗能量而使其應(yīng)用受到限制；有些菌可產(chǎn)生在室溫下具有較好酶解特性的低溫脂肪酶，但其最適酶解條件主要是在堿性范圍內(nèi)(pH28.0),在酸性條件下其不能發(fā)揮較好的酶解特性，而部分菌^^朱所產(chǎn)生的脂肪酶最適酶解溫度接近于中溫脂肪酶。低溫脂肪酶因其獨(dú)特的酶解特性及用途而受到重視。目前，研究的低溫脂肪酶主要由耐冷性微生物菌種產(chǎn)生，可供研究的菌種較少。而每一種微生物菌產(chǎn)生的酶的特性存在差異，如酶的作用pH范圍與最適酶解pH、酶的作用溫度范圍與最適作用溫度，以及酶的熱穩(wěn)定性等。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)低溫脂肪酶的研究工作剛剛展開(kāi)，其低溫脂肪酶菌林性能及適合工業(yè)化生產(chǎn)方法還沒(méi)有健全的技術(shù)體系。本發(fā)明提供了一種低溫脂肪酶、產(chǎn)生該酶的微生物菌種及生產(chǎn)該低溫脂肪酶的方法。所述的低溫脂肪酶與常溫脂肪酶、高溫脂肪酶比較，在較低的作用溫度下可發(fā)揮較高的酶解特性。本發(fā)明通過(guò)對(duì)新疆阿勒泰、富蘊(yùn)等典型高原低溫地區(qū)的環(huán)境土壤樣本進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選，獲得一批耐低溫微生物菌林，并從中分離篩選出低溫脂肪酶產(chǎn)生菌抹，編號(hào)為GL-l,從而提供了一抹低溫脂肪酶產(chǎn)生菌，其具有生產(chǎn)低溫脂肪酶的優(yōu)良特性，經(jīng);徵生物學(xué)分類與鑒定，屬于出芽絲孢酵母菌(7h'c/20^oraw/w〃w/a"s)。同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種低溫脂肪酶，通過(guò)利用本發(fā)明的菌抹經(jīng)過(guò)本發(fā)明確定的具體發(fā)酵工藝而獲得。本發(fā)明提供了一種低溫脂肪酶菌株，命名為GL-1，其能夠產(chǎn)生低溫脂肪酶。該菌抹已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國(guó)科學(xué)院;微生物研究所，郵編100080，保藏曰期是2006年4月11日，保藏號(hào)是CGMCC.No1674。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為出芽絲孢酵母(7Hc/ws/oraw/7"〃w/ara)。該菌林培養(yǎng)溫度5-25°C，最適培養(yǎng)溫度20。C左右；優(yōu)先生長(zhǎng)于MZPG-a取r培養(yǎng)基表面(麥芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂30g、蒸餾水1L)，經(jīng)20。C、24h培養(yǎng)，菌落呈白色、小米粒狀；培養(yǎng)48h后，菌落開(kāi)始為酵母樣薄膜生長(zhǎng)，隨后在中央出現(xiàn)細(xì)毛刺樣菌絲，后生成乳白色菌絲覆蓋，背面呈淡棕色；72h后菌落迅速增大，邊緣呈纖毛狀；細(xì)胞橢圓性，大小為(3~5)umx(5~9)um,芽殖；形成節(jié)孢子；參照《真菌鑒定手冊(cè)》等對(duì)GL-1菌林進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定，確定GL-1菌抹為絲孢酵母屬(Trichosporon)中的成員。依據(jù)微生物鑒定有關(guān)方法，對(duì)該菌株的生理生化特性及26SrDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，確定GL-1菌抹為絲孢酵母屬出芽絲孢酵母(7Hc/o^oro"/3w〃w/aws，T/w〃w/am1)。T/w〃w/am1GL畫(huà)1可產(chǎn)生寸氏5顯月旨肪酶，在pH38、溫度4-45。C范圍內(nèi)均有作用，其最適酶解條件為25~30°C、pH6.5。本發(fā)明進(jìn)一步建立菌種保藏、復(fù)壯及選育的系統(tǒng)工藝流程技術(shù)。本發(fā)明的低溫脂肪酶微生物菌種rGL-1，其生物學(xué)特性如表1所示表1低溫脂肪酶產(chǎn)生菌rpW/w/mwGL-1生理生化特性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>一+—本發(fā)明的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌7:pw/Zw/araGL-1，其'26SrDNA序列如下:1GTTTCAAGACGGGTCGTTTAAAGCCATTATGCCAGCATCCTAAGCACGGACGTGTCCGAA61GACCGACCTACAAGAGGCGTGCTGCGTTCCTCAGTCCCGGGCGATGTATTCGAAAGCGGG121CTATAACACATCCGAGGATGCCACATTCCCGCCAACCTTTTCCACCGCCCAAAACTGATG181CTGGCCTGCAAACCGAGAAGTACACCGGCAGAACCGGCTGAGTCTCGGAAAGCATGACTG241ACTTCAATCGTTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTGTTTAACTCTCTTTCCAAAGTGCT301TTTCATCTTTCCCTCACGGTACTTGTTCGCTATCGGTTTCTCGCCAATATTTAGCTTTAG361ATGGAATTTACCACCCATTTTGAGCTGCATTCCCAAACAACTCGACTCTTTGAGAGCGCA421TCACAAAGCACTGGAGATCTGTGTCAAGGACGGGATTCTCACCCTCTATGACGCCGTGTT481CCAACGGACTTGTACACAGGCCAGCACGGAAAACGCTTCTCTAGACTACAACTCGGACGA541TCTGAGACCGCCAGATTTTAAATTTGAGCTCATCCCGCTTCACTCGCCGTTACTAGGGGA601ATCCTTGGTAGTTTCTTTTCCTCCGCTTTTTT將GL-1的26SrDNA序列與Genebank中的同源序列進(jìn)行對(duì)比及進(jìn)化分析，GL-1的26SrDNA序列與73/^/w/"raAF189861同源性高達(dá)98°/0以ii上，且對(duì)其同源序列進(jìn)行進(jìn)化分析中，7:/w〃M/ara(AF189861)與GL-1分在同一分支，其進(jìn)化拓樸結(jié)構(gòu)如圖1所示。結(jié)合低溫脂肪酶產(chǎn)生菌GL-1的形態(tài)結(jié)構(gòu)特性及生理生化特性，確定其為絲孢酵母屬的出芽絲孢酵母(73戸〃wAms)GL國(guó)1。作本發(fā)明低溫脂肪酶的產(chǎn)生菌種，既可為本發(fā)明所保護(hù)的菌抹，也可為自然篩選的原始菌抹，或?yàn)楸Ｗo(hù)菌抹通過(guò)自然變異或人工誘導(dǎo)變異的變異菌抹，通過(guò)本發(fā)明所述的方法，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所闡述的技術(shù)效果。作為上述變異菌林的研制方法，包括物理誘變，如紫外線輻射處理、鈷60輻照處理、離子注入處理、激光輻照等各種射線處理；化學(xué)誘變，如亞硝基胍(ATG)、硫酸二乙酯等化學(xué)誘變劑處理，用常規(guī)脂肪酶產(chǎn)生菌分離篩選培養(yǎng)基及方法優(yōu)選出生產(chǎn)性能優(yōu)異的菌株。另外，也可通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，從原始菌抹或誘導(dǎo)變異菌種中獲取低溫脂肪酶基因，以原菌核微生物，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等、真核微生物，如酵母等，作為基因受體菌，構(gòu)建基因工程生產(chǎn)菌林，也可作為本發(fā)明的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌種。作為本發(fā)明的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌種rGL-1,可采用如下方法對(duì)其進(jìn)行保存、活化與篩選，及其搖瓶發(fā)酵獲得本發(fā)明的低溫果膠酶。本發(fā)明的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌rGL-1采用常規(guī)的斜面?zhèn)鞔４娣?，此方法是將本發(fā)明菌種接種于只要適合于酵母菌生長(zhǎng)的斜面培養(yǎng)基表面，15-25。C培養(yǎng)34天，再于4。C下低溫保藏，可存》文3個(gè)月左右，或是利用真空冷凍干燥法將本發(fā)明菌種制成干粉菌種，低溫或常溫保藏可達(dá)1年以上。長(zhǎng)期保藏的菌種在使用時(shí)按如下方法進(jìn)行活化、篩選。將長(zhǎng)期保藏的本發(fā)明菌種接種于M7尸G-agw培養(yǎng)基或其它適合于酵母菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基表面，1525。C培養(yǎng)3~4天；本發(fā)明優(yōu)先選用培養(yǎng)基，其MKPG-agw培養(yǎng)基成分如下麥芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂30g、蒸餾水1000mL。再將培養(yǎng)后的菌種接種于脂肪酶篩選培養(yǎng)基上，其篩選培養(yǎng)基如下(NH4)2SO40.1%、K2HPO40.1%、NaC10.05%、MgS04.7H200.05%、FeS04.7H200.001%、酵母膏0.5%、瓊月旨2.5%、每1OOmL培養(yǎng)基中加入12mL橄欖油乳化液(橄欖油:2%的聚乙烯醇(PVA)=1:3)和lmL0.05。/o羅丹明(及/w^7m/"e)B、pH自然。接種菌林經(jīng)20°C、2-3天培養(yǎng)，在紫外燈下菌落周?chē)尚纬擅黠@的熒光變色圈。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，產(chǎn)生熒光變色圈意味著菌4朱可產(chǎn)生脂肪酶，這是一種成熟的技術(shù)，在眾多外文及中文文獻(xiàn)中均有報(bào)道，本發(fā)明挑取變色圈與菌落直徑比最大的菌林作為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)菌林。、利用經(jīng)活化篩選出的本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)菌抹進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，獲得本發(fā)明的低溫脂肪酶。在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，可將斜面菌種直接接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，或是將菌種先進(jìn)行液體增殖培養(yǎng)，再以5%-15%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。作為培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)源，可廣泛使用通常用于培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)源。只要是可作為碳源同化的碳化合物或者是含有該碳化合物的，微生物菌種可利用的、適合于發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生菌本發(fā)明的低溫脂肪酶的碳源即可，例如，可使用淀粉、玉米粉、葡萄糖、麥芽汁、蔗糖、水解糖、可用的多糖等。其用量依據(jù)其它營(yíng)養(yǎng)源的選擇不同及培養(yǎng)條件的差異而有所不同，本發(fā)明中優(yōu)選葡萄糖為最優(yōu)碳源，其用量為0.5-1.0%。作為氮源，只要是可作為氮源同化的氮化合物或者是含有該氮化合物的即可，例如，可用銨鹽、硝酸鹽、大豆粉、肉類提取物、玉米浸漬液、玉米漿、酵母膏等。其氮源的選擇和用量，可依據(jù)其它營(yíng)養(yǎng)源的成分和用量的不同而不同，只要選合于本發(fā)明的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)及酶的產(chǎn)生即可。在本發(fā)明中優(yōu)選玉米漿、豆餅粉作為最佳的氮源，其用量均在0.5-2服作為無(wú)機(jī)鹽類，可適當(dāng)添加磷酸氫氨、磷酸二氫鉀等的磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、錳鹽等的鹽類。培養(yǎng)條件依培養(yǎng)基的組份多少而不同，但只要是適合于菌體培養(yǎng)產(chǎn)的、產(chǎn)生本發(fā)明中的脂肪酶的條件即可。作為產(chǎn)酶促進(jìn)劑，可適量添加7Vee"系的表面活性劑、5DS等，添加量適培養(yǎng)基的不同而定，只要適宜促進(jìn)培養(yǎng)過(guò)程產(chǎn)生本發(fā)明的果膠酶即可。通常，可選擇以下的條件進(jìn)行培養(yǎng)。即，培養(yǎng)溫度為10~25°C,最好為15-25""C的范圍；培養(yǎng)時(shí)間約為48小時(shí)，只要在本發(fā)明的低溫脂肪酶的生產(chǎn)量達(dá)到最高時(shí)結(jié)束培養(yǎng)即可；培養(yǎng)基的pH可在6~8的生產(chǎn)范圍，特別是在7左右更適于本發(fā)明的脂肪酶的生產(chǎn)。經(jīng)如上所述的培養(yǎng)，主要在菌體外(培養(yǎng)液中)產(chǎn)生目的產(chǎn)物的低溫脂肪酶。從如上所得的培養(yǎng)液中采集低溫脂肪酶，可按照通常用于采集細(xì)胞外酶的方法，如硫酸銨鹽析、超濾濃縮、冷凍干燥、色譜分離等，由分離、精制而進(jìn)行。>即，可由下述方法獲得本發(fā)明的低溫脂肪酶由過(guò)濾法或離心分離法從培養(yǎng)液中分離菌體及培養(yǎng)基固形物，得到上清液或?yàn)V液，對(duì)該些分離液進(jìn)行或不進(jìn)行濃縮，添加可溶性鹽類，^f吏酶沉淀的鹽析法；添加親水性的有機(jī)溶劑，使酶或夾雜物沉淀的有機(jī)溶劑沉淀法；使用離子交換樹(shù)脂等的吸附脫離法；凝膠過(guò)濾法；添加穩(wěn)定輔助劑或不添加穩(wěn)定輔助劑的噴霧干燥法；單獨(dú)或多個(gè)組合使用冷凍干燥法等的分離或精制方法。通過(guò)本發(fā)明如上的闡述，得到后面實(shí)施例進(jìn)一步的驗(yàn)證，得知本發(fā)明低溫脂肪酶的酶學(xué)特性。本發(fā)明菌抹GL-1產(chǎn)生的低溫脂肪酶最適酶解pH為6.5左右，在pH5~8范圍內(nèi)可保持較高的酶活性；在545。C范圍內(nèi)均有酶特性，其最適作用溫度在2530。C;該低溫脂肪酶具有較高的熱穩(wěn)定性，在30。C下保溫80分鐘，其酶活性仍可保持80%左右；金屬離子對(duì)低溫脂肪酶的活性具有一定的影響作用，其中K+對(duì)酶具有激活作用，Zn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、Fe^對(duì)其活性無(wú)顯著影響、Cu2+、Mr々對(duì)酶活性具有抑制作用。通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)本
發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果。本發(fā)明的出芽絲孢酵母菌(7h'c/2o^oraw/"http://"/朋>5)菌林及在微生物分類學(xué)上來(lái)說(shuō)與其同等的菌抹及其變異菌抹，可有效地用于產(chǎn)生本發(fā)明的低溫脂肪酶。再有，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，使用所述菌株的制造具有上述性質(zhì)的{氐溫脂肪酶的方法可有效i也產(chǎn)生所述的^f氐溫脂肪酶。附圖筒要說(shuō)明圖1所示為基于本發(fā)明的出芽絲孢酵母菌GL-1的26SrDNA序列的進(jìn)化分析拓樸結(jié)構(gòu)圖。圖2所示為以本發(fā)明的出芽絲孢酵母菌GL-1產(chǎn)生的低溫脂肪酶反應(yīng)pH和相對(duì)酶活性關(guān)系的圖。圖3所示為以本發(fā)明的出芽絲孢酵母菌GL-1產(chǎn)生的低溫脂肪酶反應(yīng)溫度和相對(duì)酶活性關(guān)系的圖。圖4所示為以本發(fā)明的出芽絲孢酵母菌GL-1產(chǎn)生的低溫脂肪酶在各溫度下處理殘余酶活性的圖。圖5所示為以本發(fā)明的出芽絲孢酵母菌GL-1產(chǎn)生的低溫脂肪酶在各反應(yīng)pH下處理殘余酶活性的圖。圖6所示為各種金屬離子對(duì)本發(fā)明的出芽絲孢酵母菌GL-1產(chǎn)生的低溫脂肪酶酶活性的影響作用。圖7所示為以p-硝基酚為標(biāo)準(zhǔn)品，OD值與p-硝基酚含量之間的關(guān)系。下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。另外，在下述的說(shuō)明中，如無(wú)特別說(shuō)明，則％皆指重量百分比。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:低溫脂肪酶產(chǎn)生菌(GL-1)的培養(yǎng)-I將本發(fā)明的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌GL-1接種于油脂同化平板培養(yǎng)基中，其中(NH4)2SO40.1%;K2HP04(U%;NaC10.05%;MgS04.7H200.05%;FeS04'7H200.001%;酵母膏0.5%;瓊脂2.5%;自然pH;取橄欖油與2。/。的聚乙烯醇(PVA)以1:3的比例混合，10000r/min攪拌乳化5min，0.8kg/cm2滅菌30min后取12ml加入到100ml上述培養(yǎng)基中。20。C左右培養(yǎng)5~7天，則在本發(fā)明低溫脂肪酶產(chǎn)生菌的菌落周?chē)尚纬赏该魅?。?shí)施例2:低溫脂肪酶產(chǎn)生菌(GL-l)的培養(yǎng)-II將羅丹明//zo^wm'"eB配成0.05%的母液，以1.0%的量加入到實(shí)施例l的油脂同化培養(yǎng)基中，配制成羅丹明i/zo^m/weB顯色培養(yǎng)基。將本發(fā)明的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌GL-1接種于上述培養(yǎng)基中，則在本發(fā)明低溫脂肪酶產(chǎn)生菌的菌落周?chē)鷷?huì)出現(xiàn)桔紅色的暈圈，在紫外燈下有紅色熒光圈。實(shí)施例3:低溫脂肪酶產(chǎn)生菌(GL-1菌林)的發(fā)酵培養(yǎng)將本發(fā)明的低溫脂肪酶產(chǎn)生菌接入麥芽汁液體種子培養(yǎng)基中，其中麥芽浸粉0.3;酵母膏0.3;蛋白胨0.5;葡萄糖1.0;1.0kg/cm2蒸汽滅菌15分鐘。20。C培養(yǎng)l2天后，以5%接種量接種于如下發(fā)酵培養(yǎng)基中。豆餅粉2.0，玉米漿2.0，葡萄糖1.0,K2HPO40.5，NaNO30.5，pH7.0，250ml三角瓶中，每瓶裝50ml，0.8kg/cm2蒸汽滅菌30分鐘。在20。C、200rpm下振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)后，離心分離去除菌體，得到低溫脂肪酶粗酶液，其發(fā)酵酶產(chǎn)量可達(dá)20U/mL。從如此所得的脂肪酶液中加入硫酸銨，使其飽和度達(dá)到60%，靜置沉淀，得到部分的沉淀物，再以通常的方法溶解脫鹽后，所得的低溫脂肪酶溶液酶活力可達(dá)130U/ml。實(shí)施例4:^氐溫脂肪醃活性的測(cè)量方法依據(jù)中溫(是否可去掉)脂肪酶有關(guān)的測(cè)定方法，釆用比色測(cè)定法進(jìn)行低溫脂肪酶活力的測(cè)定。以p-棕櫚酸硝基苯脂(yO-iV尸戶)為作用底物，以單位體積的單酶液在單位時(shí)間內(nèi)其酶解產(chǎn)物p-硝基酚(/-m7rap/^"o/)的生成量進(jìn)行酶活力的計(jì)算。其具體方法如下溶液A:90mgp-棕櫚酸硝基苯脂(/-A^尸)溶于30ml異丙醇中。溶液B:450mlpH7.5的磷酸緩沖液(0.067M)，并含有2g7H/oZ-100和0.5g阿拉伯膠。取2個(gè)試管，分別是對(duì)照管和樣品管。將兩試管中各加溶液B2.85ml及0.1ml底物溶液A(緩慢混合，新鮮配制而成，該溶液至少可穩(wěn)定2h),3(TC水浴保溫5min,然后在對(duì)照管中加入已滅活的酶液0.05ml，樣品管中加入酶液0.05ml，立即混勻計(jì)時(shí)，在水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10min后在兩管中力口3ml0.5mol/LNaOH溶液終止反應(yīng)。410nm分光光度計(jì)下測(cè)定酶催化產(chǎn)生的譜/的吸收值。酶活力計(jì)算以酶反應(yīng)液OD值處于0.3-3.0的測(cè)定值為基礎(chǔ)并計(jì)算酶活。脂肪酶1個(gè)單位的定義是在pH6.5,30。C條件下，每分鐘釋放lpmolp-硝基酚所需的酶量。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)以p-硝基酚為標(biāo)準(zhǔn)品，見(jiàn)圖7。測(cè)定酶活時(shí)應(yīng)對(duì)酶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，使OD值在0.2-0.8的線性范圍內(nèi)。酶活計(jì)算公式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>A—樣品酶活(U/ml)，A，一樣品酶液的吸光度OD值，A。""對(duì)應(yīng)酶液的空白吸光度OD值，K—對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，C。-對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，n—稀釋倍數(shù)，Vi—反應(yīng)液的體積/ml，V2—酶液的體積/ml,t—反應(yīng)時(shí)間/min。實(shí)施例5:作用pH對(duì)低溫脂肪酶酶活力的影響作用pH和最佳pH測(cè)定，以p-NPP為基質(zhì)，4要前述的活性測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定的pH分別為48范圍內(nèi)的不同的pH值。以測(cè)定酶活力最高的pH下酶活^直為對(duì)照，i殳定其相對(duì)酶活力為iq0%，則作用pH與酶活性的關(guān)系如圖2所示。本發(fā)明菌林GL-1產(chǎn)生的低溫脂肪酶在3(TC下其最適酶解pH為6.5,在pH58范圍內(nèi)可保持較高的酶活性。實(shí)施例6:作用溫度與低溫脂肪酶酶活力的關(guān)系作用溫度及最佳溫度測(cè)定，以p-NPP為基質(zhì)，與前述的活性測(cè)定方法相同，在540。C的范圍內(nèi)的不同的反應(yīng)溫度下進(jìn)行測(cè)試。以測(cè)定酶活力最高的溫度下的酶活力值為對(duì)照，設(shè)定其相對(duì)酶活力為100%，則反應(yīng)溫度和相對(duì)酶活性的關(guān)系如圖3所示。在545。C的溫度范圍內(nèi)，本發(fā)明菌抹GL-1產(chǎn)生的低溫脂肪酶均呈現(xiàn)酶活性，其最佳酶,溫度為25~3(TC之間。在1535。C的測(cè)定溫度范圍內(nèi)具有良好的酶學(xué)特性，在15。C下可保持80%左右的相對(duì)酶活力、10°C下仍可保持20%以上的相對(duì)酶活力。實(shí)施例7:低溫脂肪酶熱穩(wěn)定性將實(shí)施例3所得到的低溫脂肪酶粗酶液在3(TC、pH6.5下保溫，然后按上述酶活性測(cè)定方法每隔20分鐘對(duì)其殘余酶活力進(jìn)行測(cè)定。以未進(jìn)行j呆溫處理的酶活力值為對(duì)照，i殳定其相對(duì)酶活力為100%,則此時(shí)的處理溫度和殘余活性的關(guān)系如圖4所示。本發(fā)明菌株GL-1所產(chǎn)生的低溫脂肪酶在30°C以下具有較好的熱穩(wěn)定性，30。C保溫80分i中仍可保持80%左右的相對(duì)酶活力，具有較高的熱穩(wěn)定性。實(shí)施例8:低溫脂肪酶的pH穩(wěn)定性將實(shí)施例3所得到的低溫脂肪酶粗酶液按1:1的比例分別與pH2~11的緩沖液混合，在4。C下保溫12h，然后將酶液調(diào)回到最適作用pH值(pH6.5)，在30。C下測(cè)定殘余酶活。以pH6.5下的酶活力測(cè)定值為對(duì)照，設(shè)定其相對(duì)酶活力為100%,則此時(shí)的處理pH和殘余活性的關(guān)系如圖5所示。本發(fā)明菌林GL-1所產(chǎn)生的低溫脂肪酶在pH310的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。'實(shí)施例9:金屬離子對(duì)低溫脂肪酶酶活力的影響作用金屬離子對(duì)低溫脂肪酶的影響作用按上述酶活性測(cè)定法，在pH6.5的磷酸緩沖液中添加Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+，使其終濃度達(dá)到O.OIM。按上述測(cè)定方法對(duì)酶活性進(jìn)行測(cè)定。以未加入金屬離子的為對(duì)照，設(shè)定其相對(duì)酶活力為100%，則金屬離子對(duì)酶活力的影響作用如圖6所示。K+對(duì)本發(fā)明的低溫脂肪酶具有一定的激活作用，Cu2+、Mn2+對(duì)酶活性具有不同程度的抑制作用，其余金屬離子對(duì)低溫脂肪酶無(wú)明顯的激活或抑制作用。'權(quán)利要求1、一種具有產(chǎn)生低溫脂肪酶能力的出芽絲孢酵母菌(Trichosporonpullulans)CGMCC.No.1674。2、一種低溫脂肪酶的生產(chǎn)方法，其包括，A:對(duì)出芽絲孢酵母菌<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>CGMCC.No.1674進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)步驟；B:利用步驟A獲得的活化菌種進(jìn)行發(fā)酵步驟。3、如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，葡萄糖為最優(yōu)碳源，其用量為0.5-1.0%;優(yōu)選玉米漿、豆餅粉作為最佳的氮源，其用量均在O.5-2.0%。4、如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)步驟中，菌株培養(yǎng)溫度5-25。C,菌種接種于培養(yǎng)基表面，在15~25°C、pH6~8培養(yǎng)3~4天，再將培養(yǎng)后的菌種接種于脂肪酶篩選培養(yǎng)基上，接種量為5%-15%,接種菌抹經(jīng)2(TC、2-3天培養(yǎng)，在紫外燈下菌落周?chē)尚纬擅黠@的熒光變色圈。5、如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵中，最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度為15-25。C,最適pH為7。6、一種低溫脂肪酶，其利用權(quán)利要求1所述的出芽絲孢酵母菌<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>CGMCC.No.1674,由權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)方法制備而成。7、如權(quán)利要求6所述的低溫脂肪酶，其特征在于，該低溫脂肪酶在PH5~8、545。C范圍內(nèi)均有酶特性，其最適酶解溫度在2530。C，酶活達(dá)20U/mL-130U/ml并在15。C下可保持80%左右的相對(duì)酶活力、10。C下仍可保持20%以上的相對(duì)酶活力，在30。C以下具有較好的熱穩(wěn)定性，30。C保溫80分鐘仍可保持80%左右的相對(duì)酶活力，具有較高的熱穩(wěn)定性。8、如權(quán)利要求6所述的低溫脂肪酶，其特征在于，金屬離子對(duì)低溫果膠酶的活性有影響作用，其中r對(duì)具有激活作用、Cu2+、Mn'+對(duì)其酶學(xué)活性具有抑制作用。9、如權(quán)利要求7所述的低溫脂肪酶，其特征在于，最適酶解pH為6.5左右，最適作用溫度在2530。C。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)生低溫脂肪酶的出芽絲孢酵母(Trichosporonpullulans)和利用此菌株生產(chǎn)低溫脂肪酶的生產(chǎn)方法，同時(shí)還提供了低溫脂肪酶。通過(guò)利用出芽絲孢酵母(CGMCC.No.1674)，建立菌種保藏、復(fù)壯及選育的系統(tǒng)方法，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基配方優(yōu)化篩選及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制，確立了穩(wěn)定的發(fā)酵方法，生產(chǎn)的低溫脂肪酶具有良好的低溫活性、高酶活。可廣泛用于洗滌、食品加工、皮革加工、助消化劑、有機(jī)合成化工產(chǎn)品、香料、藥物制備、油脂加工等行業(yè)，并具有重要意義。文檔編號(hào)C12N9/20GK101130757SQ20061010657公開(kāi)日2008年2月27日申請(qǐng)日期2006年7月14日優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日發(fā)明者馮懷蓉,唐琦勇,張志東,軍茆,顧美英申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所